Summary
Qui presentiamo un metodo di isolamento e coltura di romanzo grado clinico per rene perivascolare di cellule stromali (kPSCs) basato sulla perfusione d'organo intero con gli enzimi digestivi e arricchimento NG2-cella. Con questo metodo, è possibile acquisire il numero di celle sufficiente per una terapia cellulare.
Abstract
Cellule stromali mesenchimali (MSCs) sono omeostatici e immuni modulatoria cellule del tessuto che hanno dimostrato gli effetti benefici nel trapianto e malattie renali. Le cellule Stromal perivascolari (PSC) condividono caratteristiche con midollo osseo MSCs (bmMSCs). Tuttavia, possiedono anche, molto probabilmente a causa di locali imprinting, proprietà di tessuto-specifici e giocare un ruolo nell'omeostasi del tessuto locale. Questa specificità tissutale può provocare riparazione specifico del tessuto, anche all'interno del rene umano. Precedentemente abbiamo indicato che gli sportelli unici di rene umano (kPSCs) sono migliorati arrotolata epiteliale renale mentre bmMSCs non ha avuto questo potenziale di guarigione. Inoltre, kPSCs può migliorare di lesioni renali in vivo. Pertanto, kPSCs costituiscono una fonte interessante per la terapia cellulare, in particolare per malattie del rene e trapianto renale. Qui vi mostriamo il metodo di isolamento e coltura dettagliato per kPSCs dal grado di trapianto di reni umani basati su tutto-organo aspersione di enzimi digestivi tramite l'arteria renale e un arricchimento per il marcatore perivascolare NG2. In questo modo, può essere ottenuto quantità di grandi cellule che sono adatti per la terapia cellulare.
Introduction
Cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule modulatore immuni che sono state originariamente isolate dal midollo osseo. Si distinguono per la loro morfologia, capacità di differenziarsi in grasso, osso e cartilagine e aderenza plastica fusiformi. MSCs esprimono i marcatori stromali CD73, CD90, CD105 pur essendo negativo per i marcatori CD31 e CD451,2,3. MSCs sono un candidato promettente per la terapia cellulare dovuto il loro tessuto omeostatico e capacità immunomodulatoria. bmMSCs sono attualmente allo studio in studi clinici per diverse malattie, tra cui malattie del rene e trapianto di rene come Recensito altrove4.
Precedentemente è stato dimostrato che cellule perivascolari da diversi organi solidi differenti, compreso il tessuto adiposo, placenta e muscolo scheletrico condividono caratteristiche con MSCs9. Tuttavia, queste cellule presentano anche funzioni di tessuto-specifici che possono provocare organotipiche riparazione10. Le cellule perivascolari del miocardio umano, ad esempio, ha stimolato risposte angiogeniche dopo ipossia e differenziano nei cardiomiociti, mentre cellule perivascolari isolate da altri tessuti non hanno mostrato questi potenziali11.
Cellule stromali perivascolare possono anche essere isolate dal mouse12,13,14 e rene umano15,16. Abbiamo ampiamente caratterizzata kPSCs e confrontato questi per bmMSCs. Abbiamo trovato che kPSCs, simile a bmMSCs, hanno capacità immunosoppressive e può supportare la formazione di plesso vascolare. Tuttavia, ci è tessuto specifiche differenze tra i tipi di cellule, come kPSCs ha mostrato una firma di espressione trascrizionale organotipiche, compresi i fattori di trascrizione nephrogenic HoxD10 e HoxD11. kPSCs, in contrasto con bmMSCs, non hanno subito la trasformazione dei miofibroblasti dopo stimolazione con TGF-β e sono stati in grado di differenziarsi in adipociti. Inoltre, kPSCs accelerato l'integrità epiteliale in un'analisi gratta e Vinci della ferita epiteliale tubolare renale, un fenomeno che non è stato osservato con bmMSCs. Questa ferita avanzata riparazione è stata mediata attraverso il rilascio di fattore di crescita dell'epatocita. Inoltre, kPSCs ha migliorato il danno renale in un modello murino di insufficienza renale acuta lesioni15. Pertanto, kPSCs sembrano avere la capacità di riparazione renale superiore e sono una fonte interessante di nuova per la terapia cellulare in patologie renali.
Per poter utilizzare kPSCs per scopi di terapia cellulare, kPSCs dovrebbe essere isolato in un modo di grado clinico con gli enzimi grado clinici e protocolli. Inoltre, per essere in grado di trattare parecchi pazienti con kPSCs da 1 donatore, sufficiente numeri di cell dovrebbero essere ottenuti. Qui vi mostriamo nel dettaglio, la procedura di isolamento clinico grado di kPSCs da reni di grado intero trapianto, producendo un numero sufficiente di cellule da utilizzare per cliniche di terapia cellulare.
Representative Results
Il metodo di isolamento kPSCs grado clinico è riassunto nella Figura 1. Cellule di rene di greggio sono isolate dal trapianto umano reni di grado tramite aspersione di collagenasi. La sospensione cellulare risultante è coltivata fino al confluente nel 5% delle piastrine lisati. Quindi la frazione di cellule stromali perivascolare è isolata basato sull'espressione di NG2.
kPSCs sono cellule fusiformi aderenti in plastica (Figura 2A) e sono positivi per gli indicatori di stromal marcatori CD73, CD90, CD105 e perivascolare NG2, PDGFR-B e CD146, mentre negativo per CD31, CD34, CD45 e HLA-DR (Figura 2B). In genere, una popolazione omogenea di kPSCs può essere raggiunto al passaggio 4 e kPSCs raggiungere senescenza intorno passaggio 9-10 (Figura 2C). Consigliamo quindi di eseguire esperimenti tra passaggio 5-8.
Per valutare la capacità funzionale del kPSCs isolato, eseguiamo un'analisi gratta e Vinci in vitro rene epiteliale ferita su ogni nuovo lotto di kPSCs, come abbiamo dimostrato in precedenza che il medium condizionato di kPSCs può accelerare la guarigione arrotolata epiteliale in questo dosaggio zero15. Il medium condizionato kPSC fatta di coltura kPSCs per 48 h in alphaMEM 5% della piastrina lisati e raccogliere il surnatante. Successivamente, il rene umano immortalato tubulo prossimale cellule epiteliali (HK-2)17 sono coltivate fino a confluenza e quindi viene effettuata una ferita gratta e Vinci. Quindi sia il medium condizionato di mezzo kPSCs o controllo viene aggiunto ai pozzetti e viene misurata la velocità di guarigione delle ferite. Quando viene aggiunto il medium condizionato di kPSCs, la ferita si chiude significativamente più veloce (Figura 2D).
Figura 1 : Grado clinico metodo di isolamento di umana kPSCs. Trapianto di reni di grado sono cannulati e irrorati con collagenasi via l'arteria renale (A - G) e la sospensione cellulare risultante viene lavata e sia crioconservato o messi in coltura (H - K). Dopo che le cellule raggiungono la confluenza (L), NG2 arricchimento delle cellule è effettuato (M). Le cellule vengono tripsinizzate quando entrambi sono confluenti, hanno smesso di proliferazione o quando strutture 3D appaiono (N - P). I criteri di rilascio per kPSCs sono sterilità, espressione del marcatore e la capacità di migliorare la guarigione arrotolata epiteliale tubolare (Q). Freccia: dell'arteria renale. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: kPSCs caratterizzazione dei diritti dell'uomo. Un) kPSCs sono fusiformi, plastica cellule aderenti. B) kPSCs sono positivi per gli indicatori mesenchymal CD73, CD90, CD105, perivascolare marcatori NG2, PDGFR-β e CD146, mentre negativo per CD31, CD34 e CD45. kPSCs express MHC di classe I (HLA-ABC) ma non di classe II (HLA-DR). C) caratteristiche di crescita di tre differenti kPSC donatori da citometria a flusso ha confermato popolazioni positivi NG2 omogenee (al passaggio 4). kPSCs raggiungere senescenza intorno passaggio 9-10. D) kPSCs sono in grado di esaltare il riparazione epiteliale renale in un'analisi di gratta e Vinci di ferita. Immagini rappresentative di controllo medio e medio kPSC condizionata a t = 0, 4, 8 e 12 h sono mostrati. Barra della scala nel A) = 200 µm, d) = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Cellule perivascolari sono state isolate da molti diversi organi solidi umani, tra cui pancreas, grasso, cartilagine e il rene9,15,16. Maggior parte dei metodi, tuttavia, sono basata su piccoli campioni di tessuto, che vengono sezionati e successivamente trattati con gli enzimi digestivi. Inoltre, questo solitamente non viene eseguito con prodotti grado clinico. Questo rende queste strategie meno adatto per traduzione clinica diretta dove sono necessarie grandi quantità di cellule di uso clinico.
Qui vi mostriamo un metodo di isolamento romanzo di kPSCs umana per organi interi basato su aspersione con enzimi di grado clinico e materiali. Il protocollo è adattato dal protocollo di isolamento clinico isolotti di Langerhans attualmente in uso per l'applicazione clinica nel nostro centro18.
Questo è il primo metodo di grado clinico in cui è possibile ottenere grandi quantità di kPSCs. La variabilità nel rendimento delle celle è in gran parte dipendente da donatore. Tuttavia, quando il rendimento delle celle che attualmente otteniamo da una frazione della sospensione delle cellule grezza di tre diversi donatori è estrapolato, in teoria, potrebbe conseguire un rendimento medio di 2,7 x 1012 kPSCs per donatore. Come terapia MSC è in genere costituito da 2 infusioni delle cellule con 1-2 x 106 cellule/kg corpo peso4, questi numeri di cellulare sono sufficienti per il trattamento allogenico di parecchi pazienti.
Un passaggio critico nella procedura di isolamento è la durata della digestione della collagenosi. Quando il periodo di digestione è troppo breve, grandi ciuffi di tessuto rimarrà, che sarà più difficile alla cultura. Quando il periodo di perfusione è troppo lungo, si può osservare aumentata delle cellule morte. Pertanto, non appena il rene inizia a diventare morbida e i fluidi meno trasparenti, il rene deve essere massaggiato delicatamente e il collagenosi trattamento deve essere interrotto.
Un altro punto critico è la cultura delle cellule dopo arricchimento cella NG2. A volte dopo l'arricchimento di cella NG2, le cellule perivascolari non iniziare a proliferare o iniziano a crescere in strutture 3D. In questo caso, quando le cellule vengono tripsinizzate e reinizializzate, le cellule di solito inizia a crescere in coltura dello strato monomolecolare.
Come materiale di partenza, trapianto umano reni di grado scartati principalmente per motivi chirurgici sono stati usati. Questi sono organi funzionali senza fibrosi principale. Riconosciamo che questo potrebbe essere una limitazione come questo è una malattia relativamente rara e difficile da ottenere organo sorgente. Reni espiantati potrebbero essere un'altra fonte; Tuttavia, a seconda del motivo dell'espianto di rene, questi reni potrebbero contenere più fibrosi e così myofibroblasts e pertanto si dovrebbe prestare attenzione poiché myofibroblasts potrebbe essere isolati e coltivati invece di cellule perivascolari.
Come il kPSCs isolato con questo spettacolo di protocollo organo-typic proprietà con rene epiteliale ferita guarigione capacità15, terapia cellulare con kPSCs in malattie del rene e trapianto sarebbe un'interessante applicazione futura. Per questo scopo, ci sono diverse strategie cellula/cellula della consegna del prodotto. La prima strategia è infusione IV di kPSCs, come attualmente utilizzati negli studi clinici bmMSC. Un'altra applicazione interessante è l'uso di kPSCs o fattori kPSC-escreto nell'aspersione di macchina prima di trapianto. In questo modo, la qualità del rene espiantato potrebbe migliorare che potrebbe portare ad una migliore funzionalità renale dopo trapianto. Per entrambe le strategie, i kPSCs sono un'interessante fonte cellulare nuovo di esplorare ulteriormente per scopi clinici.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., e T.J.R. sono associati con una domanda di brevetto per quanto riguarda questa ricerca. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca ha ricevuto un finanziamento dalla settimo programma Comunità europea quadro (FP7/2007-2013) sotto la concessione numero di contratto 305436 STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
