Summary
Метод, описанный здесь — это новый Протокол изоляции везикул, который позволяет для очистки сотовой отсеков, где Экзогенные антигены обрабатываются эндоплазматического ретикулума связаны деградация в кросс презентации.
Abstract
Дендритные клетки (DCs) весьма способны обработки и представления интернализированных Экзогенные антигены класса гистосовместимости (MHC) я молекулы также известный как крест презентация (CP). CP играет важную роль не только в стимуляции наивно CD8+ T памяти CD8 клетки и+ T-клеток для инфекционных и опухоли иммунитета, но и в инактивации автоматической наивно T клетки Т-клеток анергия или удаления Т-клеток. Хотя критические молекулярный механизм CP предстоит быть выяснены, накапливая свидетельствуют, что Экзогенные антигены обрабатываются через эндоплазматического ретикулума связаны деградация (ERAD) после экспорта из Неклассические endocytic отсеков. До недавнего времени, характеристики этих endocytic отсеков были ограничены, потому что там было без конкретных молекулярных маркеров помимо Экзогенные антигены. Метод, описанный здесь — это новый Протокол изоляции везикул, который позволяет для очистки этих endocytic отсеков. Используя этот очищенный микросомы, мы восстановленный ERAD-как транспорт, ubiquitination и обработки экзогенных антигена в пробирке, предполагая, что убиквитин протеасом системы обработки экзогенных антигена после экспорта из этого Сотовый отсек. Этот протокол может применяться в других типах клеток для уточнения молекулярный механизм CP.
Introduction
MHC I молекулы выражаются на поверхности всех ядерных клеток, с короткие антигенные пептиды, производный от эндогенные антигены, которые обрабатываются системой убиквитин протеасом в цитозоль1. После обработки, антигенные пептиды переносятся в эндоплазматический ретикулум (ER) просвета пептида перевозчика крана. В просвете ER ряд конкретных сопровождающих помочь загрузки пептидной и правильный складывающиеся MHC I комплекс. Эта серия молекул называется загрузки пептидной комплекс (PLC), указав, что ER является центральный отсек для пептида, загрузки на MHC2. После загрузки, пептид MHC I молекулы переносятся на поверхности клеток и играть ключевую роль в адаптивной иммунной системы как самостоятельной маркеры и позволяет CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) для выявления раковых клеток или инфекционные агенты по антигенной пептиды от белков несамоуправляющихся3.
В антиген представляющих клеток (APC), антигенные пептиды из Экзогенные антигены, также представлены на MHC4,5,6,,78 через CP, который осуществляется главным образом по DCs9,10,11. CP имеет важное значение как для активации наивно CD8+ T памяти CD8 и клетки+ T клеток в борьбе с инфекционными и анти опухолевых ЦТЛ12,13и в поддержании иммунной толерантности путем инактивации из автоматическими наивные Т-клеток14,15. CP играет много важных ролей в адаптивной иммунной системы, однако молекулярных механизмов CP еще должны быть подробно описаны. Предыдущие исследования CP показали, что Экзогенные антигены были локализованы в ER и endosome и были обработаны ERAD, предполагая, что Экзогенные антигены транспортируются от endosome ER для обработки ERAD-как и пептида загрузки16 . Однако накапливая данные свидетельствуют, что загрузки пептидной CP осуществляется не в ER, но скорее в неклассической endocytic отсеках, которые также имеют отличительные черты ER (рис. 1)17,18 ,19,,2021. Чтобы избежать деградации антигенные пептиды прекурсоров, высокой активности aminopeptidase22 в цитозоле, обработки и пептида, погрузка в CP происходит в области проксимальных этих Неклассические endocytic отсеков (рис. 1). Хотя характеристики этих endocytic отсеками являются спорными, есть нет существующих конкретных молекул помимо Экзогенные антигены в этом отсеке.
ERAD является сотовой путь, который специально удаляет смятых протеинов от ER. В ERAD пути смятых протеинов retrogradely транспортируются через мембраны ER в цитоплазму и обработаны убиквитин протеасом системы23,24,25. Когда большие молекулы, такие как белки, транспортируются через липидный бислой, эти молекулы проходят через молекулярные аппарат, под названием translocon, как Sec61 комплекс и Дерлена комплекс в ER26и том комплекс и Тим комплекс в Митохондрии27. При экзогенно Добавлено антигены перевозятся через мембрану ER, они должны проникнуть липидного бислоя в комплексе с translocons, например Sec61 комплекс. Метод, описанный здесь очищенного целевых везикул, используя эти мембраны проникновение молекул как маркеры для endocytic отсеков.
Метод, описанный здесь-это новый протокол очистки пузырек с помощью DC-подобных клеток линии DC2.428 и биотинилированным овальбумина (Бова) как экзогенные антигена. Endocytic отсеках были очищены по стрептавидина (SA)-магнитные шарики с помощью мембраны проникая Бова как производитель. В этом очищенная микросомы, некоторые экзогенно добавлены Бова до сих пор сохранились в мембраны фракций, но были перевезены в наружной части микросомы, а затем убиквитинированных и обрабатываются в vitro29. Это очищенный микросомы содержатся не только endocytic отсек специфических белков, но и ER-резидентов белков для ERAD и пептида, Загрузка комплекса; предположить, что отсеке сотовой перспективных endocytic отсек для CP29. Этот протокол не зависит от вида Экзогенные антигены и применяется также для других подмножеств DC и другие типы клеток, макрофагов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток, уточнить точный молекулярный механизм DCs для опытным CP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рост клетки и добавлением Экзогенные антигены
- подготовить Бова, с помощью биотин белка маркировки комплект после производитель ' протокол s.
Примечание: Обычно, Бова содержит биотина 2 М на 1 М OVA среднем. - Клетки растут DC2.4 в RPMI 1640 с 2 мм L-глютамином, пируват натрия 1 мм, 0,1 мм заменимые аминокислоты, 100 ед/мл пенициллин стрептомицином, 2-меркаптоэтанол 55 мм, 10 мм HEPES (рН 7,5) и 10% плода телячьей сыворотки (далее RPMI) при 37 ° C в 5 % CO 2 в увлажненные инкубатора (далее без упоминания, клетки инкубируют в это условие). Это также можно использовать с 10% плода телячьей сыворотки, 3,7 г/Л NaHCO 3 (далее DMEM) вместо RPMI DMEM.
- В день до очистки, разбить ячейки на RPMI до 1 x 10 5 клеток/мл в пластине культуры ткани. Избегайте клеток в состоянии вырожденная. DC2.4 клетки могут весьма включать Экзогенные антигены до полу вырожденная государства, но быстро теряют способность после достижения состояния чрезмерного притока.
- Перед DC2.4 клетки полу вырожденная, добавить 250 мкг/мл Бова для 1 х 10 6 клеток/мл и проинкубируйте 2-4 ч.
Примечание: Во время вниз по течению экспериментов, все буферы и реагенты хранятся при температуре 4 ° C Если не указано иное.
2. Подготовка микросом
- урожая DC2.4 клеток, нежный дозирование из ткани пластины в новой 50 мл Конические трубки.
- Центрифуг в 1000 x g за 5 мин., 4 ° C и тщательно удалить носитель с Бова стремлением.
- Мыть DC2.4 клетки дважды с 40 мл буфера (1.37 мм NaCl, 8,1 мм Na 2 HPO 4, 2.68 мм KCl, 1.47 мм х 2 PO 4) PBS центрифугированием на 1000 x g за 5 мин., 4 ° C и удалить супернатант каждый раз путем аспирации.
- Ресуспензируйте гранул на шаге 2.3 в 1-2 мл (1/20-1/10 объема питательной среды) гомогенизации среды (0,25 М сахарозы, 1 мм ЭДТА, 10 HEPES-NaOH [рН 7,4]) с объемом 1/1000 коктейли ингибитор протеазы и передачи ресуспензированы DC2.4 клеток в ледяной Dounce гомогенизатора. Мягко
- нарушить ресуспензированы DC2.4 клеток на 10-20 ударов с ледяной гомогенизатор Dounce.
Примечание: Во время шага нарушения, Dounce гомогенизатор охлаждается на льду - Передать новой 15 мл Конические трубки подвеска клеток нарушена.
- Добавить средне гомогенизации 8-9 мл по 10 мл общее и центрифуги Конические трубки для 10 мин на 2000 x g и 4 ° C.
- Передача супернатант новой 15 мл Конические трубки для удаления непрерывной клетки и ядер и центрифуги Конические трубки снова за 10 мин на 2000 x g и 4 ° C.
- Передачи супернатант в новой ultracentrifugation трубки и центрифуги для 45 мин на 100,000 x g и 4 ° C.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы тщательно в 1-2 мл гомогенизации среды с объемом 1/1000 коктейлей ингибитора протеазы, закупорить решение вверх и вниз несколько раз, чтобы сделать малую микросомы по течению экспериментов.
- Передачи микросомы фракция в новый раунд внизу 5-мл трубку.
Примечание: После этого шага, это позволяет обогатить объективных микросом, iodixanol плотность градиентного центрифугирования по заявлению производителя ' протокол s, чтобы удалить неспецифической микросом. Пик фракций для Экзогенные антигены собираются и затем подвергается следующим шагом очистки (шаг 3).
3. Очистка микросом с Бова переживает ERAD
- Добавить 1/100 объем свежего SA-магнитные бусы на долю микросомы шаг 2.11 в 5 мл круглая труба внизу.
Примечание: Перед этот шаг, это можно предварительно очистить микросомы фракции путем управления магнитные бусы для уменьшения загрязнений неспецифической микросом. - Нежно хорошо перемешать и вращать круглым дном трубки медленно, в течение 30 мин на 4 ° C.
- Добавить 2-3 мл среды гомогенизации в 4 мл всего в трубу круглым дном и осторожно перемешайте.
- Труба круглая снизу на магнитного стенд и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C. Так как бусы, обязан пузырьки притягиваются к магниту, коричневый микро бусы постепенно накапливаются к стенке трубки, ближайший к магниту.
- С трубки оставшихся в магнитного стенд, тщательно отбросить supernatants путем аспирации для удаления несвязанных везикулы.
- Мыть, магнитные бусы, привязанного к везикулы дважды с 5 мл гомогенизации среды с магнитной стоять 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант каждый раз тщательно стремлением.
Примечание: Без магнитного стенд, очищение, centrifugations на 2000 x g за 10 мин., 4 ° C также доступен. - Ресуспензируйте магнитные бусы, привязанного к везикулы тщательно в 100 мкл гомогенизации среде с дозирование раствора вверх и вниз несколько раз.
- Передачи ресуспензированы везикулы в новой Микропробирка как очищенная микросомы для вниз по течению экспериментов.
Примечание: Как правило, 50 мкл микросомы фракция 5-20 мкг белков от 1 x 10-7 клетки могут быть выделены.
4. Анализ микросом очищенный
- Ресуспензируйте магнитной бусины, обязан везикулы от шаг 3,8 на 100-200 мкл буфера TNE (20 мм трис-HCl рН 7,4, 150 мм NaCl, ЭДТА 0,5 М, 1% Nonidet P-40) объемом 1/1000 коктейлей ингибитор протеазы Вместо того, чтобы средний гомогенизации.
- Передачи lysate от шаг 4.1 новый 1,5 мл микропробирок.
- Определить концентрацию белка шаг 4.2, используя набор пробирного BCA на производителя ' протокол s.
Примечание: Как правило, 5-10 мкл lysate шаге 4.2 является достаточно, чтобы определить концентрацию белка. - Передача lysate от шага 4.2 (2 мкг белка для Серебряные пятная и 10 мкг белка для западный blotting) в новый пробирок.
- Поставить пробирок на блоке тепла на 95 ° C и кипения белков в 1 x SDS гель загрузки буфера (100 мм трис-HCl pH 6.8, 200 мм Дитиотреитол, SDS 4%, 0,2% бромфеноловый синий, 20% глицерина) для 5 минут
- Центрифуга для пробирок Эппендорф, для 10 минут, 21 500 x g и 4 ° C. собирать supernatants в новые пробирок для удаления нерастворимых фракций.
- Анализа решена белков в шаге 4.6 (2 мкг), Стандартная SD-страница.
- Визуализация белка полосы серебром, окрашивание с помощью Серебряные пятная комплекта после производителя ' протокол s.
- Анализ решена белков в шаге 4.6 (10 мкг) стандартные SD-страницы и Западный blotting. Используйте реагент (SA-ПХ) на производителя ' s протокол и визуализировать, флюорография.
5. В пробирке Восстановление ERAD Ubiquitination Бова с использованием очищенного микросом
микросом (5-10 мкг белка)- передачи, очищенного от шаг 3,8 объемом 50% ретикулоцитов lysate (RL), 1 x буфер реакции (50 мм трис рН 7,4, 3 мм АТФ, 0.5 мм MgCl 2) и 0: 2 вечера с тегами Флаг убиквитин в новом микропробирок. Окончательный объем этого эксперимента является 20-40 мкл.
- Инкубировать Микропробирка 2 ч при 37 ° с.
Примечание: Если количество убиквитинированных Бова шаге 5.12 слишком мал для обнаружения Западный blotting, добавить 10 мкм MG132 или 2 мкм lactacystin подавлять обработки убиквитинированных Бова, протеасом. - Остановить реакции, поместив Микропробирка на ДВС.
- Решить микросом, добавив 500 мкл TNE буфер объемом 1/1000 коктейлей ингибитора протеазы.
- Центрифуг Микропробирка 10 мин на 21,500 x g и 4 ° C. собирать supernatants в новой Микропробирка для удаления нерастворимых фракций, которые содержат Бова убиквитинированных в DC2.4 перед в vitro ubiquitination assay.
- Передача супернатант новой Микропробирка и добавить 1/100 объем новых SA-магнитные бусы (обычно 5 мкл для 500 мкл supernatants).
- Осторожно перемешать и вращать Микропробирка медленно, в течение 30 мин в 4 ° C.
- Центрифуга Микропробирка 10 мин на 21 500 x g и 4 ° C. Discard супернатант стремлением восстановить Бова и убиквитинированных Бова связаны с SA-магнитные бусы.
- Мыть дважды собранных SA-магнитные бусы с 1 мл буфера TNE центрифугированием на 10 минут, 21 500 x g и 4 ° C. удалить супернатант каждый раз путем аспирации.
- Варить SA-магнитные шарики в 1 x гель SDS загрузки буфера для 5 мин при 95 ° C на тепло блок решить очищенные белки SA-магнитные бусы.
- Центрифуга Микропробирка 10 мин на 21 500 x g и 4 ° C. собирать supernatants в новой Микропробирка для удаления нерастворимых фракций.
- Анализ SA-магнитные бусы, связаны с белками стандартные SD-страницы и Западный blotting. Использование антител (анти флаг, анти multi-Ub и анти мыши IgG-ПХ) и реагента (SA-ПХ) составляет производителя ' протокол s и визуализированное флюорография.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для выяснения молекулярный механизм CP, это необходимо для выявления клеточных отсеков, где Экзогенные антигены пройти ERAD-как транспорта и обработки. Хотя замечания immunofluorescent микроскопии или электронной микроскопии выявлены сотовой отсек, где Экзогенные антигены накопленных,16,,1718,19 30,,3132,33, сотовой отсеки для обработки ERAD-как экзогенные антигены четко не определены. Недавно было показано, что Неклассические endosomes с ER-резидентов молекулы отвечали за CP34, но эти сотовой отсеков были неочищенную. Трудности в изоляции и очистки сотовой отсеков можно объяснить тот факт, что Экзогенные антигены локализованы в endosome и ER-как отсеков и что нет никаких идентифицирующих молекулы для этих endocytic отсеков других чем Экзогенные антигены. Однако условие Экзогенные антигены, проходят ERAD-как транспорт отличается от устойчивого состояния; в перевозках через bimolecular мембрану липидов, Экзогенные антигены проникают мембраны через translocons, например Sec61 (рис. 2A). Таким образом при использовании Бова как экзогенные антиген, Бова должны быть связаны с Sec61. Поскольку связанный мембранами Бова конкретно связаны с SA, микросомы, приготовленный из DC2.4, который был предварительно обработанных с Бова, могут быть изолированы SA-магнитные бусы (рисунок 2A) отчетливо. Затем эквивалентные суммы белков из очищенного микросом, с или без предварительной инкубации Бова были решены путем SDS-PAGE следуют Серебряные пятная и Западный blotting с SA-ПХ (Рисунок 2B, 2 C). Как показано на рисунке 2B и 2 c рисунок, изолированные микросом содержится несколько уникальных белков, которые были очищены зависит экзогенно добавлен Бова и SA-магнитные бусы. Помимо этих уникальных белков изолированные микросом также содержал неспецифических белков, которые привязаны к SA-магнитные бусы с или без Бова. Лечение микросомы трипсином до очистки магнитом помешали очистки микросом (Рисунок 2D), указывая, что методы очистки зависит от присутствия мембраны проникая Бова.
Очищенный микросом показали способность ubiquitinate включены Бова в пробирке, под присутствие RLs (рис. 3A). Количество Бова и поли убиквитинированных Бова были увеличены в присутствии MG132 (рис. 3B), указывающее, что включены Бова был обработан системой ERAD и что наши чистые микросом содержатся белки ERAD машины.
Рисунок 1: внутриклеточный пути для CP в DCs. В DCs Экзогенные антигены переносятся в Неклассические endocytic отсеков, которые также содержат молекулы ER-резидентов помимо молекул классический конце endosome. В этом отсеке Экзогенные антигены экспортируется в цитозоль через translocons, например Sec61. В цитозоле Экзогенные антигены обрабатываются системой убиквитин протеасом в антигенные пептиды как ERAD субстратов. Антигенные пептиды перевозятся в же или смежных отсеков Неклассические endocytic, или прилегающие ER через TAP транспортер и затем загружены на MHC I молекул, PLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Очистка микросом с Бова переживает ERAD. (A) A схематическая модель очистки микросом с Бова, проходят ERAD. Бова ассоциируется с мембраной через Sec61 translocon и с SA-магнитные бусы. (B) микросом с (+) или (-) без предварительного добавления Бова были очищенные с (+) или без са магнитные бусы (-). Белки (2 мкг) или соответствующие тома очищенных белков были решены на 7,5-15% SDS-PAGE, и Серебряные пятная была использована для визуализации белка полосы. Треугольники на правой стороне свидетельствуют о неспецифических белков, привязка к SA-магнитные бусы. Треугольники с звездочками указывают уникальных белков, обнаруженных только в присутствии экзогенно добавлен Бова и SA-магнитные бусы. Стрелка показывает Бова. (C) микросом с (+) или (-) без предварительного добавления Бова были очищенные с (+) или без са магнитные бусы (-). Белки (10 мкг) или соответствующие тома очищенных белков были решены на 7,5-15% SDS-PAGE и подвергается западной blotting с SA-ПХ. П.н.: пост-ядерной дроби. Звездочки в правом показывают неспецифичных с SA-ПХ. Эквивалентные результаты были достигнуты, по крайней мере три независимых анализов. Микросом (D) с ранее добавлением Бова были очищены с SA-магнитные бусы. Микросом лечили (+) (-) трипсина и TX-100 до очистки (слева две полосы) или после очистки (сразу две полосы) или без. Белки (2 мкг) или соответствующие тома очищенных белков были решены на 7,5-15% SDS-PAGE, и Серебряные пятная была использована для визуализации белка полосы. Треугольники на правой стороне свидетельствуют о неспецифических белков, привязка к SA-магнитные бусы. Треугольники с звездочками указывают уникальных белков, обнаруженных только в присутствии экзогенно добавлен Бова и SA-магнитные бусы. Эквивалентные результаты были достигнуты, по крайней мере три независимых анализов. Перепечатано с разрешения ссылки28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: In Vitro воссоздание обработки и Ubiquitination используя OVA в очищенной микросом. Микросом очищенные (A) с (+) или (-) без предварительного добавления Бова лечили (+) или (-) без RL и флаг-Ub за 1 ч и были солюбилизирован с помощью TNE. Бова был очищен с SA-магнитные бусы и подвергнут западной blotting с указанных антител. Звездочки в правом показывают неспецифичных с SA-ПХ. Эквивалентные результаты были достигнуты, по крайней мере три независимых анализов. (B) очищенные микросом лечили (+) или без (-) RL, флаг-Ub и MG132 за 1 час и затем были солюбилизирован с помощью TNE. Бова был очищен с SA-магнитные бусы и подвергнут Западный blotting с SA-флагом. Звездочки в правом показывают неспецифичных с SA-ПХ. Эквивалентные результаты были достигнуты, по крайней мере три независимых анализов. Перепечатано с разрешенийn28ссылок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В предыдущих исследованиях CP включены Экзогенные антигены накопленных в запретной зоне конце endosome или ER immunofluorescent микроскопии16,30,,3132. Предполагается, что ERAD-как транспорта и обработки Экзогенные антигены осуществляется в таких специализированных областях, ER или поздно endosome, как сотовой отсек был опознан сахарозы или с использованием градиентного центрифугирования плотности iodixanol Бова убиквитинированных как ERAD-как обработки маркера. После стимулирования их врожденного иммунитета, значительно повысить эффективность CP, и фракции пик для Бова вместе с убиквитинированных Бова мигрировали в малую плотность выше (неопубликованные результаты). Цель этих экспериментов были для выявления конкретных молекулярных маркеров для ER или поздно endosome, которые мигрировали вместе с Бова или убиквитинированных Бова. Но в результатах, ER-резидентов молекул и конце молекулы endosome резидентов мигрировали вместе с Бова и убиквитинированных Бова, указав, что эти эксперименты были неудачными в выяснении сотовой отсек для перевозки ERAD-как и обработка классического ER или поздно endosome. В этих экспериментах в endocytotic отсеках за исключением Бова или убиквитинированных Бова без конкретных молекул. Однако в то время как экзогенные антигена прошли ERAD-как транспорт, эти молекулы проникли липидного бислоя мембраны ER через translocons, например Sec61 комплекс (рис. 1, рисунок 2A). Мембраны, торчащие Бова был выбран в качестве маркера endocytic отсеков, и микросом были очищены от SA-магнитные бусы (рисунок 2A, 2B). В эти чистые микросом накопленные Бова наткнулся ubiquitination ERAD-как и обработки под наличие RL и АТФ в пробирке (рис. 3A, 3B). Так как RL содержит все цитозольной молекулярной apparati, например связанных с ubiquitination молекул и протеосомы помимо молекул для перевода и транскрипции, RL позволяет ubiquitination Бова в очищенной микросомы. Эти результаты показывают, что очищенный микросом были объективные сотовой отсеков для ERAD-как транспорта и обработки Экзогенные антигены, оба содержащих endosome конкретных молекул и ER-резидентов молекул в то же время; Lamp1 показан в очищенной микросомы прекурсоров и зрелые формы.
Этот протокол зависит количество проникающего мембраны Экзогенные антигены; важно включить достаточное количество Экзогенные антигены для DC2.4 клеток, которые показывает высокую способность учитывать экзогенные антигены в состоянии полу вырожденная. Удлинения 6-12 ч инкубации время для DC2.4 с Бова увеличивает количество включены Бова. Добавление ингибиторов для протеасомы, MG132 или lactacystin, умеренно увеличивает количество очищенной микросом. Подготовка микросомы является одним из наиболее важных шагов для этого протокола. Бесплатный Бова, которая не включена в DC2.4 клетки, должны быть удалены путем промывания клетки с PBS, чтобы предотвратить неспецифической связывание свободного Бова микросомы дроби. Чтобы сократить убытки на мембраны отсеков, клетки тщательно подорван гомогенизатор Dounce в ледяной воде. Затем непрерывной клетки и ядра были удалены центрифугированием, как микросом были подготовлены от пост-ядерной фракции. После подготовки микросом осуществляется одношаговый очистки по SA-магнитные бусы. На этом шаге тщательное мытье магнита привязан микросомы необходимо удалить привязку неспецифической других сотовых отсеков и не потерять конкретно связанного микросомы.
В этом методе очищения один шаг требуется значительный процент целевой микросомы. Если соотношение объективного микросомы слишком мал, количество очищенной целевой микросомы уменьшается конкуренции с привязкой неспецифической других сотовых отсеков. Следовательно в этих условиях, обогащения микросомы целевой и распродажа неспецифической микросомы потребуются. Это также можно ввести дополнительные меры до очистки SA-магнитные бусы. Одним из таких шагов является сахарозы или iodixanol плотность градиентного центрифугирования по микросомы. Так как подготовленные микросом содержат все продукты мембраны, может быть возможность обогатить целевой микросомы до очистки SA-магнитные бусы, выбрав антигена богатые фракций для очистки. Еще одним возможным шагом является предварительном досмотре микросомы путем управления магнитные шарики без Са, уменьшить неспецифической фон ассоциации микросом против SA-магнитные бусы. В этих экспериментах оба шаги улучшение чистоты целевой микросомы эффективно, но уменьшается общее количество очищенных продуктов, о том, что эти дополнительные шаги выбираются в качестве средства дальнейших экспериментов.
Хорошо известно, что было показано что высокоскоростной центрифуги вызвать фьюжн или свертывания внутриклеточных пузырьков. Эти слияния или clottings будет производить искусственные микросом, которые являются производными от неспецифичные взаимодействия среди различных видов производных органеллы везикулы. Эти искусственные микросом статистически содержат каждый мембраны молекулы митохондриальной резидентов молекулы, аппарат Гольджи резидентов молекулы, и т.д. Эти чистые микросом не включает резидентов белки caveosome, аппарат Гольджи резидентов белки или начале endosome резидентов белков, таких как caveolin1, GM130 и ЕЕА1, указывая, что са очищенная микросом не искусственных продуктов производные от сплавливания среди различных видов везикулы. Без высокоскоростной центрифугирования Бова прилипание пузырьков были изолированы, но управления эксперименты от везикулы без Бова показали более высокие суммы неспецифической молекул. Это означает, что этот предварительный метод является недостаточным для последовательных экспериментов и что высокоскоростной центрифуги шаг необходим для этого протокола очистки.
Этот протокол применяется к другие типы ячеек, например различные подмножества DC, или других БТР. Это также можно использовать различные типы Экзогенные антигены в различных условиях, таких как флуоресцентные белки, комплекс антиген антитело, бусины связаны антигены, и т.д. Кроме того мы можем очистить целевой микросом, с использованием специфических антител против антигенов, экзогенные. Хотя несколько дополнительных шагов или изменений может потребоваться применить этот протокол в другие клетки и антигены, она может пролить свет молекулярных механизмов протеасом зависимых CP, сравнивая очищенный молекул среди различных экспериментов. Таким образом описанные протокол имеет номер для изменения и улучшения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Такасаки университет здравоохранения и социального обеспечения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S.
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A.
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
