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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Endoplasmic जालिका के लिए झिल्ली के डिब्बे की शुद्धि-परस्पर प्रस्तुति में Exogenous एंटीजन के जुड़े क्षरण

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

Summary

यहां वर्णित विधि एक नया पुटिका आइसोलेशन प्रोटोकॉल है, जो सेलुलर डिब्बों के शुद्धिकरण के लिए अनुमति देता है जहां exogenous एंटीजन पार-प्रस्तुति में endoplasmic जालिका से जुड़े क्षरण की कार्रवाई की जाती है ।

Abstract

वृक्ष कोशिकाओं (dc) प्रसंस्करण और प्रमुख histocompatibility वर्ग (MHC) मैं भी पार-प्रस्तुति (सीपी) के रूप में जाना जाता अणुओं पर आंतरिक exogenous एंटीजन पेश करने में सक्षम हैं । सीपी न केवल की उत्तेजना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है भोली सीडी+ टी कोशिकाओं और स्मृति सीडी+ टी कोशिकाओं संक्रामक और ट्यूमर उन्मुक्ति के लिए लेकिन यह भी टी सेल anergy द्वारा आत्म अभिनय भोली टी कोशिकाओं की निष्क्रियता में या टी सेल विलोपन. यद्यपि सीपी के महत्वपूर्ण आणविक तंत्र का आविर्भाव होना शेष रहता है, ऐसे साक्ष्यों को संचित करने से संकेत मिलता है कि exogenous एंटीजन गैर-शास्त्रीय endocytic से निर्यात के बाद endoplasmic जालिका-संबद्ध क्षरण (ERAD) के माध्यम से संसाधित किए जाते हैं डिब्बों. अभी हाल तक इन endocytic डिब्बों की characterizations सीमित थीं क्योंकि exogenous एंटीजन के अलावा कोई विशिष्ट आणविक मार्कर नहीं थे. यहां वर्णित विधि एक नया पुटिका आइसोलेशन प्रोटोकॉल है, जो इन endocytic डिब्बों की शुद्धि के लिए अनुमति देता है । इस शुद्ध microsome का उपयोग कर, हम ERAD की तरह परिवहन, ubiquitination, और प्रसंस्करण मेंexogenous प्रतिजन की प्रक्रिया का पुनर्गठन, सुझाव है कि ubiquitin-proteasome प्रणाली इस से निर्यात के बाद exogenous प्रतिजन संसाधित सेलुलर कम्पार्टमेंट । इस प्रोटोकॉल को आगे अंय प्रकार के सेल के लिए लागू किया जा सकता है वाणिज्यिक पत्र के आणविक तंत्र स्पष्ट है ।

Introduction

MHC I अणुओं सभी nucleated कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं, अंतर्जात एंटीजन से व्युत्पंन लघु प्रतिजनी पेप्टाइड्स के साथ, जो proteasome में ubiquitin-cytosol प्रणाली द्वारा संसाधित कर रहे हैं1. प्रसंस्करण के बाद, प्रतिजनी पेप्टाइड्स पेप्टाइड ट्रांसपोर्टर नल द्वारा endoplasmic जालिका (एर) लुमेन में ले जाया जाता है । एर लुमेन में, विशिष्ट chaperones की एक श्रृंखला पेप्टाइड लोडिंग और MHC मैं परिसर की सही तह सहायता करते हैं । अणुओं की यह श्रृंखला पेप्टाइड-लोडिंग परिसर (पीएलसी) कहा जाता है, यह दर्शाता है कि एर MHC मैं2पर पेप्टाइड लदान के लिए एक केंद्रीय डिब्बा है । पेप्टाइड लदान के बाद, MHC मैं अणु सेल सतह तक ले जाया जाता है और आत्म मार्करों के रूप में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और सीडी+ साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTLs) को सक्षम बनाता है प्रतिजनी द्वारा कैंसर कोशिकाओं या संक्रामक एजेंटों का पता लगाने के लिए गैर से पेप्टाइड्स-स्व प्रोटीन3।

में antigen प्रस्तुत कक्ष (APC), exogenous एंटीजन से प्रतिजनी पेप्टाइड भी MHC मैं4,5,6,7,8 के माध्यम से सीपी, जो मुख्य रूप से किया जाता है पर प्रस्तुत कर रहे हैं आउट ऑफ dc9,10,11। वाणिज्यिक पत्र दोनों भोली सीडी+ टी कोशिकाओं और स्मृति सीडी+ टी कोशिकाओं विरोधी संक्रामक और विरोधी ट्यूमर CTLs12,13में सक्रियण के लिए आवश्यक है, और के निष्क्रिय द्वारा प्रतिरक्षा सहिष्णुता के रखरखाव में आत्म अभिनय भोली टी कोशिकाओं14,15। सीपी अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन वाणिज्यिक पत्र के आणविक तंत्र अभी तक विस्तार से वर्णित किया है । सीपी के पिछले अध्ययनों से पता चला कि exogenous एंटीजन ईआर और endosome दोनों में स्थानीयकृत थे और ERAD द्वारा संसाधित किए गए थे, सुझाव दे रहे हैं कि exogenous एंटीजन endosome से ईआर तक ERAD के लिए ले जाया जाता है-जैसे प्रोसेसिंग और पेप्टाइड लोडिंग16 . हालांकि, सबूत जमा इंगित करता है कि सीपी के पेप्टाइड लदान नहीं एर में किया जाता है बल्कि गैर शास्त्रीय endocytic डिब्बों में, जो भी एर की विशिष्ट सुविधाओं है (चित्रा 1)17,18 ,19,20,21. cytosol में aminopeptidase22 के उच्च गतिविधि द्वारा प्रतिजनी पेप्टाइड पुरोगामी की गिरावट से बचने के लिए, प्रसंस्करण और सीपीई में पेप्टाइड लोडिंग इन गैर-शास्त्रीय endocytic डिब्बों (चित्रा 1) के समीपस्थ क्षेत्र में होता है. हालांकि इन endocytic डिब्बों की characterizations विवादास्पद हैं, लेकिन इस डिब्बे में exogenous एंटीजन के अलावा कोई मौजूदा विशिष्ट अणु नहीं हैं.

ERAD एक सेलुलर मार्ग है, जो विशेष रूप से एर से निकला हुआ प्रोटीन निकालता है । ERAD मार्ग में, प्रगट प्रोटीन प्रतिगामी कोशिका को एर झिल्ली के माध्यम से ले जाया जाता है और ubiquitin-proteasome प्रणाली23,24,25द्वारा संसाधित । जब बड़े अणुओं, जैसे प्रोटीन, लिपिड bilayer के माध्यम से ले जाया जाता है, इन अणुओं एक आणविक उपकरण के माध्यम से पारित एक translocon, जैसे Sec61 परिसर और Derlin परिसर में एर26, और में टॉम कॉम्प्लेक्स और टिम परिसर mitochondria27. जब exogenously-जोड़ा एंटीजन एर झिल्ली के माध्यम से ले जाया जाता है, वे Sec61 परिसर जैसे translocons के साथ जटिल में लिपिड bilayer घुसना चाहिए । विधि यहां वर्णित इन झिल्ली का उपयोग करके लक्षित पुटिका शुद्ध-endocytic डिब्बों के लिए मार्कर के रूप में अणुओं मर्मज्ञ ।

विधि यहां वर्णित एक नई पुटिका शुद्धि प्रोटोकॉल का उपयोग कर डीसी की तरह सेल लाइन डीसी 2.428 और biotinylated ovalbumin (bOVA) एक exogenous प्रतिजन के रूप में । endocytic डिब्बों streptavidin (एसए) द्वारा शुद्ध थे-एक निर्माता के रूप में झिल्ली मर्मज्ञ bOVA का उपयोग चुंबकीय मोती । इस शुद्ध microsome में, कुछ exogenously जोड़ा bOVA अभी भी झिल्ली भागों में संरक्षित किया गया था, लेकिन microsome के बाहर तक ले जाया गया, और फिर ubiquitinated और इन विट्रो में29संसाधित । यह शुद्ध microsome न केवल endocytic डिब्बे-विशिष्ट प्रोटीन, लेकिन यह भी एर ERAD के लिए निवासी प्रोटीन और पेप्टाइड लोडिंग परिसर निहित; सुझाव है कि सेलुलर डिब्बा29सीपी के लिए भावी endocytic डिब्बे है । इस प्रोटोकॉल exogenous प्रतिजनों की तरह पर निर्भर नहीं है, और अन्य डीसी सबसेट और अन्य सेल प्रकार, जैसे मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, और endothelial कोशिकाओं के लिए भी लागू है, कुशल वाणिज्यिक पत्र के लिए dc की सटीक आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए.

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. बढ़ती कोशिकाओं और Exogenous एंटीजन के अलावा

  1. एक बायोटिन-प्रोटीन लेबलिंग किट का प्रयोग कर bOVA तैयार करें निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल का पालन कर रहा है.
    नोट: साधारणतः, bOVA में 2 m बायोटिन प्रति 1 m ओवा औसतन होता है.
  2. RPMI में डीसी 2.4 कोशिकाओं बढ़ने-१६४० 2 मिमी एल के साथ पूरक-glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, ०.१ मिमी अनावश्यक अमीनो एसिड, १०० U/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin, ५५ मिमी 2-mercaptoethanol, 10 मिमी HEPES (पीएच ७.५), और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (इसके बाद RPMI) पर ३७ & #176; सी में 5 % कं 2 एक humidified मशीन में (इसके बाद उल्लेख के बिना, कोशिकाओं को इस हालत में मशीन हैं) । यह भी 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक DMEM का उपयोग करने के लिए संभव है, ३.७ g/L NaHCO 3 (इसके बाद DMEM) RPMI.
    3. के स्थान पर शुद्धि से पहले एक दिन
  3. , कोशिकाओं को RPMI में विभाजित करने के लिए 1 x 10 5 कोशिकाओं/एमएल एक ऊतक संस्कृति की थाली में । कोशिकाओं को धाराप्रवाह अवस्था में रखने से बचें । डीसी 2.4 कोशिकाओं को उच्च एक अर्द्ध धाराप्रवाह राज्य तक exogenous प्रतिजनों को शामिल कर सकते हैं, लेकिन तेजी से एक से अधिक धाराप्रवाह राज्य तक पहुंचने के बाद की क्षमता खो देते हैं ।
  4. से पहले डीसी 2.4 कोशिकाओं अर्द्ध-धाराप्रवाह रहे हैं, जोड़ें २५० & #181; g/एमएल bOVA के लिए 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल और 2-4 ज.
    के लिए मशीन नोट: बहाव प्रयोगों के दौरान, सभी बफ़र्स और रिएजेंट 4 & #176 पर रखा जाता है; C जब तक अंयथा इंगित न हो ।
< p class = "jove_title" > 2. Microsomes की तैयारी

  1. एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब में टिशू प्लेट से कोमल pipetting द्वारा डीसी 2.4 कोशिकाओं फसल ।
    2. 5 मिनट के लिए १,००० x g पर
  2. केंद्रापसारक, 4 & #176; सी और ध्यान से आकांक्षा द्वारा bOVA के साथ मध्यम निकालें ।
  3. डीसी 2.4 दो बार के साथ ४० पंजाबियों बफर की मिलीलीटर (१.३७ mM NaCl, धो ८.१ मिमी न 2 HPO 4 , २.६८ मिमी KCl, १.४७ मिमी KH 2 पो 4 ) द्वारा केंद्रापसारक पर १,००० x जी के लिए 5 मिनट, 4 & #176; सी और supernatant हर बार आकांक्षा द्वारा त्यागें ।
  4. चरण २.३ में 1-2 मिलीलीटर (1/20-1/10 संस्कृति माध्यम की मात्रा) homogenization मध्यम (०.२५ एम सुक्रोज में गोली reसस्पैंड, 1 मिमी EDTA, 10 मिमी HEPES-NaOH [pH ७.४]) के साथ 1/1000 के साथ की मात्रा को छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल और एक में reसस्पैंड डीसी 2.4 कोशिकाओं हस्तांतरण आइस-कोल्ड Dounce homogenizer.
  5. reसस्पैंड डीसी 2.4 कोशिकाओं को बाधित धीरे बर्फ के साथ 10-20 स्ट्रोक से ठंड Dounce homogenizer.
    नोट: व्यवधान चरण के दौरान, Dounce homogenizer बर्फ पर ठंडा है.
  6. स्थानांतरण सेल बाधित निलंबन एक नया 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए ।
  7. जोड़ें 8-9 मिलीलीटर homogenization मध्यम से 10 मिलीलीटर कुल और 10 मिनट के लिए शंकु ट्यूब पर २,००० x g और 4 & #176; C.
  8. भंग कोशिकाओं और नाभिक को दूर करने के लिए एक नया 15 एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण, और शंकु ट्यूब फिर से 10 मिनट के लिए २,००० x g पर और 4 & #176; C.
  9. एक नए ultracentrifugation ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और १००,००० x g पर ४५ मिनट के लिए केंद्रापसारक और 4 & #176; C.
  10. महाप्राण supernatant और homogenization मध्यम की 1-2 मिलीलीटर में सावधानी से स्थगित 1/pipetting द्वारा समाधान और नीचे कई बार बहाव प्रयोगों के लिए एक microsome अंश बनाने के लिए तंग अवरोधक कॉकटेल की मात्रा के साथ ।
  11. एक नया 5-एमएल दौर नीचे ट्यूब में microsome अंश हस्तांतरण ।
    नोट: इस कदम के बाद, यह iodixanol घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा उद्देश्य microsomes निर्माता & #39 के अनुसार समृद्ध करने के लिए संभव है, एस प्रोटोकॉल, गैर विशिष्ट microsomes को दूर करने के लिए । exogenous एंटीजन के लिए चोटी भागों एकत्र कर रहे हैं और फिर शुद्धि के अगले कदम के अधीन (चरण 3).
< p class = "jove_title" > 3. bOVA जाणे ERAD

  1. के साथ Microsomes का शुद्धिकरण 1/100 जोड़ें ताजा एसए-चुंबकीय मोतियों की मात्रा के लिए चरण २.११ के microsome अंश में 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब ।
    नोट: इस चरण से पहले, गैर-विशिष्ट microsomes के संदूषणों को कम करने के लिए नियंत्रण-चुंबकीय मोतियों द्वारा microsome अंश को पूर्व-स्पष्ट करना संभव है.
  2. धीरे से अच्छी तरह से मिश्रण और 4 & #176 पर 30 मिनट के लिए धीरे दौर नीचे ट्यूब घुमाएं; C.
  3. गोल नीचे ट्यूब में homogenization मध्यम से 4 मिलीलीटर कुल के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से अच्छी तरह से मिश्रण ।
  4. एक चुंबकीय स्टैंड पर गोल नीचे ट्यूब प्लेस और 4 & #176 पर 10 मिनट के लिए मशीन; सी । के बाद से बुलबुले के लिए बाध्य मोती चुंबक के लिए आकर्षित कर रहे हैं, भूरे रंग के सूक्ष्म-मोती धीरे ट्यूब दीवार को चुंबक के निकटतम करने के लिए जमा होगा ।
    5. चुंबकीय खड़े में शेष ट्यूब के साथ
  5. , ध्यान से आकांक्षा से supernatants को त्यागने के लिए असीम बुलबुले दूर ।
  6. 4 & #176 पर 10 मिनट के लिए चुंबकीय खड़े द्वारा homogenization मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार बुलबुले के लिए बाध्य चुंबकीय मोतियों को धोने और supernatant को ध्यान से आकांक्षा द्वारा हर बार त्यागें ।
    नोट: चुंबकीय स्टैंड के बिना, २,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा शुद्धि 10 मिनट के लिए, 4 & #176; C भी उपलब्ध है.
  7. चुंबकीय मोतियों को reसस्पेंड १०० में ध्यान से बुलबुले के लिए बाध्य & #181; L homogenization माध्यम से कई बार हल को ऊपर और नीचे pipetting करके.
  8. बहाव प्रयोगों के लिए शुद्ध microsome के रूप में एक नया microtube में reसस्पैंड बुलबुले हस्तांतरण ।
    नोट: सामान्यतया, ५० & #181; L microsome अंश युक्त 5-20 & #181; छ प्रोटीन से 1 x 10 7 कोशिकाओं को अलग-थलग किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 4. शुद्ध Microsomes के विश्लेषण

  1. चुंबकीय मोतियों से ३.८ कदम से बुलबुले reसस्पेंड १००-२०० & #181; TNE बफर के एल (20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.४, १५० mm NaCl, ०.५ M EDTA, 1% Nonidet पी-४०) के साथ 1/1000 की मात्रा के साथ चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल के बजाय homogenization माध्यम.
  2. lysate चरण ४.१ से एक नया १.५-mL microtube.
    3. के लिए स्थानांतरण
  3. निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल प्रति एक बीसीए परख किट का उपयोग करके चरण ४.२ के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
    नोट: सामान्यतया, 5-10 & #181; L lysate से चरण ४.२ प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है ।
  4. lysate चरण ४.२ से (2 & #181; प्रोटीन के g लए चांदी के दाग और 10 & #181; g को पश्चिमी सोख्ता के लिए प्रोटीन की) नई microtubes.
    5. में
  5. ९५ & #176 पर एक हीट ब्लॉक पर डाल दिया है, और microtubes 1x एसडीएस जेल लोडिंग बफर में प्रोटीन फोड़ा (१०० mm Tris-HCl pH ६.८, २०० mM dithiothreitol, 4% एसडीएस, ०.२% bromophenol ब्लू, 20% ग्लिसरॉल) 5 min.
    6. के लिए
  6. के लिए microtubes 10 मिनट में २१,५०० x g और 4 & #176; C. अघुलनशील अंशों को हटाने के लिए supernatants को नए microtubes में एकत्र करें ।
  7. मानक एसडी-PAGE.
    8. द्वारा चरण ४.६ (2 & #181; g) में सुलझाए गए प्रोटीन का विश्लेषण
  8. चांदी सना हुआ चांदी के बाद निर्माता & #39; एस प्रोटोकॉल निंनलिखित किट का उपयोग करके प्रोटीन बैंड कल्पना ।
  9. मानक एसडी पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता द्वारा कदम ४.६ (10 & #181; जी) में हल प्रोटीन का विश्लेषण । निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल और fluorography.
    10. द्वारा visualize प्रति एजेंट (SA-एचआरपी) का उपयोग करें
< p class = "jove_title" > 5. इन विट्रो bOVA के ERAD Ubiquitination का पुनर्गठन कर शुद्धि Microsomes

  1. अंतरण शुद्ध Microsomes (5-10 & #181; प्रोटीन की जी) reticulocyte lysate (आरएल) की ५०% की मात्रा के साथ कदम ३.८ से, 1x प्रतिक्रिया बफर में (५० mm Tris पीएच ७.४, 3 मिमी एटीपी, ०.५ मिमी MgCl 2 ), और ०.२ बजे वज-tagged ubiquitin in a new microtube. इस प्रयोग की अंतिम मात्रा 20-40 & #181; L.
  2. के लिए microtube 2 ज पर ३७ & #176; ग.
    नोट: यदि चरण ५.१२ में ubiquitinated bOVA की मात्रा पश्चिमी सोख्ता द्वारा पता लगाने के लिए बहुत छोटी है, तो 10 & #181; m ऑफ MG132 या 2 & #181; lactacystin की प्रोसेसिंग को बाधित करने की प्रक्रिया ubiquitinated bOVA द्वारा proteasomes.
  3. को बर्फ पर microtube रखकर रिएक्शन बंद कर दें.
  4. ५०० & #181 को जोड़ कर microsomes का समाधान करे; L TNE बफ़र के साथ 1/1000 की मात्रा को छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल.
  5. केंद्रापसारक के लिए microtube 10 मिनट में 21, 500 x g र 4 & #176; ग. supernatants को एक नए microtube में इकट्ठा कर अघुलनशील अंशों को दूर करें, जिसमें से पहले ubiquitinated bOVA में डीसी 2.4 में शामिल इन विट्रो ubiquitination परख.
  6. एक नए microtube के लिए supernatant स्थानांतरण और नए एसए-चुंबकीय मोतियों की 1/100 मात्रा जोड़ (आमतौर पर 5 & #181; l के लिए ५०० & #181; l के supernatants).
  7. धीरे से अच्छी तरह मिला लें और 30 मिनट के लिए microtube को धीरे से घुमाएं 4 & #176; C.
  8. २१,५०० x g पर 10 मिनट के लिए microtube और 4 & #176; C. bOVA और ubiquitinated bOVA को ठीक करने के लिए आकांक्षा द्वारा supernatant को त्यागें सा चुंबकीय मोतियों के साथ बंधे.
  9. दो बार एकत्र सा-चुंबकीय मोती TNE बफर की 1 मिलीलीटर से 10 मिनट के लिए २१,५०० x g पर और 4 & #176; C. आकांक्षा द्वारा हर बार supernatant त्यागें ।
  10. 5 मिनट के लिए 1x एसडीएस जेल लोड करने बफर में एसए-चुंबकीय मोतियों को उबालें ९५ & #176; एसए-चुंबकीय मोतियों से शुद्ध प्रोटीन को हल करने के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर सी.
  11. के लिए microtube 10 मिनट में २१,५०० x g और 4 & #176; C. अघुलनशील अंशों को हटाने के लिए supernatants को एक नए microtube में एकत्र करें ।
  12. मानक एसडी पृष्ठ और पश्चिमी-सोख्ता द्वारा प्रोटीन के लिए बाध्य एसए-चुंबकीय मोतियों का विश्लेषण । एंटीबॉडी (एंटी-फ्लैग, एंटी-मल्टी यूबी, और एंटी-माउस आईजीजी-एचआरपी) और रिएजेंट (एसए-एचआरपी) का उपयोग निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल और fluorography.
    13. द्वारा visualized के अनुसार है

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Representative Results

सीपी के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए यह जरूरी है कि सेलुलर डिब्बों की पहचान हो, जहां exogenous एंटीजन ERAD-जैसे परिवहन और प्रोसेसिंग से गुजरते हैं । जबकि प्रेक्षण immunofluorescent माइक्रोस्कोपी द्वारा या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर डिब्बे की पहचान की जहां exogenous एंटीजन संचित16,17,18,19, 30,31,३२,३३, ERAD के लिए सेलुलर डिब्बों exogenous एंटीजन की तरह प्रसंस्करण स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं कर रहे हैं । हाल ही में यह पता चला कि एर निवासी अणुओं के साथ गैर शास्त्रीय endosomes सीपी३४के लिए जिंमेदार थे, लेकिन इन सेलुलर डिब्बों पतित थे । अलग और सेलुलर डिब्बों को शुद्ध करने में कठिनाई इस तथ्य के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है कि exogenous एंटीजन दोनों endosome और एर-तरह डिब्बों में स्थानीयकृत रहे हैं और यह है कि इन endocytic डिब्बों के लिए कोई पहचान अणु है अन्य exogenous एंटीजन से. हालांकि, ERAD-जैसे परिवहन के दौर से गुजर exogenous एंटीजन की हालत स्थिर राज्य से अलग है; लिपिड bimolecular झिल्ली के पार परिवहन में, exogenous एंटीजन translocons, जैसे Sec61 (चित्रा 2a) के माध्यम से झिल्ली घुसना । इस प्रकार, जब एक exogenous प्रतिजन के रूप में bOVA का उपयोग कर, bOVA Sec61 के साथ जुड़ा होना चाहिए । के बाद से झिल्ली से जुड़े bOVA विशेष रूप से एसए, डीसी 2.4, जो bOVA के साथ इलाज किया गया था से तैयार microsome, विशिष्ट एसए-चुंबकीय मोती (चित्रा 2a) द्वारा पृथक किया जा सकता है । तब के साथ या बिना bOVA की पूर्व मशीन शुद्ध microsomes से प्रोटीन की बराबर मात्रा एसडीएस द्वारा हल किया गया-पृष्ठ चांदी धुंधला और एसए के साथ पश्चिमी सोख्ता-एचआरपी (चित्रा बी2, 2c) के बाद । के रूप में चित्रा 2 बी और चित्रा 2cमें दिखाया गया है, अलग microsomes कई अद्वितीय प्रोटीन है कि exogenously पर निर्भर शुद्ध थे निहित bOVA और एसए-चुंबकीय मोती जोड़ा । इन अद्वितीय प्रोटीन के अलावा, पृथक microsomes भी गैर विशिष्ट प्रोटीन है, जो के साथ या bOVA के बिना एसए-चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य निहित । चुंबक द्वारा शुद्धि से पहले trypsin के साथ microsome के उपचार microsomes (चित्रा 2d) की शुद्धि को रोका, यह दर्शाता है कि शुद्धि तरीकों झिल्ली मर्मज्ञ bOVA की उपस्थिति पर निर्भर ।

शुद्ध microsomes में शामिल bOVA को ubiquitinate करने की क्षमता को दिखाया गया है इन विट्रो मेंआरएलएस की उपस्थिति (चित्रा 3) के तहत । bOVA और पाली-ubiquitinated bOVA की मात्रा MG132 (चित्र बी) की उपस्थिति में संवर्धित किया गया था, यह दर्शाता है कि शामिल bOVA ERAD प्रणाली द्वारा संसाधित किया गया था और है कि हमारे शुद्ध microsomes ERAD मशीनरी प्रोटीन निहित.

Figure 1
चित्र 1: dc में सीपी के लिए Intracellular मार्ग. dc में, exogenous एंटीजन को गैर-शास्त्रीय endocytic डिब्बों में पहुँचाया जाता है, जिसमें शास्त्रीय स्वर्गीय endosome के अणुओं के अलावा ईआर-निवासी अणु भी होते हैं. इस डिब्बे में exogenous एंटीजन Sec61 जैसे translocons के माध्यम से cytosol में निर्यात किया जाता है । cytosol में, exogenous एंटीजन ubiquitin-proteasome सिस्टम द्वारा प्रतिजनी पेप्टाइड्स में ERAD सब्सट्रेट्स के रूप में संसाधित किए जाते हैं । प्रतिजनी पेप्टाइड्स एक ही या आसंन गैर शास्त्रीय endocytic डिब्बों में ले जाया जाता है, या नल ट्रांसपोर्टर के माध्यम से आसंन एर और फिर MHC मैं पीएलसी द्वारा अणुओं पर लोड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: bOVA जाणे ERAD के साथ Microsomes का शुद्धिकरण । (क) bOVA जाणे ERAD के साथ microsomes के शुद्धिकरण का एक योजनाबद्ध मॉडल. bOVA Sec61 translocon के माध्यम से झिल्ली के साथ जुड़ा हुआ है और एसए के साथ लक्षित-चुंबकीय मोती । (B) के साथ Microsomes (+) या बिना (-) bOVA के पूर्व इसके अतिरिक्त (+) या बिना (-) एसए-चुंबकीय मोतियों से शुद्ध थे । प्रोटीन (2 µ जी) या शुद्ध प्रोटीन की इसी मात्रा ७.५-15% एसडीएस-पृष्ठ पर हल किया गया था, और चांदी धुंधला प्रोटीन बैंड कल्पना करने के लिए प्रयोग की जाती थी । दाईं ओर त्रिकोण गैर विशिष्ट प्रोटीन के लिए बाध्यकारी एसए-चुंबकीय मोतियों से संकेत मिलता है । तारे के साथ त्रिकोण अद्वितीय प्रोटीन exogenously की उपस्थिति में पाया संकेत मिलता है bOVA और एसए-चुंबकीय मोती जोड़ा । तीर bOVA दिखाता है । (ग) के साथ Microsomes (+) या बिना (-) bOVA के पूर्व इसके साथ शुद्ध थे (+) या बिना (-) सा चुंबकीय मोती । प्रोटीन (10 µ ग्राम) या शुद्ध प्रोटीन की इसी मात्रा ७.५-15% एसडीएस-पृष्ठ पर हल किया गया था, और एसए के साथ पश्चिमी सोख्ता के अधीन-एचआरपी । पीएनएस: पद-नाभिकीय अंश । सही में तारांकन चिह्न SA-एचआरपी के साथ गैर-विशिष्ट बैंड का संकेत देता है । समकक्ष परिणाम कम से तीन स्वतंत्र परख द्वारा प्राप्त किया गया । (D) bOVA के पूर्व के साथ Microsomes सा-चुंबकीय मोतियों के साथ शुद्ध थे । Microsomes के साथ इलाज किया गया (+) या बिना (-) trypsin और TX-१०० शुद्धि से पहले (दो लेन छोड़ दिया) या शुद्धि के बाद (सही दो लेन) । प्रोटीन (2 µ जी) या शुद्ध प्रोटीन की इसी मात्रा ७.५-15% एसडीएस-पृष्ठ पर हल किया गया था, और चांदी धुंधला प्रोटीन बैंड कल्पना करने के लिए प्रयोग की जाती थी । दाईं ओर त्रिकोण गैर विशिष्ट प्रोटीन के लिए बाध्यकारी एसए-चुंबकीय मोतियों से संकेत मिलता है । तारे के साथ त्रिकोण अद्वितीय प्रोटीन exogenously की उपस्थिति में पाया संकेत मिलता है bOVA और एसए-चुंबकीय मोती जोड़ा । समकक्ष परिणाम कम से तीन स्वतंत्र परख द्वारा प्राप्त किया गया । संदर्भ28से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: इन विट्रो पुनर्गठन के प्रसंस्करण और Ubiquitination का उपयोग कर ओवा में शुद्ध Microsomes. (क) के साथ शुद्ध microsomes (+) या बिना (-) bOVA के पूर्व अतिरिक्त (+) के साथ या बिना (-) आरएल और झंडा-1 एच के लिए यूबी और TNE का उपयोग solubilized थे के साथ इलाज किया गया । bOVA सा चुंबकीय मोतियों के साथ शुद्ध और संकेत एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता के अधीन था । सही में तारांकन चिह्न SA-एचआरपी के साथ गैर-विशिष्ट बैंड का संकेत देता है । समकक्ष परिणाम कम से तीन स्वतंत्र परख द्वारा प्राप्त किया गया । (ख) शुद्ध microsomes (+) के साथ या बिना (-) आरएल, झंडा-यूबी, और MG132 1 ज के लिए इलाज किया गया और फिर TNE का उपयोग कर solubilized थे । bOVA सा-चुंबकीय मोतियों के साथ शुद्ध और एसए ध्वज के साथ पश्चिमी सोख्ता के अधीन था । सही में तारांकन चिह्न SA-एचआरपी के साथ गैर-विशिष्ट बैंड का संकेत देता है । समकक्ष परिणाम कम से तीन स्वतंत्र परख द्वारा प्राप्त किया गया । permissio के साथ पुनर्मुद्रितn संदर्भ28से । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

सीपी के पिछले अध्ययनों में शामिल exogenous एंटीजन देर से endosome या ईआर के प्रतिबंधित क्षेत्र में संचित immunofluorescent माइक्रोस्कोपी16,30,31,३२. यह अनुमान है कि ERAD परिवहन और exogenous एंटीजन के प्रसंस्करण की तरह ईआर या देर से endosome के इन विशेष क्षेत्रों में किया जाता है, के रूप में सेलुलर डिब्बा सुक्रोज या iodixanol घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा की पहचान की थी ubiquitinated bOVA एक ERAD के रूप में प्रसंस्करण मार्कर की तरह । उनके जंमजात प्रतिरक्षा उत्तेजक के बाद, वाणिज्यिक पत्र दक्षता काफी बढ़ गई है, और ubiquitinated bOVA के साथ bOVA के लिए पीक अंश एक उच्च घनत्व अंश (हमारे अप्रकाशित परिणाम) के लिए चले गए । इन प्रयोगों का उद्देश्य एर या देर endosome, जो bOVA या ubiquitinated bOVA के साथ एक साथ चले गए के लिए विशिष्ट आणविक मार्करों की पहचान करने के लिए थे । लेकिन परिणामों में, दोनों एर निवासी अणुओं और स्वर्गीय endosome निवासी अणुओं bOVA और ubiquitinated bOVA के साथ एक साथ चले गए, यह दर्शाता है कि इन प्रयोगों ERAD के लिए सेलुलर डिब्बे का पता लगाने में असफल रहे थे जैसे परिवहन और शास्त्रीय एर या देर endosome के रूप में प्रसंस्करण । इन प्रयोगों में bOVA या ubiquitinated bOVA को छोड़कर endocytotic के डिब्बों में कोई विशिष्ट अणु नहीं थे. हालांकि, जबकि exogenous प्रतिजन ERAD परिवहन की तरह, इन अणुओं translocons के माध्यम से एर की लिपिड bilayer झिल्ली में प्रवेश, जैसे Sec61 परिसर (चित्रा 1, चित्रा 2a) । झिल्ली चिपके हुए bOVA endocytic डिब्बों के एक मार्कर के रूप में चुना गया था, और microsomes एसए-चुंबकीय मोती (चित्रा 2a, बी) द्वारा शुद्ध थे । इन शुद्ध microsomes में, संचित bOVA ERAD भर में आया था-ubiquitination की तरह और प्रसंस्करण आर एल और इन विट्रो में एटीपी की उपस्थिति के तहत (चित्र 3ए, बी) । के बाद से आर एल सभी cytosolic आणविक apparati, जैसे ubiquitination से संबंधित अणुओं और proteasomes अनुवाद और प्रतिलेखन के लिए अणुओं के अलावा में शामिल हैं, आरएल के अलावा ubiquitination के bOVA में शुद्ध microsome में सक्षम बनाता है । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि शुद्ध microsomes ERAD-जैसे परिवहन और exogenous प्रतिजनों के प्रसंस्करण के लिए उद्देश्य सेलुलर डिब्बों थे, दोनों endosome विशिष्ट अणुओं और एर निवासी अणुओं एक ही समय में शामिल; Lamp1 शुद्ध microsome में दोनों अग्रदूत और परिपक्व रूपों दिखाया ।

इस प्रोटोकॉल झिल्ली मर्मज्ञ exogenous एंटीजन की मात्रा पर निर्भर है; यह exogenous एंटीजन के लिए पर्याप्त डीसी 2.4 कोशिकाओं है, जो अर्द्ध-धाराप्रवाह राज्य में exogenous एंटीजन को शामिल करने के लिए एक उच्च क्षमता से पता चलता है को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है । bOVA के साथ डीसी 2.4 के लिए 6-12 एच मशीन समय बढ़ाना शामिल bOVA की राशि बढ़ जाती है । proteasomes, MG132 या lactacystin के लिए अवरोधकों के अलावा, मामूली शुद्ध microsomes की मात्रा बढ़ जाती है । microsome की तैयारी इस प्रोटोकॉल के लिए सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है । नि: शुल्क bOVA, जो डीसी 2.4 कोशिकाओं में शामिल नहीं है, पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने से हटा दिया जाना चाहिए, गैर विशेष microsome अंश को मुक्त bOVA के बंधन को रोकने के लिए । झिल्ली के डिब्बों पर नुकसान को कम करने के लिए, कोशिकाओं को ध्यान से बर्फ के पानी में Dounce homogenizer द्वारा बाधित कर रहे हैं । तब टूटी हुई कोशिकाओं और नाभिक के रूप में microsomes के बाद परमाणु अंश से तैयार किए गए थे केंद्रापसारक द्वारा हटा दिया गया । microsomes की तैयारी के बाद, एसए-चुंबकीय मोतियों द्वारा एक कदम शुद्धि बाहर किया जाता है । इस कदम में, चुंबक बाध्य microsome के सावधान धोने के लिए अंय सेलुलर डिब्बों के गैर विशिष्ट बाध्यकारी हटाने और विशेष रूप से बाध्य microsome खोना नहीं करने के लिए आवश्यक है ।

इस एक कदम शुद्धि विधि में, लक्ष्य microsome का एक महत्वपूर्ण प्रतिशत की आवश्यकता है । यदि उद्देश्य microsome का अनुपात बहुत छोटा है, शुद्ध लक्ष्य microsome की राशि अंय सेलुलर डिब्बों के गैर विशिष्ट बंधन के साथ प्रतिस्पर्धा के द्वारा कम हो जाती है । नतीजतन, उन शर्तों के तहत, लक्ष्य microsome के संवर्धन और गैर विशिष्ट microsome की मंजूरी की आवश्यकता होगी । यह भी एसए-चुंबकीय मोतियों द्वारा शुद्धि से पहले अतिरिक्त कदम लागू करने के लिए संभव है । ऐसा ही एक कदम microsome के सुक्रोज या iodixanol घनत्व ढाल केंद्रापसारक है । के बाद से तैयार microsomes सभी झिल्ली उत्पादों होते हैं, यह संभव हो सकता है एसए से पहले लक्ष्य microsome को समृद्ध करने के चुंबकीय मोती शुद्धिकरण के लिए प्रतिजन अमीर भागों का चयन करके । एक और संभव कदम पूर्व नियंत्रण द्वारा microsome की मंजूरी है-एसए के बिना चुंबकीय मोतियों, गैर-एसए चुंबकीय मोतियों के खिलाफ microsomes के विशिष्ट पृष्ठभूमि संघों को कम करने के लिए । इन प्रयोगों में, दोनों कदम microsome प्रभावी ढंग से लक्ष्य की शुद्धता में सुधार, लेकिन शुद्ध उत्पादों की कुल राशि कम, इन अतिरिक्त चरणों का संकेत आगे प्रयोगों के साधन के रूप में चुना जाता है.

यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि उच्च गति केंद्रापसारक संलयन या intracellular बुलबुले के थक्के पैदा करने के लिए दिखाया गया है । इन फ्यूजन या थक्के कृत्रिम microsomes, जो organelle-व्युत्पन्न बुलबुले के विभिन्न प्रकार के बीच गैर विशिष्ट बातचीत से प्राप्त कर रहे हैं उत्पादन होगा । इन कृत्रिम microsomes सांख्यिकीय इस तरह के mitochondrial निवासी अणु, Golgi तंत्र निवासी अणु, आदिके रूप में हर झिल्ली अणु होते हैं । इन शुद्ध microsomes में caveosome निवासी प्रोटीन, Golgi तंत्र निवासी प्रोटीन, या अर्ली endosome-निवासी प्रोटीन्स शामिल नहीं थे, जैसे caveolin1, GM130, और EEA1, जो यह दर्शाता है कि SA-शुद्धि microsomes कृत्रिम उत्पाद नहीं हैं बुलबुले के विभिंन प्रकार के बीच संलयन से व्युत्पंन । उच्च गति केंद्रापसारक के बिना, bOVA चिपके हुए बुलबुले अलग थे, लेकिन bOVA के बिना बुलबुले से नियंत्रण प्रयोगों गैर विशिष्ट अणुओं की अधिक मात्रा में दिखाया । यह इंगित करता है कि इस प्रारंभिक विधि लगातार प्रयोगों के लिए अपर्याप्त है और यह है कि उच्च गति केंद्रापसारक कदम इस शुद्धि प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है ।

यह प्रोटोकॉल अंय कक्ष प्रकारों, जैसे भिंन DC सबसेट्स, या अंय APCs पर लागू होता है । विभिन्ना स्थितियों में exogenous एंटीजन जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन्स, प्रतिजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स, मोतियों का बाउंड एंटीजन आदिका उपयोग करना भी संभव है । इसके अलावा, हम लक्ष्य microsomes exogenous एंटीजन के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर शुद्ध कर सकते हैं । यद्यपि कई अतिरिक्त चरणों या संशोधनों के लिए इस प्रोटोकॉल को अंय कक्षों और एंटीजन पर लागू करने की आवश्यकता हो सकती है, यह proteasome-निर्भर सीपी के आणविक तंत्र को विभिन्न प्रयोगों के बीच शुद्ध अणुओं की तुलना करके स्पष्ट कर सकता है । इस प्रकार, वर्णित प्रोटोकॉल संशोधन और सुधार के लिए कमरा है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को Takasaki यूनिवर्सिटी ऑफ हेल्थ एंड वेलफेयर ने सपोर्ट किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum Equitech bio SFB30
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine gibco by life technologies 25030-164
Penisicillin-Sreptomycin gibco by life technologies 15140-122
DMEM gibco by life technologies 12100-46
OVA SIGMA A5503
Biotin-protein labelling kit Thermo Fisher Scientific F6347
MG-132 Santa Cruz Biotechnology 201270
lactacystin SIGMA L6785
Dounce homogenizer IUCHI 131703
protease inhibitor cocktails SIGMA P8340
iodixanol Cosmo bio 1114542
SA-magnetic beads New England Biolabs 201270
control magnetic beads Chemagen M-PVA012
magnetic stand BD Biosciences 552311
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23225
silver staining kits Cosmo bio 423413
Reticulocyte Lysate Promega 1730714
Flag-tagged ubiquitin SIGMA U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse) Antibody Shop HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse) MBL D058−3
anti-Flag (mouse) SIGMA F3165
trypsin SIGMA 85450C

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२६ वृक्ष कक्ष endoplasmic जालिका-सम्बद्ध ह्रास पार-प्रस्तुति प्रमुख histocompatibility वर्ग I translocon ubiquitin
Endoplasmic जालिका के लिए झिल्ली के डिब्बे की शुद्धि-परस्पर प्रस्तुति में Exogenous एंटीजन के जुड़े क्षरण
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Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation. J. Vis. Exp. (126), e55949, doi:10.3791/55949 (2017).

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