Summary
Здесь мы представляем Роман клинических класс изоляции и культуры метод для почек периваскулярной стромальные клетки (kPSCs), основанный на весь орган перфузии с пищеварительные ферменты и обогащения NG2-клеток. С помощью этого метода можно получить достаточного числа клеток для клеточной терапии.
Abstract
Мезенхимальные стромальные клетки (Майкрософт) (MSCs) являются ткани гомеостатических иммунной и модулирующее клетки, которые показали благотворное воздействие при заболеваниях почек и пересадки. Периваскулярной стромальные клетки (Чок) имеют характеристики с костного MSCs (bmMSCs). Однако они также обладают, скорее из-за местных импринтинг, ткани специфические свойства и играть определенную роль в местных тканей гомеостаза. Эта специфика ткани может привести к конкретным репарации тканей, также в нарушениях функции почек. Ранее мы показали, что человеческая почка Чок (kPSCs) расширили почек эпителиальных заживления в то время как bmMSCs не имеет этот потенциал. Кроме того kPSCs может улучшить почек травмы в естественных условиях. Таким образом kPSCs представляют собой интересный источник для клеточной терапии, особенно для болезней почек и пересадки почки. Здесь мы покажем подробный метод изоляции и культуры в kPSCs от пересадки класса человека почки, основанные на целом орган перфузии пищеварительных ферментов через почечной артерии и обогащения для маркера периваскулярной NG2. Таким образом можно получить крупноклеточный количеств, которые подходят для клеточной терапии.
Introduction
Мезенхимальных стромальных клеток (МСК), модулирующее клетки иммунной системы, которые были первоначально выделены из костного мозга. Они характеризуются их шпинделя форме морфологии, способности дифференцироваться в жир, кости и хряща и пластиковые присоединения. MSCs Экспресс стромальные маркеры CD73, CD90, CD105 во время негативные для маркеров CD31 и CD451,2,3. MSCs являются перспективным кандидатом на клеточной терапии из-за их ткани гомеостаза и иммуномодулирующим потенциала. bmMSCs в настоящее время изучаются в клинических испытаниях для ряда заболеваний, включая заболевания почек и пересадки почки как обзор других4.
Ранее было показано, что периваскулярной клетки от нескольких различных твердых органов, включая жировой ткани, плаценты и скелетных мышц разделяют характеристик с MSCs9. Однако эти клетки также демонстрируют Ткани специальные функции, которые могут привести к organotypic ремонт10. Клетки человека миокарда периваскулярной, например, стимулировали ангиогенных ответы после гипоксии и дифференцированной в кардиомиоцитов, в то время как периваскулярной клетки изолированы от других тканей не показывать эти потенциалы11.
Периваскулярной стромальные клетки также могут быть изолированы от мыши12,13,14 и нарушениями функции почек15,16. Мы широко характеризуется kPSCs и сравнить их в bmMSCs. Мы обнаружили, что kPSCs, похож на bmMSCs, иммунодепрессивные потенциал и может поддерживать формирование сосудистого сплетения. Однако есть ткани конкретные различия между типами клеток, как показали organotypic transcriptional выражение подписи, включая нефрогенной транскрипционных факторов, HoxD10 и HoxD11 kPSCs. kPSCs, в отличие от bmMSCs, не проходят Миофибробласт трансформации после стимуляции с TGF-β и были способны дифференцироваться в адипоцитов. Кроме того kPSCs ускоренного эпителиальных целостности в почки трубчатых эпителиальных рану скретч assay, явление, которое не наблюдалось с bmMSCs. Это расширение рану ремонт был опосредуется через релиз фактора роста гепатоцитов. Кроме того kPSCs смягчены травмы почек в мышиной модели острой почечной травмы15. Поэтому kPSCs кажется, Улучшенный почечной ремонт потенциала и интересный новый источник для клеточной терапии при заболеваниях почек.
Для того, чтобы иметь возможность использовать kPSCs для целей терапии клеток, kPSCs должен быть изолирован на основе клинических класс с клинической класс ферментов и протоколы. Кроме того чтобы иметь возможность лечить несколько пациентов с kPSCs от 1 донора, должно быть получено достаточное число клеток. Здесь мы покажем в деталях, клинические класса изоляции процедура kPSCs от всего трансплантации почки класс, давая достаточное количество клеток для клинического клеточной терапии.
Representative Results
Метод изоляции kPSCs клинические класса приводится на рисунке 1. Сырой почечных клеток изолированы от человеческого трансплантации почки класс, коллагеназа перфузии. Результате суспензию клеток культивируемых до притока в 5% тромбоцитов лизатов. А затем периваскулярной стромальные клетки фракции изолированных на основе NG2 выражения.
kPSCs пластиковые адэрентных веретеновидной формы клетки (рисA) и являются положительными стромальные маркеры CD73, CD90, CD105 и периваскулярной маркеров NG2, PDGFR-B и CD146, при отрицательной CD31, CD34, CD45 и HLA-DR (рис. 2B). Как правило однородное население kPSCs можно добраться на проход 4 и kPSCs достигают старение вокруг проход 9-10 (рис. 2C). Поэтому мы рекомендуем выполнять эксперименты между прохождения 5-8.
Для оценки функциональных возможностей изолированных kPSCs, мы выполняем в vitro почек эпителиальных раны скретч assay на каждый новый пакет kPSCs, как мы ранее показал, что обусловлено среднего kPSCs может ускорить эпителиальных заживления ран в этой скретч пробирного15. ССКП кондиционером среднего производится выращивание kPSCs за 48 ч в alphaMEM 5% тромбоцитов лизатов и собирая супернатант. Далее увековечен человеческая почка проксимальных канальцах эпителиальных клеток (HK-2)17 культивируемых до притока и затем производится скретч рану. Затем либо кондиционером среднего kPSCs или управления среды добавляется к скважинам и измеряется скорость заживления ран. При добавлении кондиционером среднего kPSCs, рана закрывает значительно быстрее (Рисунок 2D).
Рисунок 1 : Клинические изоляции класса метод человеческого kPSCs. Трансплантации почки класса являются канюлированной увлажненную с коллагеназы через почечной артерии (A - G) и промывают результате суспензию клеток и либо криоконсервированных или введены в культуру (H - K). После того, как клетки достигают confluency (L), NG2 обогащение клеток исполнил (M). Клетки trypsinized, когда они либо вырожденная, перестали пролиферирующих или когда 3D структуры появляются (N - P). Критерии выпуска для kPSCs являются стерильности, маркер выражения и возможность повышения трубчатых эпителиальных заживление ран (Q). Стрелка: почечной артерии. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Характеристика человека kPSCs. ) KPSCs являются веретеновидной формы, пластиковые адэрентных клеток. KPSCs B) являются позитивными для мезенхимальных маркеры CD73, CD90, CD105, периваскулярной маркеры NG2, PDGFR-β и CD146, при отрицательной CD31, CD34 и CD45. kPSCs Экспресс MHC-класса я (HLA-ABC), но не класс II (HLA-DR). C) роста характеристик трех различных ССКП доноров из проточной цитометрии подтвердил однородной NG2 позитивные населения (на прохождение 4). kPSCs достичь старение вокруг проход 9-10. KPSCs D) имеют возможность повышения эпителиальных ремонт почек в рану скретч assay. Представитель изображения управления среднего и среднего ССКП кондиционером при t = 0, 4, 8 и 12 h показываются. Линейки в A) = 200 мкм, в D) = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Периваскулярной клетки были изолированы от многих различных человека твердых органов, включая поджелудочной железы, жира, хряща и почек9,,1516. Большинство методов, однако, основаны на небольшие образцы ткани, которые анализировали и потом лечили пищеварительные ферменты. Кроме того это обычно не выполняется с клинической класс продуктов. Это делает эти стратегии менее подходит для прямого клинический перевод которых необходимо большое количество клинических класса клеток.
Здесь мы покажем Роман изоляции метод человеческого kPSCs для целых органов, основанные на перфузии с клинической класс ферментов и материалами. Протокол приспособлен от изоляции протокол клинических островков Лангерганса в настоящее время для клинического применения в нашем центре18.
Это первый метод клинического класса, где может быть достигнуто большое количество kPSCs. Изменчивость в ячейке урожайности является во многом зависит от доноров. Однако когда экстраполируется доходность клетки, которые мы в настоящее время получить от фракции сырой клеток подвеска трех различных доноров, в теории, средняя урожайность 2.7 x 10-12 kPSCs за доноров может быть достигнуто. Как MSC терапии обычно состоит из 2 клетки инфузии с 1-2 х 106 клеток/кг веса тела4, эти числа клеток являются достаточными для аллогенной лечения нескольких больных.
Один важный шаг в процедуре изоляции является продолжительность коллагеназы пищеварение. Когда задан слишком короткий период пищеварения, останется большие clumps из ткани, которая будет труднее культуры. Когда период перфузии является слишком долго, может наблюдаться увеличение клеточной гибели. Поэтому как только почка начинает становиться мягкой и менее прозрачной жидкости, функции почек следует осторожно массируют и коллагеназы лечение должно быть прекращено.
Другим важным шагом является культура клеток после обогащения клеток NG2. Иногда после обогащения клеток NG2 периваскулярной клетки не начинают размножаться или начинают расти в трехмерных структур. В этом случае когда клетки trypsinized и заполнения, клетки обычно начинают расти в монослойном культивировании.
Как исходный материал, были использованы человека трансплантации почки класс отбрасываются главным образом для хирургического. Это функциональных органов без крупных фиброз. Мы признаем, что это может быть ограничение, как это случается относительно редко и трудно получить орган источник. Описаны функции почек может быть еще одним источником; Однако в зависимости от причины эксплантация почек, эти почки может содержать больше фиброз и таким образом миофибробласты, и поэтому следует проявлять осторожность, поскольку миофибробласты могут быть изолированы и культивировали вместо периваскулярной клетки.
Как изолированные kPSCs с этим протоколом шоу органо Инт свойства с почкой эпителиальных раны исцеление потенциала15, клеточной терапии с kPSCs при заболеваниях почек и пересадки будет интересное будущее применение. Для этой цели существует несколько стратегий клеток/доставки продукции. Первая стратегия является IV вливания kPSCs, как в настоящее время используется в клинических исследованиях показано. Еще одна интересная приложения является использование kPSCs или экскретируется ССКП факторы перфузии машины до пересадки. Таким образом может улучшить качество explanted почки, которые могут привести к улучшению почки после пересадки. Для обеих стратегий kPSCs являются интересный новый источник клеток для дальнейшего изучения клинических целей.
Disclosures
D.G.L., M.A.E., и T.J.R. связаны с патентной заявки относительно этого исследования. Другие авторы имеют ничего не разглашать.
Acknowledgments
Это исследование получил финансирование от Европейского сообщества, седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) под Грант номер договора 305436 STELLAR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baxter bags | Fenwal | R4R-7004 | |
| Human platelets | Sanquin | hospital surplus material expired for less than 2 d is used | |
| platelet lysate | custom made | ||
| Disposable sterile bottles | Corning | 09-761-11 | |
| 500 mL PP centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| a-MEM medium | Lonza | BE12-169F | |
| glutamax | thermo fisher | 35050038 | |
| pen/strep | Invitrogen | 15070063 | |
| transfusion system | Codan | 455609 | |
| DMEM-F12 | life technologies | 11320-074 | |
| Normal Human Serum (NHS) | Sanquin | ||
| Hepes 1 M | Lonza | BE-17-737E | |
| NaHCO3 7.5% | Lonza | BE17-613E | |
| CaCl2 1 M | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| UW | Bridge to life | 32911 | |
| Heparin | Leo Pharma | ||
| collagenase NB1 GMP grade | SERVA | 17455.03 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ml | |
| surgical drapes | 3M Nederland | DH999969404 | |
| perfusion pump | metrohm | x007528300 | |
| pump head | metrohm | x077202600 | |
| perfusion tray | custom made | ||
| LS25 masterflex tubes | Masterflex | HV-96410-25 | |
| accessory spike | Gambro DASCO | 6038020 | |
| pulmozyme | Roche | ||
| culture flasks 25 cm2 | greiner | 690175 | |
| culture flask 75 cm2 | greiner | 658170 | |
| culture flask 175 cm2 | greiner | 661160 | |
| Trypsin | sigma | t4174 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500g | |
| FcR blocking reagent | miltenyi | 130-059-901 | |
| anti melanoma beads (NG2) | miltenyi | 130-090-452 | |
| cell strainer 70 µm | Corning | 352350 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS magnet | miltenyi | 130-090-976 | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | |
| CD45 APC | BD | 555485 | |
| CD146 PE | BD | 550315 | |
| NG2 APC | R&D | FAB2585A | |
| CD90 PE | BD | 555596 | |
| HLA ABC APC | BD | 555555 | |
| CD105 FITC | Ancell | 326-040 | |
| HLA DR APC | BD | 559866 | |
| CD56 PE | BD | 555516 | |
| CD73 PE | BD | 550257 | |
| CD31 FITC | BD | 555445 | |
| CD133 PE | miltenyi | 130-090-853 | |
| PDGF-r | R&D | mab 1263 | |
| mouse IgG1 FITC | BD | 345815 | |
| mouse IgG1 PE | BD | 345816 | |
| mouse IgG1 APC | BD | 345818 | |
| IgG2b PE | BD | 555743 | |
| goat anti mouse PE | Dako | R0480 | |
| sodium azide | Merck | 822335 | |
| DMEM Ham’s F12 | Gibco | 31331-028 | |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Sigma | I1884 | |
| hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
| triiodothyrinine | Sigma | T5516 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | sigma | E9644 | |
| Immortalized human renal PTEC (HK2) | courtesey of M. Ryan, university college Dublin |
References
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
- Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
- Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
- Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
- Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
- Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
- Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
- Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
- Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
- Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).
