Summary
腎臓血管周囲間質細胞 (kPSCs) の消化酵素と NG2 細胞濃縮全臓器灌流に基づく新規臨床等級分離と培養法をご紹介します。この方法では、細胞療法の十分なセル番号を取得することが可能です。
Abstract
間葉系間質細胞 (MSCs) が恒常性や免疫調節細胞移植や腎臓疾患の有益な効果を示すです。血管周囲間質細胞 (Psc) は、骨髄 MSCs (bmMSCs) の特性を共有します。しかし、彼らも所有している、最も可能性の高いローカル刷り込み、組織固有のプロパティおよびローカル組織の恒常性の役割を果たすのため。ティッシュ特定修理、また、ヒトの腎臓内でこの組織の特異性があります。以前、ひと腎臓 Psc (kPSCs) が腎臓上皮創傷治癒の bmMSCs は、この可能性を持っていなかった一方を強化しました。さらに、kPSCs は、腎臓損傷の生体を改善できます。したがって、kPSCs は、細胞治療、特に腎臓病と腎移植のための興味深いソースを構成します。ここで腎動脈と血管マーカー NG2 の濃縮による消化酵素の全体臓器灌流に基づく人間の腎臓移植グレードから kPSCs の詳細な分離と培養法を示す.この方法では、細胞療法に適している大規模な細胞量を取得できます。
Introduction
間葉系間質細胞 (MSCs) は、もともと骨の髄から分離された免疫の調節細胞です。彼らは彼らの紡錘の形態、脂肪、骨、軟骨、およびプラスチックの付着に分化する能力を形によって特徴付けられます。MSCs は、間質マーカー CD73、CD90、マーカー CD31、CD451,2,3負ながら CD105 を表現します。MSCs は、彼らの組織の恒常性維持と免疫調節能力のための細胞療法の有望な候補です。bmMSCs は、腎臓病と腎移植4として他の場所を含むいくつかの疾患の臨床試験で現在検討中です。
以前血管周囲脂肪組織を含むいくつかの異なった固体器官から細胞、胎盤および骨格筋は MSCs9と特性を共有ことが示されました。しかし、これらの細胞はまた脊髄修復10になることができます組織固有の関数を表わします。ひと心筋血管周囲細胞低酸素後の血管新生反応の刺激など、一方、他の組織から分離した血管周囲細胞はこれらの電位11を表示されませんでした、心筋細胞に分化します。
血管周囲間質細胞は、マウス12,13,14ひと腎臓15,16から分離することができます。我々 の広範囲 kPSCs を特徴し、bmMSCs にこれらを比較します。KPSCs、bmMSCs と同様、免疫能力および血管叢形成をサポートすることができますがわかった。ただし、特定セル型では、腎の転写因子 HoxD10 および HoxD11 を含めて、脊髄転写式署名を示した kPSCs と違い組織があります。kPSCs、bmMSCs と対照をなして TGF-β 刺激後の myofibroblast 変換を受けていないと、脂肪細胞に分化することができませんでした。さらに、kPSCs は、腎尿細管上皮創傷スクラッチ アッセイ、bmMSCs と見られなかった現象で上皮の完全性を加速しました。この強化された傷修理だった肝細胞成長因子の遊離を介する。さらに、kPSCs は、急性腎傷害15マウス モデルにおける腎障害を改善しました。したがって、kPSCs は優れた腎修復能力を持っているようだ、腎臓病の細胞療法のための興味深い新しいソースです。
細胞療法目的で kPSCs を使用するために、kPSCs は臨床グレード酵素とプロトコル臨床グレードの方法で分離する必要があります。また、1 ドナーから kPSCs と数人の患者を治療することには、十分な細胞数を取得必要があります。ここで我々 は臨床細胞療法に使用する細胞の十分な数を降伏詳細、全体移植グレード腎臓から kPSCs の臨床グレードの隔離プロシージャに表示します。
Representative Results
臨床グレード kPSCs 分離法は、図 1のとおりです。原油の腎臓の細胞は、コラゲナーゼ灌流によって人間の移植グレード腎臓から分離されます。結果として得られる細胞懸濁液は 5% 血小板 lysates の合流まで培養しました。その後、血管周囲間質細胞画分は、NG2 式に基づいて分離されます。
kPSCs はプラスチック付着性紡錘形細胞 (図 2A)、CD31 CD34、CD45、HLA-DR (図 2B) 負ながら CD73、CD90, CD105、血管周囲間質マーカー マーカー NG2、試験 B、CD146、陽性です。通常、kPSCs の同質な人口は通路 4 に到達することができ、kPSCs に達する通路 9-10 (図 2C) 周りの老化。したがって、通路 5-8 間実験を実行する勧めします。
分離 kPSCs の機能を評価するため、以前示した kPSCs の馴化培地がこのスクラッチ法15の上皮の創傷治癒過程を加速することが、私たちに kPSCs のすべての新しいバッチに体外腎上皮創傷スクラッチ アッセイを実行します。KPSC 馴化培地 kPSCs alphaMEM 5% 血小板溶解液で 48 時間の培養、培養上清を収集させた。次に、不死化ヒト腎近位尿細管上皮細胞 (HK-2)17合流まで培養し、スクラッチ傷が行われます。どちらか kPSCs またはコントロール中の馴化培地は井戸に追加されます、創傷治癒の速度を測定します。KPSCs の馴化培地を追加すると、傷は格段に速くなります (図 2D) を閉じます。
図 1: 臨床等級分離法の人間 kPSCs.移植グレード腎臓を cannulated、腎動脈 (A G) を介してコラゲナーゼと灌流し結果細胞懸濁液を洗浄およびどちらかが凍結したまたは文化 (H ・ K) に入れます。セルに達する confluency (L) と、細胞濃縮は NG2 は (M) を実行しました。どちらかが合流、細胞がトリプシンが増殖または 3 D 構造が (N - P) を表示するときに停止しています。KPSCs のリリース条件は、不妊、マーカー式管状の上皮創傷治癒 (Q) を強化する機能を。矢印: 腎動脈。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:特性の人間 kPSCs。) KPSCs、紡錘形、プラスチックの付着性のセル。B) kPSCs は、間葉系マーカー CD73、CD90、CD105、血管マーカー、NG2、試験 β および CD146、CD31 CD34、CD45 陰性間の肯定的です。kPSCs エクスプレス MHC クラス (HLA-ABC) けどクラス II (HLA) ではありません。C) フローサイトメトリーから 3 つの異なる kPSC ドナーの生育特性 (通路 4) で同種の NG2 肯定的な集団を確認します。kPSCs に達する通路 9 10 周り老化。D) kPSCs が傷傷アッセイの腎臓上皮修復を強化することができます。制御媒体と t でエアコン kPSC 媒体の代表的な画像 = 0、4、8、12 h が表示されます。A スケール バー) = 200 μ m、D) = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
血管周囲細胞は多くの異なった人間固体器官、膵臓、脂肪、軟骨、腎臓9,,1516などから分離されています。ただし、ほとんどのメソッドは、組織を切除し、その後消化酵素で処理の小さなサンプルに基づいています。また、これは通常行われません臨床グレード製品。これにより、臨床グレード細胞の大量が必要これらの戦略を直接臨床翻訳には適して。
ここで臨床グレード酵素および物質による血液灌流に基づく全臓器の人間 kPSCs の新規分離法を示す.プロトコルは、現在臨床応用センター18使用中臨床ランゲルハンス島の隔離のプロトコルから適応。
これは、大量の kPSCs を実現できます最初の臨床グレード方法です。細胞収率の変動は主としてドナー依存です。しかし、我々 は現在 3 つの異なるドナー原油細胞懸濁液の一部から得る細胞収量を推定すると、理論的には、ドナーごと 1012 kPSCs x 2.7 の平均利回りが達成できます。MSC 療法は、通常、1 - 2 × 106セル/kg 本体重量42 細胞注入で構成されますとこれらの細胞の数はいくつかの患者の同種の治療のため十分です。
分離のプロシージャの 1 つの重要なステップは、コラゲナーゼの消化力の期間です。消化期間が短すぎると、文化が困難となる、組織の大きな塊保たれます。潅流期間が長すぎると、細胞死が増加を観察することがあります。したがって、腎臓ソフトになり、流体透過性が低下し始めると、すぐに腎臓を優しくマッサージする必要があります、コラゲナーゼ処理を停止する必要があります。
別の重要なステップは、NG2 細胞濃縮後、細胞の培養です。NG2 細胞濃縮後時々 血管周囲細胞は増殖や立体構造で成長を開始する開始されません。この場合ときに、細胞がトリプシンおよび再シード、細胞が単層培養による成長を開始通常。
出発材料として人間の移植グレード腎臓手術の理由主に破棄されたが使用されました。これらの主要な線維化なし機能器官です。我々 は、これは比較的まれな制限をする可能性がありますこれを認めるとオルガンのソースを取得するは難しい。Explanted 腎臓可能性があります別のソース;しかし、腎植の理由に応じてより多くの線維化およびこうして芽、これらの腎臓があります、したがってケアしなければならないので芽を分離、培養血管細胞ではなく可能性があります。
KPSCs が分離されたこのプロトコルを見ると腎臓上皮とオルガノ typic プロパティ創傷治癒能力15、腎臓疾患における kPSCs を用いた細胞治療、移植は今後の興味深いアプリケーションになります。このため、セル/セル製品出荷のいくつかの戦略があります。BmMSC の臨床試験で現在使われている、最初の戦略は、kPSCs の点滴です。別の興味深いアプリケーションは、kPSCs, 移植前に機械灌流 kPSC 排泄要因の使用です。このように、移植後改善された腎機能につながる可能性があるが explanted 腎臓の質を改善するかもしれない。両方の戦略 kPSCs 臨床目的のためさらに探索する興味深い新しいセル源であります。
Disclosures
機械知能系、D.G.L.、T.J.R. は、この研究に関する特許出願に関連付けられます。他の作家が何を開示するあります。
Acknowledgments
この研究資金を受けている欧州共同体の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) から付与契約番号 305436 の下恒星。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
