Summary
Burada böbrek Perivasküler Stromal bütün organ perfüzyon sindirim enzimleri ve NG2 hücreli zenginleştirme dayalı hücreleri (kPSCs) için bir roman klinik sınıf izolasyon ve kültür yöntem mevcut. Bu yöntemle, hücresel tedavi için yeterli hücre sayıları elde etmek mümkündür.
Abstract
Mezenkimal Stromal hücreler (MSCs) yararlı etkileri böbrek hastalıkları ve nakli göstermiştir doku homeostatik ve bağışıklık düzenleyici hücrelerdir. Perivasküler Stromal hücreler (PSC) kemik iliği MSCs (bmMSCs) ile ortak özelliklere sahiptir. Ancak, onlar da, büyük olasılıkla yerel sürecinden, doku özgü özellikleri ve yerel doku homeostazı bir rol oynar nedeniyle sahip. Bu doku özgüllük doku belirli tamir, insan böbreğe içinde de neden olabilir. Biz daha önce insan böbrek PSC'ler (kPSCs) bmMSCs bu potansiyelin yoktu Oysa şifa böbrek epitel yara gelişmiş gösterdi. Ayrıca, kPSCs böbrek yaralanma içinde vivoiyileştirmek. Bu nedenle, kPSCs hücre tedavisi, özellikle böbrek hastalıkları ve böbrek nakli için ilginç bir kaynak oluşturmaktadır. İşte bütün organ perfüzyon renal arter ve zenginleştirme Perivasküler işaretçi NG2 için üzerinden sindirim enzimleri, temel insan böbrek nakli-sınıftan kPSCs için detaylı yalıtım ve kültür yöntemi göstermektedir. Bu şekilde, büyük hücreli miktarları hücresel tedavi için uygun elde edilebilir.
Introduction
Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) kemik iliği aslında izole edildi immün düzenleyici hücrelerdir. Onlar onların iğ şeklinde Morfoloji, yağ, kemik ve kıkırdak ve plastik bağlılık ayırt etmek için yeteneği ile karakterizedir. MSCs stromal işaretleri CD73, CD90, işaretçileri CD31 ve CD451,2,3için negatif olurken CD105 hızlı. MSCs doku homeostatik ve immunomodulatory kapasiteleri nedeniyle hücre tedavisi için umut verici bir aday olduğunu. bmMSCs şu anda böbrek hastalıkları ve başka bir yerde4gözden olarak böbrek nakli dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için klinik çalışmalarda incelendiği.
Daha önce bu Perivasküler yağ dokusu da dahil olmak üzere birkaç farklı solid organ, hücreleri, plasenta ve iskelet kası özellikleri MSCs9ile paylaşan gösterilmiştir. Ancak, bu hücreler aynı zamanda organotypic onarım10neden olabilir doku özgü işlevleri sergi. İnsan miyokardiyal Perivasküler hücreleri, örneğin, hipoksi sonra anjiogenik yanıt teşvik ve diğer dokulardan izole Perivasküler hücreleri bu potansiyeller11belli etmedi ise cardiomyocytes farklı.
Perivasküler stromal hücreler de fare12,13,14 ve insan böbrek15,16ayrılmış olabilir. Yaygın olarak kPSCs ile karakterize olan ve bunları bmMSCs karşılaştırıldığında. KPSCs, bmMSCs için benzer immünsüpresif kapasitesine sahip ve vasküler pleksus oluşumu destekleyebilir bulduk. Ancak, doku hücre tipleri, HoxD10 ve HoxD11 nephrogenic transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere bir organotypic transkripsiyon ifadesi imzasını gösterdin kPSCs olarak arasında belirli farklar vardır. kPSCs, bmMSCs, aksine myofibroblast stimülasyon ile TGF-β sonra dönüşüme değil ve adiposit ayırt koyamadık. Ayrıca, kPSCs epitel bütünlük içinde bir böbrek borulu epitel yara karalama yöntemi, bmMSCs ile gözlenen değil bir fenomen hız. Bu gelişmiş yara onarım hepatosit büyüme faktörü yayın aracılı. Ayrıca, kPSCs böbrek yaralanma Akut böbrek yaralanma15, bir fare modeli iyileştirmiştir. Bu nedenle, kPSCs üstün böbrek onarım kapasitesine sahip görünmektedir ve böbrek hastalıklarında hücre tedavisi için ilginç bir yeni kaynak vardır.
Hücre tedavisi amacıyla kPSCs kullanabilmek için kPSCs klinik sınıf enzimler ve protokolleri ile klinik sınıf şekilde izole. Ayrıca, birkaç kPSCs 1 donör tedavisinde edebilmek için yeterli hücre sayıları alınmalıdır. İşte ayrıntılı, kPSCs gelen tüm organ nakli sınıf böbrekler, klinik sınıf izolasyon prosedürü yeterli sayıda klinik hücresel tedavi için kullanılmak üzere hücre verimli göstermektedir.
Representative Results
Klinik sınıf kPSCs yalıtım yöntemini şekil 1' de özetlenmiştir. Ham böbrek hücreleri insan nakli sınıf böbrekler collagenase perfüzyon tarafından izole edilmiştir. Elde edilen hücre süspansiyon %5 trombosit lysates birleşmesi kadar kültürlü. O zaman Perivasküler stromal hücre kesir NG2 ifadeye dayalı izole edilmiştir.
kPSCs plastik yapisan seklinde hücreler (Şekil 2A) ve negatif CD31, CD34, CD45 ve HLA-DR (Şekil 2B) için ise CD73, CD90, CD105 ve Perivasküler stromal işaretleri işaretleri NG2, PDGFR-B ve CD146, olumludur. Genellikle, kPSCs homojen bir nüfusa geçiş 4 ulaşılabilir ve kPSCs yaşlanma etrafında geçit 9-10 (Şekil 2C) ulaşır. Bu yüzden deneyler geçit 5-8 arasında gerçekleştirmek için tavsiye ederiz.
Biz daha önce kPSCs şartına orta bu karalama tahlil15dakika içinde epitel yara iyileşmesi hızlandırabilir gösterdiğim gibi izole kPSCs fonksiyonel kapasitesini değerlendirmek için bir vitro böbrek epitel yara karalama tahlil kPSCs, her yeni toplu gerçekleştiriyoruz. KPSC şartına orta kPSCs alphaMEM % 5 trombosit lysates 48 h için kültür ve süpernatant toplama yapılır. Ardından, ölümsüzleştirdi insan böbrek proksimal tübül epitel hücreleri (HK-2)17 birleşmesi kadar kültürlü ve sıfırdan bir yara daha sonra yapılır. O zaman ya kPSCs veya denetim orta şartına orta wells için eklenir ve yara iyileşme hızı ölçülür. KPSCs klimalı ortam eklendiğinde, yara önemli ölçüde daha hızlı (Şekil 2D) kapatır.
Resim 1 : Klinik sınıf izolasyon yöntemi, insan kPSCs. Organ nakli sınıf böbrek cannulated ve collagenase yolu ile renal arter (A - G) ile derin ve elde edilen hücre süspansiyon yıkanmış ve ya cryopreserved ya da kültür (H - K) koymak. Hücreleri confluency (L) ulaştıktan sonra hücre zenginleştirme olduğunu NG2 (M) gerçekleştirilen. Hücrelerin trypsinized ne zaman onlar are ikisinden biri Konfluent, Proliferasyona veya 3D yapılar (N - P) görüntülenirken durduruldu. KPSCs sürüm ölçütlerini kısırlık, işaretleyici ifade ve (Q) borulu epitel yara iyileşmesi geliştirmek için yeteneği vardır. Oku: renal arter. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: karakterizasyonu insan kPSCs. Bir) kPSCs seklinde, plastik yapışık hücreleri vardır. B) kPSCs Mezenkimal işaretleri CD73, CD90, CD105, Perivasküler işaretleri NG2, PDGFR-β ve CD146, negatif CD31, CD34 ve CD45 için süre için olumludur. kPSCs express MHC sınıf ı (HLA-ABC) ama değil sınıf II (HLA-DR). C) Akış Sitometresi üç farklı kPSC bağışçılardan büyüme özellikleri (Bölüm 4), homojen NG2 olumlu nüfus doğruladı. kPSCs yaşlanma etrafında geçit 9-10 ulaşmak. D) kPSCs böbrek epitel onarım bir yara karalama tahlil geliştirmek edebiliyoruz. Temsilcisi görüntüleri kontrol orta ve şartına kPSC orta t = 0, 4, 8 ve 12 h gösterilir. A ölçek çubuğu) = d 200 µm) 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Perivasküler hücreleri pankreas, yağ, kıkırdak ve böbrek9,15,16da dahil olmak üzere birçok farklı insan solid organ, izole edilmiştir. Pek çok yöntem, ancak, küçük parçalara ve daha sonra sindirim enzimleri ile tedavi doku örnekleri temel alır. Ayrıca, bu genellikle klinik sınıf ürünleri ile gerçekleştirilir. Bu bu stratejileri daha az doğrudan klinik çeviri için uygun klinik-grade hücrelerinin büyük miktarlarda gerekli nerede yapar.
İşte insan kPSCs bir roman yalıtım yöntemini perfüzyon klinik sınıf enzimler ve malzemelerle dayalı tüm organlar için göstermektedir. Bizim Merkezi18klinik uygulamada için kullanılmakta olan klinik adacıkları of Langerhans yalıtım protokolden adapte iletişim kuralıdır.
Bu ilk klinik sınıf yöntem nereye kPSCs büyük miktarlarda elde edilebilir. Değişkenlik hücre verim büyük ölçüde bağımlı verici. Ancak, ne zaman biz şu anda üç farklı bağış ham hücre süspansiyon bir kısmını elde hücre verim yaygınlaştırılması, teorik olarak, 2.7 x 1012 kPSCs donör başına ortalama bir verim elde edilebilir. MSC tedavisi genellikle 1-2 x 106 hücreler/kg vücut ağırlığı42 hücre infüzyon oluşur, bu hücre sayıları birden fazla hastada allojenik tedavisi için yeterli şunlardır.
Yalıtım yordamdaki bir kritik adım collagenase sindirim süresi kadardır. Sindirim süresi çok kısa olduğu durumlarda hangi kültür için daha zor olacak büyük kümeleri doku kalır. Perfüzyon dönem çok uzun olduğunda, artan hücre ölümü gözlenen. Bu nedenle, böbrek yumuşak ve sıvı daha az şeffaf olmaya başladığı anda böbrek hafifçe masaj ve collagenase tedavi kesilmelidir.
Başka bir önemli adım NG2 hücre zenginleştirme sonra hücrelerin kültürdür. NG2 hücre zenginleştirme bazen sonra Perivasküler hücreleri çoğalırlar veya 3D yapılar büyümeye başlar başlamaz. Bu durumda, hücreleri trypsinized ve reseeded olduğunda, hücreleri genellikle monolayer kültüründe büyümeye başlayacak.
Malzeme başlangıç olarak, esas olarak cerrahi nedenlerle atılan insan nakli sınıf böbrekler kullanılmıştır. Bu büyük fibroz olmadan fonksiyonel organları vardır. Bu nispeten nadir olduğu gibi bu bir sınırlama olabilir kabul ve organ kaynak elde etmek zor. Explanted böbrekler başka bir kaynağı olabilir; Ancak, bağlı olarak böbrek explantation nedeni, bu böbrekler daha fazla fibrozis ve böylece myofibroblasts içerebilir ve myofibroblasts izole ve Perivasküler hücreler yerine kültürlü olabilir bu yana bu nedenle özen gösterilmelidir.
KPSCs izole olarak bu protokolü göstermek ile organo-typic özellikleri böbrek epitel ile şifa kapasiteleri15, kPSCs böbrek hastalıklarında hücre tedavisi yara ve nakli ilginç bir gelecek uygulama olurdu. Bu amaçla, hücre/ürün teslimat birkaç stratejileri vardır. İlk strateji kPSCs, IV infüzyon şu anda bmMSC klinik çalışmalarda kullanılan gibidir. Başka bir ilginç uygulama kPSCs veya makine perfüzyon nakli önce kPSC atılır faktörler kullanımıdır. Bu şekilde, hangi sonra nakli için geliştirilmiş Böbrek fonksiyonlarının neden olabilir explanted böbrek kalitesini artırmak. Hem stratejileri için kPSCs daha fazla klinik amaçlar için keşfetmek için ilginç bir yeni hücre kaynağı vardır.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., ve T.J.R. bir patent başvurusu ile ilgili bu araştırma ile ilişkilidir. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Avrupa toplumun yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) fon hibe sözleşme numarası 305436 altında aldı STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
