Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تنقية المقصورة غشاء للتدهور المرتبطة هيولى المستضدات خارجية المنشأ في العرض التقديمي عبر

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

Summary

الأسلوب الموصوفة هنا هو بروتوكول عزلة حويصلة جديدة، مما يسمح لتنقية المقصورات الخلوية حيث تتم معالجة المستضدات خارجية المنشأ بتدهور هيولى المرتبطة في العرض التقديمي عبر.

Abstract

الخلايا الجذعية (DCs) قادرون على درجة عالية من تجهيز وتقديم المستضدات خارجية المنشأ المدخلة على الفئة الرئيسية هيستوكومباتيبيليتي (MHC) أنا جزيئات تعرف أيضا باسم الصليب-العرض التقديمي (CP). CP يلعب دوراً هاما ليس فقط في تحفيز السذاجة CD8+ تي الخلايا وذاكرة CD8+ تي الخلايا للمعدية وحصانة الورم بل أيضا في المنظمة سيلفاكتينج الخلايا السذاجة تي استعطال خلية T أو حذف خلايا T. على الرغم من أن الآلية الجزيئية الحرجة من حزب المحافظين توضيح، تراكم الأدلة تشير إلى أن تتم معالجة المستضدات خارجية المنشأ عن طريق المرتبطة هيولى تدهور (أراد) بعد التصدير غير الكلاسيكية اندوسيتيك الأجزاء الأخرى. الأوصاف لهذه المقصورات اندوسيتيك حتى وقت قريب، كانت محدودة لأن هناك لا علامات جزيئية محددة خلاف المستضدات خارجية المنشأ. الأسلوب الموصوفة هنا هو بروتوكول عزلة حويصلة جديدة، مما يسمح لتنقية هذه المقصورات اندوسيتيك. باستخدام هذا ميكروسومي المنقي، نحن تشكيلها أراد مثل النقل، أوبيكويتينيشن، وتجهيز مستضد خارجية في المختبر، مما يوحي بأن نظام ubiquitin-بروتوزوم معالجة مستضد خارجية بعد التصدير من هذا حجرة الخلوية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول كذلك لأنواع الخلايا الأخرى لتوضيح الآلية الجزيئية لحزب المحافظين.

Introduction

MHC أنا يعبر عن الجزيئات على السطح لكافة الخلايا المنواه، مع الببتيدات مستضدي قصيرة مستمدة من المستضدات الذاتية، التي تتم معالجتها بواسطة نظام ubiquitin-بروتوزوم في سيتوسول1. بعد المعالجة، تنقل الناقل الببتيد الصنبور الببتيدات المستضديه في التجويف هيولى (ER). في التجويف ER، سلسلة من مرافقين محددة مساعدة في تحميل الببتيد والطي الصحيحة من MHC أنا معقدة. هذه السلسلة من الجزيئات تسمى مجمع الببتيد-تحميل (PLC)، مشيراً إلى أن لائحة حجرة مركزية الببتيد تحميل عند MHC2. بعد تحميل، ببتيد MHC أنا الجزيئات يتم نقلها إلى سطح الخلية وتلعب دوراً رئيسيا في النظام المناعي التكيفي كعلامات الذاتية، وتمكن CD8+ اللمفاويات T السامة للخلايا (CTLs) للكشف عن الخلايا السرطانية أو العوامل المعدية بمولده الببتيدات من البروتينات غير المتمتعة بالحكم الذاتي3.

في مستضد تقديم الخلايا (APC)، الببتيدات مستضدي من المستضدات خارجية المنشأ كما عرضت عليها MHC أنا4،5،6،،من78 عبر حزب المحافظين، الذي يتم أساسا من قبل وحدات تحكم المجال Dc10،،من911. CP أمر ضروري سواء بالنسبة لتنشيط السذاجة CD8+ تي الخلايا وذاكرة CD8 الخلايا+ تي في مكافحة الأمراض المعدية ومكافحة الأورام CTLs12،13، وفي الحفاظ على التسامح المناعية قبل يخمد من الذاتي بالإنابة السذاجة تي الخلايا14،15. حزب المحافظين يلعب العديد من الأدوار الهامة في النظام المناعي التكيفي، إلا أن الآليات الجزيئية لحزب المحافظين ولم توصف بالتفصيل. وكشفت الدراسات السابقة لحزب المحافظين أن المستضدات خارجية المنشأ كانت المترجمة لائحة ودخلول على حد سواء، وتم معالجتها بواسطة أراد، مما يوحي بأن تنقل المستضدات خارجية المنشأ من دخلول إلى لائحة للتجهيز مثل أراد والببتيد تحميل16 . ومع ذلك، تشير الأدلة تراكم إلى الاضطلاع بتحميل الببتيد CP لا لائحة وإنما في أماكن اندوسيتيك غير الكلاسيكية، التي لديها أيضا السمات المميزة لل ER (الشكل 1)17،18 ،19،،من2021. لتجنب تدهور السلائف ببتيد مستضدي بنشاط أمينوبيبتيداسي عالية يحدث22 في سيتوسول والتجهيز والببتيد تحميل في حزب المحافظين في المنطقة القريبة من هذه المقصورات اندوسيتيك غير الكلاسيكية (الشكل 1). على الرغم من أن الأوصاف من هذه المقصورات اندوسيتيك مثيرة للجدل، وهناك لا جزيئات محددة موجودة عدا المستضدات خارجية المنشأ في هذه المقصورة.

أراد هو مسار خلوية، وعلى وجه التحديد إلى إزالة البروتينات تجمعات لائحة. في مسار أراد، تنقل عبر غشاء ER إلى السيتوبلازم ريتروجراديلي تجمعات البروتينات ومعالجتها بواسطة نظام ubiquitin-بروتوزوم23،24،25. عندما يتم نقل الجزيئات الكبيرة، مثل البروتينات، عن طريق بلير الدهن، هذه الجزيئات المرور عبر جهاز جزيئي يسمى ترانسلوكون، مثل مجمع Sec61 وديرلان المعقدة في أية26، ومجمع توم وتيم المعقدة في 27من الميتوكوندريا. عندما أضيف مناشئ المستضدات تنقل عبر غشاء ER، أنهم يجب أن تخترق bilayer الدهني في المجمع مع ترانسلوكونس، مثل مجمع Sec61. الأسلوب الموصوفة هنا تنقية حويصلة المستهدفة باستخدام هذه الجزيئات اختراق الغشاء كعلامات للمقصورات اندوسيتيك.

الأسلوب الموصوفة هنا بروتوكول تنقية حويصلة جديدة تستخدم في الخلية مثل العاصمة خط DC2.428 وبيوتينيلاتيد أوفالبومين (بوفا) مستضد خارجية. تم تنقية المقصورات اندوسيتيك من ستريبتافيدين (SA)-المغناطيسي الخرز استخدام بوفا اختراق الغشاء كصانع. في هذا ميكروسومي المنقي، بعض مناشئ أضيف بوفا المحافظة لا تزال في غشاء الكسور ولكن نقلها إلى الخارج من ميكروسومي ومن ثم أوبيكويتيناتيد ومعالجتها في المختبر29. هذا المنقي ميكروسومي الواردة اندوسيتيك الخاصة بحجرة البروتينات ليس فقط، بل أيضا البروتينات ER-المقيم أراد والببتيد تحميل المعقدة؛ مما يدل على أن حجرة الخلوية حجرة اندوسيتيك المحتملين لحزب المحافظين29. هذا البروتوكول لا يتوقف على نوع المستضدات خارجية المنشأ، وينطبق أيضا لمجموعات فرعية DC الأخرى وأنواع الخلايا الأخرى، مثل الضامة وخلايا ب وخلايا بطانية، لتوضيح إليه الجزيئي الدقيق لوحدات تحكم المجال Dc CP يتقن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-زراعة الخلايا وإضافة المستضدات خارجية المنشأ

بوفا
  1. تحضير تستخدم وصفها بروتين البيوتين كيت بعد الشركة المصنعة ' بروتوكول s.
    ملاحظة: عادة، بوفا يحتوي على البيوتين م 2 الواحدة 1 "متر البويضات" في المتوسط-
  2. الخلايا DC2.4 تنمو في ربمي-1640 تستكمل مع مم 2 لتر-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم والأحماض الأمينية غير الأساسية 0.1 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين، 55 مم 2-mercaptoethanol، 10 مم حبيس (درجة الحموضة 7.5) ومصل العجل الجنين 10% (يشار إليها فيما بعد ربمي) عند 37 درجة مئوية في 5 % CO 2 في حاضنة هوميديفيد (يشار إليها فيما بعد دون ذكر، الخلايا هي المحتضنة في هذا الشرط). من الممكن أيضا استخدام دميم وتستكمل مع 10% مصل العجل الجنين، 3.7 غرام/لتر ناكو 3 (يشار إليها فيما بعد دميم) بدلاً من ربمي.
  3. في اليوم قبل تنقية، تقسيم الخلايا إلى ربمي إلى 1 × 10 5 خلايا/مل في صفيحة زراعة الأنسجة. تجنب حفظ الخلايا في دولة المتلاقية. خلايا DC2.4 يمكن إدراج الغاية المستضدات خارجية المنشأ حتى دولة شبه المتلاقية، ولكن تفقد القدرة بسرعة بعد التوصل إلى إقامة دولة روافد الإفراط.
    4. خلايا
  4. قبل DC2.4 شبه المتلاقية وإضافة 250 ميكروغرام/مل من بوفا 1 × 10 6 خلايا/مل واحتضانها حاء – 2-4
    ملاحظة: أثناء تجارب المصب، كافة المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة وتحفظ في 4 درجات مئوية ما لم يبين خلاف ذلك.

2. إعداد ميكروسوميس

  1. حصاد الخلايا DC2.4 من بيبيتينج رقيقة من لوحة النسيج في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
  2. الطرد المركزي في غ س 1,000 لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية، وإزالة بعناية المتوسطة مع بوفا بتطلع.
  3. تغسل الخلايا DC2.4 مرتين مع 40 مل من برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (1.37 ملم كلوريد الصوديوم، 8.1 مم نا 2 هبو 4 مم 2.68 بوكل، 1.47 م خ 2 ص 4) باستخدام الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية، وتجاهل المادة طافية في كل مرة بتطلع.
  4. ريسوسبيند بيليه في الخطوة 2، 3 في 1-2 مل (1/20-1/10 حجم الثقافة المتوسطة) من متوسطة التجانس (0.25 م السكروز، 1 مم يدتا، 10 مم حبيس-هيدروكسيد الصوديوم [الأس الهيدروجيني 7.4]) مع حجم 1/1,000 الكوكتيل مثبط البروتياز ونقل DC2.4 ريسوسبينديد الخلايا في المثلج دونس الخالطون-
    5. تعطيل
  5. الخلايا DC2.4 ريسوسبينديد بلطف من 10-20 السكتات الدماغية مع الخالطون دونس المثلج.
    ملاحظة: أثناء الخطوة التعطيل، الخالطون دونسي يتم تبريده في مدت
  6. نقل تعليق تعطلت الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديدة.
  7. إضافة المتوسطة التجانس مل 8-9 إلى 10 مل مجموع والطرد المركزي الأنبوبة المخروطية لمدة 10 دقائق في 000 2 × ز و 4 درجة مئوية.
  8. نقل المادة طافية إلى أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد لإزالة الخلايا غير منقطعة ونوى، والطرد المركزي الأنبوبة المخروطية مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 000 2 × ز و 4 درجة مئوية.
  9. نقل المادة طافية في أنبوب تنبيذ فائق جديد وجهاز الطرد المركزي لمدة 45 دقيقة في 000 100 × ز و 4 درجة مئوية.
  10. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه بعناية في 1-2 مل متوسطة التجانس مع حجم 1/1,000 الكوكتيل مثبط البروتياز التي بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً عدة مرات لجعل جزء ميكروسومي لتجارب المتلقين للمعلومات-
  11. نقل الكسر ميكروسومي في أنبوب أسفل 5 مل جولة جديدة-
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة، فمن الممكن لإثراء موضوعي ميكروسوميس بكثافة إيوديكسانول التدرج الطرد المركزي وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s، لإزالة ميكروسوميس غير محددة. الكسور الذروة المستضدات خارجية المنشأ وتم جمعها وتعرض ثم انتقل إلى الخطوة التالية لتنقية (الخطوة 3)-

3. تنقية ميكروسوميس مع بوفا "أراد تمر"

الخرز SA المغناطيسي
  1. حجم إضافة 1/100 من جديد لكسر ميكروسومي خطوة 2.11 في 5 مل جولة الأنبوبة السفلي.
    ملاحظة: قبل هذه الخطوة، أنه من الممكن قبل مسح جزء ميكروسومي بالخرز التحكم المغناطيسي لتقليل التلوث microsomes غير محددة.
  2. بلطف المزيج جيدا وتدوير أنبوب أسفل جولة ببطء لمدة 30 دقيقة في 4 ° C.
  3. إضافة 2-3 مل من تجانس المتوسطة لمجموع 4 مل في أنبوب أسفل جولة ولطف مزيج جيد.
  4. وضع أنبوب أسفل جولة على الوقوف مغناطيسية واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. منذ الخرز منضمة إلى الحويصلات تنجذب إلى المغناطيس، الخرز الصغير البنى سوف تتراكم تدريجيا على جدار الأنبوبة الأقرب إلى المغناطيس.
  5. مع الأنبوب المتبقية في موقف المغناطيسي، بعناية تجاهل في supernatants بالتطلع إزالة الحويصلات غير منضم.
  6. أغسل الخرز المغناطيسي ملزمة للحويصلات مرتين مع 5 مل متوسطة التجانس المغناطيسي الوقوف لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية في كل مرة بتطلع بعناية.
    ملاحظة: دون الوقوف المغناطيسي، تنقية قبل سينتريفوجيشنز في 2,000 س ز لمدة 10 دقائق، 4 درجة مئوية يتوفر أيضا.
  7. الخرز المغناطيسي منضم إلى الحويصلات بعناية في 100 ميليلتر التجانس المتوسطة حسب بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً عدة مرات ريسوسبيند-
  8. نقل الحويصلات ريسوسبينديد إلى microtube جديد ميكروسومي المنقي لتجارب المتلقين للمعلومات-
    ملاحظة: عادة، 50 ميليلتر ميكروسومي جزء يحتوي على 5-20 ميكروغرام البروتينات من 1 × 10 7 الخلايا يمكن أن تكون معزولة.

4. تحليل Microsomes تنقية

  1. ريسوسبيند المغناطيسي الخرز منضمة إلى الحويصلات من 3.8 خطوة 100-200 ميليلتر من TNE المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، يدتا 0.5 M، 1% P-40 نونيديت) بحجم 1/1,000 الكوكتيل مثبط البروتياز بدلاً من المتوسطة التجانس.
  2. نقل من الخطوة 4، 1 إلى microtube 1.5 مل جديدة.
  3. تحديد تركيز البروتين من الخطوة 4، 2 باستخدام مجموعة أدوات مقايسة اتفاق التعاون الأساسي للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
    ملاحظة: عادة ما يكون 5-10 ميليلتر من الخطوة 4، 2 ما يكفي لتحديد تركيز البروتين.
  4. نقل من الخطوة 4، 2 (2 ميكروغرام من البروتين لتلطيخ فضية و 10 ميكروغرام من البروتين النشاف الغربية) إلى microtubes الجديدة-
  5. وضعت في microtubes على كتلة حرارة في البروتينات 95 درجة مئوية، ويغلي في 1 × مخزونات النشر الاستراتيجي جل تحميل المخزن المؤقت (100 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، 200 ملم ديثيوثريتول، الحزب الديمقراطي الصربي 4%، 0.2% بروموفينول الأزرق، والغليسيرول 20 ٪) للحد الأدنى 5
  6. الطرد المركزي microtubes لمدة 10 دقائق في 21,500 س ز و 4 درجة مئوية. جمع في سوبيرناتانتس إلى microtubes جديدة لإزالة أجزاء غير قابلة للذوبان.
  7. تحليل البروتينات حلها في خطوة 4.6 (2 ميكروغرام) من صفحة SD القياسية.
  8. تصور عدة نطاقات البروتين بالفضية التلوين باستخدام صبغة الفضة عقب الشركة المصنعة ' بروتوكول s-
  9. تحليل البروتينات حلها في خطوة 4.6 (10 ميكروغرام) صفحة SD القياسية والنشاف الغربية. استخدام الكاشف (SA-برنامج الصحة الإنجابية) لكل الشركة المصنعة ' s البروتوكول وتصور طريق فلوروجرافي-

5. في المختبر إعادة تشكيل "أوبيكويتينيشن أراد" من بوفا "استخدام تنقية ميكروسوميس"

ميكروسوميس
  1. نقل تنقية (5-10 ميكروغرام من البروتين) من الخطوة 3.8 بحجم خلية شبكية ليستي (RL)، 50% في 1 س رد فعل المخزن المؤقت (50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 3 مم ATP، 0.5 مم مجكل 2)، و 12:02 م معلم العلم أوبيكويتين في microtube جديد. الحجم النهائي لهذه التجربة هو ميليلتر 20-40-
  2. إينكوباتي microtube ح 2 في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كان مقدار بوفا أوبيكويتيناتيد في الخطوة 5، 12 صغير جداً للكشف عن طريق النشاف الغربية، إضافة 10 ميكرون من MG132 أو 2 ميكرومتر من لاكتاسيستين تحول دون معالجة بوفا أوبيكويتيناتيد من بروتيسوميس-
  3. وقف رد الفعل بوضع microtube على مدت
  4. حل في microsomes بإضافة 500 ميليلتر TNE من المخزن المؤقت بحجم 1/1,000 الكوكتيل مثبط البروتياز.
  5. الطرد المركزي microtube لمدة 10 دقائق في 21,500 x ز و 4 درجة مئوية. جمع في supernatants في microtube جديدة لإزالة الكسور غير قابلة للذوبان، التي تتضمن بوفا أوبيكويتيناتيد في DC2.4 قبل الفحص في المختبر أوبيكويتينيشن.
  6. نقل المادة طافية microtube جديدة وإضافة المجلد 1/100 من حبات SA المغناطيسي الجديد (عادة 5 ميليلتر ل 500 ميليلتر من سوبيرناتانتس).
  7. المزيج جيدا بلطف وتدوير microtube ببطء لمدة 30 دقيقة في 4 ° C.
  8. الطرد المركزي microtube لمدة 10 دقائق في 21,500 س ز و 4 ° جيم تجاهل المادة طافية بالتطلع استرداد بوفا وأوبيكويتيناتيد بوفا ملزمة مع الخرز سا-المغناطيسية-
  9. يغسل مرتين الخرز سا-المغناطيسية التي تم جمعها مع 1 مل من TNE المخزن المؤقت باستخدام الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 21,500 س ز و 4 ° جيم تجاهل المادة طافية في كل مرة بتطلع.
  10. غلى الخرز سا-المغناطيسية في 1 س جل الحزب الديمقراطي الصربي تحميل المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية في حرارة كتلة حل البروتينات المنقاة بالخرز سا-المغناطيسية-
  11. الطرد المركزي microtube لمدة 10 دقائق في 21,500 س ز و 4 درجة مئوية. جمع في supernatants في microtube جديدة لإزالة أجزاء غير قابلة للذوبان.
    12. تحليل
  12. SA المغناطيسي الخرز ملزمة للبروتينات بصفحة SD القياسية والنشاف الغربية. استخدام الأجسام المضادة (المضادة العلم ومكافحة--متعددة--يو بي الماوس المضادة IgG-برنامج الصحة الإنجابية) والكاشف (SA-HRP) كل الشركة المصنعة ' بروتوكول s وتصور طريق فلوروجرافي-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوضيح هذه الآلية الجزيئية لحزب المحافظين، من الضروري تحديد المقصورات الخلوية، حيث يخضع المستضدات خارجية المنشأ أراد مثل النقل والتجهيز. بينما حددت ملاحظاتها بالفحص المجهري إيممونوفلوريسسينت أو بواسطة المجهر الإلكتروني حجرة الخلوية حيث تراكمت المستضدات خارجية المنشأ16،،من1718،19، 30،31،،من3233، مقصورات الهاتف الخلوي للتجهيز مثل أراد المستضدات خارجية المنشأ غير محددة بوضوح. مؤخرا تبين أن اندوسوميس غير الكلاسيكية مع جزيئات ER المقيم المسؤول عن حزب المحافظين34ولكن هذه المقصورات الخلوية أونبوريفيد. الصعوبة في عزل وتنقية المقصورات الخلوية يمكن أن يعزى إلى حقيقة أن المستضدات خارجية المنشأ يتم ترجمة كل من دخلول والأجزاء الأخرى مثل ER وأنه لا يوجد أي جزيء تحديد لهذه المقصورات اندوسيتيك أخرى من المستضدات خارجية المنشأ. ومع ذلك، حالة المستضدات خارجية المنشأ تمر مثل أراد النقل يختلف عن حالة مستقرة؛ في النقل عبر غشاء الدهون bimolecular واختراق المستضدات خارجية المنشأ الغشاء عن طريق ترانسلوكونس، مثل Sec61 (الشكل 2A). وبالتالي، عند استخدام بوفا مستضد خارجية، ينبغي أن تكون بوفا المقترنة مع Sec61. منذ بوفا المرتبطة بغشاء ملزمة على وجه التحديد مع سا، ميكروسومي إعداد من DC2.4، الذي كان pretreated مع بوفا، يمكن أن تكون معزولة متميز بالخرز سا-المغناطيسية (الشكل 2A). ثم حلت المبالغ المعادلة من البروتينات من microsomes المنقي مع أو بدون ما قبل الحضانة بوفا بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها تلطيخ الفضة والنشاف الغربية مع سا-برنامج الصحة الإنجابية (الشكل 2، ج 2). كما هو مبين في الشكل 2و الشكل 2B ، الوارد microsomes معزولة عدة البروتينات الفريدة التي كانت تنقية تعتمد على مناشئ وأضاف بوفا والخرز سا-المغناطيسي. وبالإضافة إلى هذه البروتينات فريدة من نوعها، تضمنت microsomes معزولة أيضا البروتينات غير محدد، والتي ترتبط بالخرز SA المغناطيسي مع أو بدون بوفا. علاج ميكروسومي مع التربسين قبل تنقية بالمغناطيس حالت دون تنقية microsomes (الشكل 2D)، مما يدل على أن أساليب تنقية يتوقف على وجود اختراق الغشاء بوفا.

Microsomes المنقاة أظهرت القدرة على أوبيكويتيناتي في بوفا مدمجة في المختبر، ظل وجود ريال (الشكل 3A). زادت المبالغ بوفا وبولي-أوبيكويتيناتيد بوفا حضور MG132 (الشكل 3B)، مما يشير إلى أن بوفا مدمجة تمت معالجتها بواسطة نظام أراد وأن لدينا microsomes المنقي الواردة أراد إليه البروتينات.

Figure 1
رقم 1: مسارات داخل الخلايا لحزب المحافظين في وحدات تحكم المجال Dc- في وحدات تحكم المجال Dc، يتم نقل المستضدات خارجية المنشأ في أماكن اندوسيتيك غير الكلاسيكية، التي تحتوي أيضا على جزيئات ER-المقيم بالإضافة إلى جزيئات دخلول الراحل الكلاسيكية. في هذه المقصورة، يتم تصدير المستضدات خارجية المنشأ في سيتوسول من خلال ترانسلوكونس مثل Sec61. في سيتوسول، تتم معالجة المستضدات خارجية المنشأ بنظام ubiquitin-بروتوزوم في الببتيدات مستضدي كركائز أراد. تنقل إلى مقصورات اندوسيتيك غير الكلاسيكية نفسها أو المتاخمة لها، أو ER المجاورة عن طريق الناقل الاستفادة من الببتيدات مستضدي وثم حملت على MHC أنا الجزيئات بالمجلس التشريعي الفلسطيني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تنقية Microsomes مع بوفا "أراد تمر". (أ) بنموذج التخطيطي لتنقية microsomes مع بوفا تمر أراد. يرتبط بالغشاء عن طريق ترانسلوكون Sec61 بوفا والمستهدفة مع الخرز سا-المغناطيسي. ميكروسوميس (ب) مع (+) أو دون (-) تم تنقيته قبل إضافة بوفا مع (+) أو دون الخرز سا-المغناطيسية (-). وحلت البروتينات (2 ميكروغرام) أو وحدات التخزين المطابق للبروتينات المنقاة 7.5-15 في المائة من مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة، وتلطيخ الفضة استخدمت لتصور نطاقات البروتين. مثلثات على الجانب الأيسر تشير إلى البروتينات غير محدد ملزم الخرز سا-المغناطيسي. مثلثات مع النجمة تشير إلى البروتينات فريدة من نوعها وجدت إلا بحضور بوفا مناشئ المضافة والخرز سا-المغناطيسي. يظهر السهم بوفا. ميكروسوميس (ج) مع (+) أو دون (-) تم تنقيته قبل إضافة بوفا مع (+) أو دون الخرز سا-المغناطيسية (-). البروتينات (10 ميكروغرام) أو وحدات التخزين المطابق للبروتينات المنقاة تم حلها 7.5-15 في المائة من مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة، وتعرض للغربية النشاف مع سا-برنامج الصحة الإنجابية. ب. ن.: النووية بعد الكسر. تشير العلامات النجمية في الحق عصابات غير محددة مع سا-برنامج الصحة الإنجابية. وتم تحقيق نتائج متكافئة بفحوصات مستقلة على الأقل ثلاثة. تم تنقية Microsomes (د) مع إضافة بوفا السابقة مع الخرز سا-المغناطيسي. ميكروسوميس تعامل مع (+) أو بدون التربسين (-) وتكساس-100 قبل تنقية (يسار حارتين) أو بعد تنقية (حق مسارين). وحلت البروتينات (2 ميكروغرام) أو وحدات التخزين المطابق للبروتينات المنقاة 7.5-15 في المائة من مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة، وتلطيخ الفضة استخدمت لتصور نطاقات البروتين. مثلثات على الجانب الأيسر تشير إلى البروتينات غير محدد ملزم الخرز سا-المغناطيسي. مثلثات مع النجمة تشير إلى البروتينات فريدة من نوعها وجدت إلا بحضور بوفا مناشئ المضافة والخرز سا-المغناطيسي. وتم تحقيق نتائج متكافئة بفحوصات مستقلة على الأقل ثلاثة. طبع بإذن من المرجع28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: في المختبر إعادة تشكيل لتجهيز واستخدام البويضات في "تنقية ميكروسوميس" أوبيكويتينيشن. Microsomes منقي (A) مع (+) أو دون (-) قبل إضافة بوفا تعامل مع (+) أو بدون (-) RL والعلم-Ub ح 1 وتم سولوبيليزيد باستخدام TNE. كان تنقية مع الخرز SA المغناطيسي بوفا وتعرضوا للغربية النشاف مع الأجسام المضادة المشار إليها. تشير العلامات النجمية في الحق عصابات غير محددة مع سا-برنامج الصحة الإنجابية. وتم تحقيق نتائج متكافئة بفحوصات مستقلة على الأقل ثلاثة. (ب) microsomes منقي تعامل مع (+) أو بدون (-) RL والعلم-يو بي MG132 ح 1 وكانت سولوبيليزيد ثم استخدام TNE. كان تنقية مع الخرز SA المغناطيسي بوفا وتعرضوا النشاف الغربية مع العلم SA. تشير العلامات النجمية في الحق عصابات غير محددة مع سا-برنامج الصحة الإنجابية. وتم تحقيق نتائج متكافئة بفحوصات مستقلة على الأقل ثلاثة. طبع مع بيرميسيوn من مرجع28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الدراسات السابقة لحزب المحافظين، تراكمت المستضدات خارجية المنشأ مدرجة في المنطقة المحظورة من دخلول المتأخرة أو ER بالفحص المجهري إيمونوفلوريسسينت16،30،،من3132. ومن المقدر أن أراد مثل النقل والتجهيز من المستضدات خارجية تتم في هذه المجالات المتخصصة ER أو دخلول الراحل، كما حددت حجرة الخلوية السكروز أو إيوديكسانول كثافة استخدام الطرد المركزي التدرج أوبيكويتيناتيد بوفا كعلامة تجهيز أراد شبيهة. بعد تنشيط الحصانة الفطرية، زيادة كبيرة في كفاءة CP، والكسر الذروة بوفا جنبا إلى جنب مع أوبيكويتيناتيد بوفا هاجروا إلى كسر كثافة أعلى (النتائج غير منشورة). وكانت أهداف هذه التجارب تحديد المؤشرات الجزيئية المحددة للائحة أو دخلول الراحل، الذي هاجر إلى جانب بوفا أو بوفا أوبيكويتيناتيد. لكن في النتائج، والجزيئات المقيم ER والراحل المقيم دخلول جزيئات هاجروا إلى جانب بوفا وبوفا أوبيكويتيناتيد، مشيراً إلى أن هذه التجارب كانت ناجحة في التحقق من حجرة الخلوية للنقل مثل أراد وتجهيز ER الكلاسيكية أو دخلول الراحل. في هذه التجارب، كان هناك لا جزيئات محددة في المقصورات اندوسيتوتيك إلا بوفا أو بوفا أوبيكويتيناتيد. ومع ذلك، بينما خضع مستضد خارجية أراد مثل النقل، اخترقت هذه الجزيئات غشاء بلير الدهن ER عن طريق ترانسلوكونس، مثل Sec61 معقدة (الشكل 1، الشكل 2 ألف). تم اختيار الغشاء الشائكة بوفا كعلامة من المقصورات اندوسيتيك، وكانت تنقية في microsomes بالخرز سا-المغناطيسية (الشكل 2 أ، 2). في هذه ميكروسوميس المنقي، جاء بوفا المتراكمة عبر أراد مثل أوبيكويتينيشن وتجهيز تحت وجود RL و ATP في المختبر (الشكل 3A, 3B). منذ RL يحتوي على جميع أباراتي الجزيئية سيتوسوليك، مثل الجزيئات المتصلة أوبيكويتينيشن وبروتيسوميس بالإضافة إلى جزيئات للترجمة والنسخ، يمكن إضافة RL أوبيكويتينيشن بوفا في ميكروسومي النقية. هذه النتائج تشير إلى أن ميكروسوميس المنقي المقصورات الخلوية موضوعية أراد مثل النقل والتجهيز من المستضدات خارجية المنشأ، سواء التي تحتوي على جزيئات محددة دخلول وجزيئات ER-المقيم في نفس الوقت؛ وأظهرت Lamp1 السلائف وأشكال ناضجة في ميكروسومي النقية.

هذا البروتوكول يتوقف على مقدار اختراق الغشاء المستضدات خارجية المنشأ؛ من المهم أن تتضمن ما يكفي من المستضدات خارجية المنشأ للخلايا DC2.4، مما يدل قدرة عالية لإدماج المستضدات خارجية المنشأ في حالة شبه المتلاقية. التمطيط الوقت حضانة ح 6-12 ل DC2.4 مع بوفا يزيد من مقدار بوفا مدمجة. إضافة مثبطات ل proteasomes، MG132 أو لاكتاسيستين، زيادات معتدلة مبالغ microsomes المنقي. إعداد ميكروسومي إحدى الخطوات الأكثر أهمية لهذا البروتوكول. ينبغي إزالة بوفا الحرة، التي لم تدرج في الخلايا DC2.4، عن طريق غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، لمنع الربط غير محددة من بوفا مجاناً للكسر ميكروسومي. للحد من الأضرار على غشاء المقصورات، تتعطل الخلايا بعناية قبل الخالطون دونس في الماء المثلج. ثم تمت إزالة الخلايا غير منقطعة ونوى بالطرد المركزي كما أعدت في microsomes من الكسر النووية بعد. بعد إعداد microsomes، تتم تنقية خطوة واحدة من حبات سا-المغناطيسية. في هذه الخطوة، الغسيل حذراً من ميكروسومي المغناطيس ملزمة ضروري لإزالة الربط غير محددة من المكونات الخلوية الأخرى ولا تفقد ميكروسومي ملزمة على وجه التحديد.

في هذا الأسلوب تنقية خطوة واحدة، مطلوب نسبة مئوية كبيرة من ميكروسومي الهدف. إذا كانت نسبة ميكروسومي موضوعي صغير جداً، إنقاص مقدار ميكروسومي الهدف المنقي من المنافسة غير محددة وملزمة من المقصورات الخلوية الأخرى. ونتيجة لذلك، في ظل هذه الظروف، الفاسدون ميكروسومي المستهدفة، وإزالة الألغام من ميكروسومي غير محددة ستكون هناك حاجة. من الممكن أيضا لإدخال خطوات إضافية قبل تنقية بالخرز سا-المغناطيسي. واحد من هذه الخطوة هو السكروز أو إيوديكسانول الكثافة التدرج الطرد المركزي ميكروسومي. منذ microsomes المعدة تحتوي على جميع المنتجات غشاء، أنه قد يكون من الممكن لإثراء ميكروسومي المستهدفة قبل SA المغناطيسي الخرز تنقية بتحديد الكسور مستضد الغنية لتنقية. خطوة ممكن آخر هو الموافقة المسبقة من ميكروسومي بالخرز التحكم المغناطيسي دون سا، للحد من الجمعيات الخلفية غير محددة من microsomes ضد الخرز سا-المغناطيسية. في هذه التجارب، كل الخطوات تحسين نقاء ميكروسومي الهدف فعالية، ولكن تقلص المبلغ الإجمالي للمنتجات النقية، مما يشير إلى تحديد الخطوات الإضافية كوسيلة للمزيد من التجارب.

من المعروف جيدا أن الطرد المركزي عالية السرعة ما ثبت أنه يسبب الانصهار أو التخثر من حويصلات داخل الخلايا. سوف تنتج هذه الأنشطار أو كلوتينجس ميكروسوميس الاصطناعية، التي تستمد من التفاعل غير محددة بين أنواع مختلفة من حويصلات المستمدة من عضية. هذه microsomes الاصطناعية إحصائيا تحتوي كل جزيء الغشاء مثل جزيء المقيم المتقدرية، جهاز غولجي جزيء المقيم، إلخ. لم تتضمن هذه microsomes تنقية البروتينات المقيم كافيوسومي، جهاز غولجي البروتينات المقيم، أو أوائل المقيمين دخلول البروتينات، مثل caveolin1 و GM130 و EEA1، مشيراً إلى أن ميكروسوميس SA تنقيته ليست المنتجات الاصطناعية المتأتية من اندماج بين أنواع مختلفة من الحويصلات. دون الطرد المركزي عالية السرعة، حويصلات بوفا الشائكة كانت معزولة، ولكن أظهرت تجارب التحكم من حويصلات دون بوفا مبالغ أكبر من الجزيئات غير محددة. وهذا يشير إلى أن هذا الأسلوب الأولية غير كافية لإجراء التجارب المتعاقبة، وأن خطوة الطرد المركزي عالية السرعة أمر ضروري لهذا البروتوكول تنقية.

ينطبق هذا البروتوكول على أنواع الخلايا الأخرى، مثل مختلف المجموعات الفرعية في العاصمة، أو غيرها من ناقلات الجنود المدرعة. من الممكن أيضا استخدام أنواع مختلفة من المستضدات خارجية المنشأ في ظروف مختلفة، مثل البروتينات الفلورية، مجمع ضد مستضد، المستضدات الخرز ملزمة، إلخ. وعلاوة على ذلك، نحن يمكن تنقية microsomes المستهدفة باستخدام أجسام مضادة محددة ضد المستضدات خارجية المنشأ. على الرغم من أن عدة خطوات إضافية أو تعديلات قد تكون مطلوبة لتطبيق هذا البروتوكول على المستضدات والخلايا الأخرى، هو توضيح الآليات الجزيئية لحزب المحافظين تعتمد على بروتوزوم بمقارنة الجزيئات المنقي بين تجارب مختلفة. وهكذا، قد البروتوكول وصف الغرفة للتعديل والتحسين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل معتمد من قبل جامعة تاكاساكي للصحة والرعاية الاجتماعية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum Equitech bio SFB30
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine gibco by life technologies 25030-164
Penisicillin-Sreptomycin gibco by life technologies 15140-122
DMEM gibco by life technologies 12100-46
OVA SIGMA A5503
Biotin-protein labelling kit Thermo Fisher Scientific F6347
MG-132 Santa Cruz Biotechnology 201270
lactacystin SIGMA L6785
Dounce homogenizer IUCHI 131703
protease inhibitor cocktails SIGMA P8340
iodixanol Cosmo bio 1114542
SA-magnetic beads New England Biolabs 201270
control magnetic beads Chemagen M-PVA012
magnetic stand BD Biosciences 552311
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23225
silver staining kits Cosmo bio 423413
Reticulocyte Lysate Promega 1730714
Flag-tagged ubiquitin SIGMA U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse) Antibody Shop HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse) MBL D058−3
anti-Flag (mouse) SIGMA F3165
trypsin SIGMA 85450C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
  4. Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
  5. Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
  6. Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
  7. Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
  8. Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
  9. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  10. Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
  11. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  12. Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
  13. Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
  14. Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
  15. Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
  16. Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
  17. Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
  18. Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
  19. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
  20. Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
  21. Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
  22. Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
  23. Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
  24. Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
  25. Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
  26. Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
  27. Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
  28. Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
  29. Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
  30. Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
  31. Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
  32. Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
  33. Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
  34. Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).

Tags

علم المناعة، 126 مسألة، والخلايا الجذعية، وتدهور المرتبطة هيولى، الصليب-العرض التقديمي، هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية في الفصل الأول، ترانسلوكون، أوبيكويتين
تنقية المقصورة غشاء للتدهور المرتبطة هيولى المستضدات خارجية المنشأ في العرض التقديمي عبر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imai, J., Otani, M., Sakai, T.,… More

Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation. J. Vis. Exp. (126), e55949, doi:10.3791/55949 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter