Summary
Hier presenteren we een nieuwe klinische rang isolatie en cultuur methode voor nieren gerelateerde stromale cellen (kPSCs) op basis van hele orgel perfusie met spijsverteringsenzymen en NG2-cel verrijking. Met deze methode is het mogelijk om het verwerven van voldoende cel nummers voor cellulaire therapie.
Abstract
Mesenchymale stromale cellen (MSCs) zijn homeostatische en immuun f weefselcellen die hebben gunstige effecten aangetoond in nierziekten en -transplantatie. Gerelateerde stromale cellen (PSC) bepaalde karakteristieken gemeen met beenmerg MSCs (bmMSCs). Echter bezitten ze ook, waarschijnlijk als gevolg van lokale inprenting, weefsel-specifieke eigenschappen en spelen een rol in de homeostase van het lokale weefsel. De specificiteit van dit weefsel kan resulteren in specifieke reparatie van weefsel, ook binnen de menselijke nieren. Eerder toonden wij dat menselijke nieren PSC's (kPSCs) nier epitheliale wond genezing overwegende dat bmMSCs heb niet dit potentieel hebben versterkt. Bovendien kunnen kPSCs nier schade in vivoverzachten. KPSCs vormen dus een interessante bron voor celtherapie, met name voor nierziekten en niertransplantatie. Hier laten we de gedetailleerde isolatie en cultuur methode voor kPSCs van transplantatie-grade menselijke nieren gebaseerd op geheel-orgel perfusie van spijsverteringsenzymen via de renale slagader en een verrijking voor de gerelateerde marker NG2. Op deze manier kunnen grote cel hoeveelheden worden verkregen die geschikt voor cellulaire therapie zijn.
Introduction
Mesenchymale stromale cellen (MSCs) zijn f immuuncellen die oorspronkelijk geïsoleerd uit het beenmerg werden. Ze worden gekenmerkt door hun vorm van morfologie, mogelijkheid om te differentiëren in vet, been en kraakbeen en de naleving van de kunststof spindel. MSCs express de stromale markers CD73, CD90, CD105 terwijl negatief voor de markeringen CD31 en CD451,2,3. MSCs zijn een veelbelovende kandidaat voor celtherapie vanwege hun weefsel homeostatische en immunomodulerende capaciteiten. bmMSCs zijn momenteel bestudeerd wordt in klinische proeven voor verschillende ziekten, zoals nierziekten en niertransplantatie als herzien elders4.
Eerder werd aangetoond dat gerelateerde cellen van verscheidene verschillende solide organen, met inbegrip van vetweefsel, placenta en skeletspieren kenmerken met MSCs9delen. Deze cellen vertonen echter ook weefsel-specifieke functies die in organotypic reparatie10 resulteren kunnen. Menselijke myocardiale gerelateerde cellen, bijvoorbeeld, angiogenic reacties na hypoxie gestimuleerd en gedifferentieerde in cardiomyocytes, terwijl gerelateerde cellen geïsoleerd van andere weefsels bleek niet dat deze potentieel11.
Gerelateerde stromale cellen kunnen ook worden geïsoleerd van de muis12,13,14 en menselijke nieren15,16. Wij uitgebreid gekenmerkt kPSCs en ten opzichte van deze bmMSCs. We vonden dat kPSCs, vergelijkbaar met bmMSCs, hebben van immunosuppressieve capaciteiten en vasculaire plexus vorming kunnen ondersteunen. Echter, er zijn weefsel specifieke verschillen tussen de celtypes, als kPSCs toonden een organotypic transcriptionele expressie handtekening, met inbegrip van de nefrogene transcriptiefactoren, HoxD10 en HoxD11. kPSCs, in tegenstelling tot bmMSCs, niet myofibroblast transformatie na stimulatie met TGF-β ondergaan en waren niet in staat om te differentiëren in adipocytes. Bovendien versneld kPSCs epitheliale integriteit in een nier buisvormige epitheliale wond kras assay, een verschijnsel dat niet met bmMSCs werd waargenomen. Deze verbeterde wond reparatie was gemedieerde via hepatocyte groeifactor vrijmaking. Bovendien verbeterd kPSCs nier schade in een muismodel van acute nier schade15. Daarom kPSCs lijken te hebben van de superieure renale reparatie capaciteiten en een interessante nieuwe bron voor celtherapie in nierziekten.
Om te kunnen kPSCs voor cel therapie doeleinden gebruiken, moeten kPSCs worden afgezonderd in een klinische rang wijze met klinische rang enzymen en protocollen. Bovendien, om te kunnen behandelen verschillende patiënten met kPSCs van 1 donor, voldoende cel nummers moeten worden verkregen. Hier laten we in detail, de klinische rang isolatie procedure van kPSCs van hele transplantatie rang nieren, levert voldoende aantallen cellen worden gebruikt voor klinische cellulaire therapie.
Representative Results
De klinische rang kPSCs isolatie methode is samengevat in Figuur 1. Ruwe nier cellen zijn geïsoleerd van de transplantatie van menselijke rang nieren door collagenase perfusie. De resulterende celsuspensie is gekweekt tot heuvels in 5% bloedplaatjes lysates. Vervolgens is de gerelateerde stromale cellen breuk geïsoleerd gebaseerd op NG2 expressie.
kPSCs kunststof aanhangend spindel-vormig cellen(Figuur 2)en zijn positief voor de stromale markeringen CD90, CD105, CD73 en gerelateerde markers NG2, PDGFR-B en CD146, terwijl negatief voor CD31, CD34, CD45 en HLA-DR (Figuur 2B). Meestal een homogene populatie van kPSCs kan worden bereikt bij passage 4 en kPSCs bereiken senescentie rond passage 9-10 (Figuur 2C). Wij adviseren dan ook om uit te voeren van de experimenten tussen passage 5-8.
Om te beoordelen van de functionele capaciteit van de geïsoleerde kPSCs, voeren wij een in vitro nier epitheliale wond kras assay op elke nieuwe partij van kPSCs, zoals we eerder liet zien dat het geconditioneerde medium van kPSCs kan versnellen epitheliale wondgenezing in deze kras assay15. Het kPSC geconditioneerde medium is gemaakt door kweken van kPSCs voor 48 uur in alphaMEM 5% bloedplaatjes lysates en het verzamelen van de bovendrijvende substantie. Vervolgens de vereeuwigd menselijke nieren proximale zaadvormende epitheliale cellen (HK-2)17 tot heuvels worden gekweekt en vervolgens een kras wond wordt gemaakt. Vervolgens ofwel het geconditioneerde medium van kPSCs of besturingselement medium wordt toegevoegd aan de putten en de snelheid van de wondgenezing wordt gemeten. Wanneer de geconditioneerde medium van kPSCs wordt toegevoegd, wordt de wond gesloten aanzienlijk sneller (Figuur 2D).
Figuur 1 : Klinische Grade isolatie methode van de menselijke kPSCs. Transplantatie rang nieren worden gecanuleerd en geperfundeerd met collagenase via de renale slagader (A - G) en de resulterende celsuspensie wordt gewassen en ofwel cryopreserved of cultuur (H - K) gestoken. Nadat de cellen bereiken confluentie (L), NG2 cel verrijking is uitgevoerd (M). Cellen zijn trypsinized wanneer ze ofwel confluente, prolifererende of wanneer 3D-structuren weergegeven (N - P) hebt gestopt. De release-criteria voor kPSCs zijn steriliteit, marker expressie en de mogelijkheid om buizen epitheliale wondgenezing (Q). Pijl: renale slagader. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: karakterisering van menselijke kPSCs. Een) kPSCs zijn spindel-vormig, plastic Adherente cellen. B) kPSCs zijn positief voor mesenchymale markeringen CD73, CD90, CD105, gerelateerde markeringen NG2, PDGFR-β en CD146, terwijl negatieve voor CD31, CD34 en CD45. kPSCs express MHC-klasse ik (HLA-ABC) maar niet klasse II (HLA-DR). C) kenmerken van de groei van drie verschillende kPSC donoren van stroom cytometry bevestigd homogene NG2 positieve risicopopulaties (doorgang 4). kPSCs bereiken senescentie rond passage 9-10. D) kPSCs zijn in staat om de epitheliale reparatie nier in een wond kras assay. Representatieve beelden van controle medium en kPSC geconditioneerd medium bij t = 0, 4, 8 en 12 h staan. De bar van de schaal van A) = 200 µm, in D) = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Gerelateerde cellen werden geïsoleerd van vele verschillende menselijke solide organen, met inbegrip van de nier9,15,16, alvleesklier, vet en kraakbeen. De meeste methoden, zijn echter gebaseerd op kleine monsters van weefsel, dat zijn ontleed en daarna behandeld met spijsverteringsenzymen. Bovendien, dit is meestal niet uitgevoerd met klinische grade producten. Dit maakt deze strategieën minder geschikt voor directe klinische vertaling indien grote hoeveelheden van klinische-grade cellen noodzakelijk zijn.
Hier laten we een methode van de roman isolatie van menselijke kPSCs voor hele organen gebaseerd op perfusie met klinische rang enzymen en materialen. Het protocol is aangepast van het protocol van de isolatie van klinische eilandjes van Langerhans die momenteel in gebruik voor klinische toepassing in onze center-18.
Dit is de eerste klinische rang methode indien grote hoeveelheden van kPSCs kunnen worden bereikt. De variabiliteit in cel opbrengst is grotendeels donor afhankelijk. Echter, wanneer het rendement van de cel dat we momenteel van een fractie van de ruwe celsuspensie van drie verschillende donoren verkrijgen is geëxtrapoleerd, in theorie, een gemiddelde opbrengst van 2,7 x 1012 kPSCs per donor kan worden bereikt. Zoals MSC therapie meestal uit 2 cel infusies met 1-2 x 106 cellen/kg lichaam gewicht4 bestaat, wordt deze cel nummers volstaan voor allogene behandeling van verschillende patiënten.
Een cruciale stap in de isolatie-procedure is de duur van collagenase spijsvertering. Wanneer de spijsvertering-periode te kort is, blijft grote bosjes van weefsel, die moeilijker te cultuur zal worden. Wanneer de perfusie-periode lang is, kan toegenomen celdood worden waargenomen. Daarom, zodra de nier begint te zacht en het vocht minder transparant worden, de nier voorzichtig moet worden gemasseerd en de collagenase behandeling moet worden gestopt.
Een andere belangrijke stap is de cultuur van de cellen na NG2 cel verrijking. Soms na de NG2 cel verrijking start de gerelateerde cellen niet beginnen te groeien in 3D structuren te vermenigvuldigen. In dit geval, wanneer de cellen trypsinized en reseeded, zal de cellen meestal beginnen te groeien in enkelgelaagde cultuur.
Als grondstof, werden menselijk transplantatie rang nieren verwijderd voornamelijk omwille van de chirurgische gebruikt. Dit zijn de functionele organen zonder grote fibrose. Wij erkennen dat dit een beperking zou kunnen zijn, aangezien dit een relatief zeldzame is en moeilijk te verkrijgen van orgel bron. Transplanteren nieren zou kunnen zijn een andere bron; echter, afhankelijk van de reden van uitname van de nieren, deze nieren bevatten meer fibrose en dus myofibroblasts, en daarom moet worden gezorgd aangezien myofibroblasts zou kunnen worden geïsoleerd en in plaats van gerelateerde cellen gekweekt.
Zoals de kPSCs geïsoleerd met deze show protocol organo-typisch eigenschappen met nier epitheliale wond genezing capaciteiten15, celtherapie met kPSCs in nierziekten en transplantatie zou een interessante toekomstige toepassing. Voor dit doel zijn er verschillende strategieën van cel/levering van het product. De eerste strategie is IV infusie van kPSCs, zoals gebruikt op dit moment in de klinische studies van bmMSC. Een andere interessante toepassing is het gebruik van kPSCs of kPSC-uitgescheiden factoren in machine perfusie voor transplantatie. Op deze manier kan de kwaliteit van de transplanteren nieren verbeteren kan leiden tot een verbeterde nierfunctie na de transplantatie. Voor beide strategieën zijn kPSCs een interessante bron voor nieuwe cel verder te verkennen voor klinische doeleinden.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., en T.J.R. zijn geassocieerd met een octrooi-aanvraag met betrekking tot dit onderzoek. De andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek heeft financiering ontvangen van de Europese Gemeenschap zevende kader programma (KP7/2007-2013) onder overeenkomstnummer 305436 subsidie STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
