Summary
Den metod som beskrivs här är en ny vesikler isolering protokoll, vilket tillåter för rening av de cellulära fack där exogena antigen bearbetas av endoplasmatiska nätverket-associerade nedbrytning i cross-presentation.
Abstract
Dendritiska celler (DCs) är mycket kapabel för bearbetning och presentation av internaliserade exogena antigen vid större histocompatibility klass (MHC) jag molekyler kallas även cross-presentation (CP). CP spelar en viktig roll inte bara i stimulering av naiva CD8+ T celler och minne CD8+ T-celler för smittsamma och tumör immunitet men också i inaktivering av självverkande naiva T-celler T cell anergi eller T cell radering. Även om den kritiska molekylära mekanismen av CP återstår belysas, indikerar ackumulerande bevis att exogena antigen bearbetas via endoplasmatiska nätverket-associerade nedbrytning (ERAD) efter export från icke-klassisk endocytic fack. Tills nyligen, var karakteriseringar av dessa endocytic avdelningar begränsade eftersom det fanns inga specifika molekylära markörer än exogena antigen. Den metod som beskrivs här är en ny vesikler isolering protokoll, vilket tillåter för rening av dessa endocytic fack. Använder denna renat levermikrosom, beredas vi den ERAD-liknande transporter, ubikvitinering och bearbetning av exogena antigen i vitrotyder på att den ubiquitin-proteasomsystemet bearbetas den exogena antigenen efter export från denna mobilfack. Detta protokoll kan tillämpas vidare till andra celltyper att klargöra den molekylära mekanismen av CP.
Introduction
MHC jag molekyler som uttrycks på ytan av alla kärnförsedda celler, med korta antigena peptider som härrör från endogena antigener, som behandlas av den ubiquitin-proteasomsystemet i cytosolen1. Efter bearbetning transporteras antigena peptider i endoplasmatiska nätverket (ER) lumen av peptid transportören TAP. En rad specifika chaperones bistå ER lumen, peptid lastning och den rätta vikningen av MHC I komplexa. Denna serie av molekyler kallas peptid-lastning komplexet (PLC), vilket indikerar att akuten är ett centralt kompartment för peptid lastning på MHC jag2. Efter lastning, peptiden till MHC jag molekyler transporteras till cellytan och spela en nyckelroll i det adaptiva immunsystemet som själv markörer och möjliggör CD8+ cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) att upptäcka cancerceller eller infektiösa agens av antigen peptider från icke-själv proteiner3.
I antigenpresenterande celler (APC), antigen peptider från exogena antigen är också presenteras på MHC jag4,5,6,7,8 via CP, som bärs främst ut av DCs9,10,11. CP är viktigt både för aktivering av naiva CD8+ T celler och minne CD8+ T celler in i anti-infektiösa och anti-tumoral CTL12,13, och i underhållet av immuntolerans av det inactivating av själv tillförordnade naiva T-celler14,15. CP spelar många viktiga roller i det adaptiva immunsystemet, men molekylära mekanismer för CP har ännu inte beskrivas i detalj. Tidigare studier av CP avslöjade att exogena antigen var lokaliserade både ER och endosome och bearbetades av ERAD, vilket tyder på att exogena antigen transporteras från endosome till ER för ERAD-liknande bearbetning och peptid som laddar16 . Ackumulerande bevis tyder dock på att peptid lastning av CP utförs inte i ER utan snarare i icke-klassisk endocytic fack, som också har särdrag av ER (figur 1)17,18 ,19,20,21. För att undvika nedbrytning av antigena peptid prekursorer av hög aktivitet av aminopeptidase uppstår22 i cytosolen, bearbetning och peptid lastning i CP i området proximalt i dessa icke-klassisk endocytic fack (figur 1). Även karakteriseringar av dessa endocytic fack är kontroversiell, finns det inga befintliga specifika molekyler än exogena antigen i detta fack.
ERAD är en cellulär väg, som specifikt tar bort felveckning proteiner från ER. I ERAD väg, felveckning proteiner retrogradely transporteras genom ER membranet till cytoplasman och bearbetas av ubiquitin-proteasom systemet23,24,25. När stora molekyler, såsom proteiner, transporteras genom den lipid lipidens, dessa molekyler passera en molekylär apparat som kallas en translocon, såsom Sec61 komplex och Derlin komplex i den ER26, och Tom komplexa och Tim komplex i den mitokondrier27. När exogent-lade antigener transporteras genom ER membranet, måste de tränger den lipid lipidens i komplex med translocons, såsom Sec61 komplexet. Den metod som beskrivs här renas det riktade vesikler genom att utnyttja dessa membran-penetrerande molekyler som markörer för endocytic facken.
Den metod som beskrivs här är ett nytt vesikler rening protokoll med hjälp av DC-liknande cell linje DC2.428 och biotinylerade äggalbumin (bOVA) som exogena antigen. Endocytic facken var renas genom streptividin (SA)-magnetiska pärlor med den membran-penetrerande bOVA som en maker. I denna renat levermikrosom, lite extra exogent bOVA var fortfarande finns bevarade i membran fraktioner men var transporteras till utsidan av levermikrosom, och sedan ubiquitineras och bearbetas i vitro29. Denna renade levermikrosom innehöll inte bara endocytic fack-specifika proteiner, utan också ER boförälder proteiner för ERAD och peptiden lastning komplex; tyder på att mobilfack är det blivande endocytic facket för CP29. Detta protokoll är inte beroende av vilken typ av exogena antigen, och är även tillämplig för andra DC underdelar och andra celltyper, såsom makrofager, B-celler och endotelceller, att klarlägga den exakta molekylära mekanismen av DCs för skickliga CP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. växande celler och tillägg av exogena antigen
- Förbered bOVA använder en biotin-protein märkning kit efter tillverkaren ' s protokollet.
Obs: Normalt, bOVA innehåller 2 M biotin per 1 M ägg genomsnitt. - Växer DC2.4 celler i RPMI-1640 kompletteras med 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 0,1 mM onödiga aminosyror, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 55 mM 2-merkaptoetanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) och 10% fetalt kalvserum (härefter RPMI) vid 37 ° C i 5 % CO 2 i en fuktad inkubator (härefter utan omnämnande, cellerna inkuberas vid detta tillstånd). Det är också möjligt att använda DMEM kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 3,7 g/L NaHCO 3 (härefter DMEM) i stället för RPMI.
- En dag före rening, dela upp cellerna i RPMI till 1 x 10 5 celler/mL i en vävnadskultur tallrik. Undvik att hålla cellerna på en konfluenta tillstånd. DC2.4 celler kan mycket införliva exogena antigen tills en semi konfluenta stat, men snabbt förlora förmågan efter att nå en över konfluenta tillstånd.
- Innan the DC2.4 celler är semi konfluenta, tillsätt 250 µg/mL bOVA för 1 x 10 6 celler/mL och inkubera i 2-4 h.
Obs: Under nedströms experiment, alla buffertar och reagenser hålls vid 4 ° C om inte annat anges.
2. Beredning av mikrosomer
- skörda DC2.4 cellerna av mild pipett från vävnad plattan till en 50 mL konisk reservrör.
- Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min, 4 ° C och ta försiktigt bort medlet med bOVA genom aspiration.
- Tvätta DC2.4 cellerna två gånger med 40 mL PBS-bufferten (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2.68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 min, 4 ° C och kasta bort supernatanten varje gång av aspiration.
- Återsuspendera pelleten i steg 2,3 i 1-2 mL (1/20-1/10 volym av odlingsmedium) homogenisering medium (0,25 M sackaros, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7,4]) med 1/1 000 volym av proteas hämmare cocktails och överföra den återsuspenderade DC2.4 celler i en iskall Dounce Homogenisatorer.
- Störa återsuspenderade DC2.4 cellerna försiktigt med 10-20 slag med iskall Dounce homogenisatorn.
Obs: Under störningar steg, kyls den Dounce homogenisatorn på ice. - Överför cell-stört till 15 mL koniska reservrör.
- Lägg till 8-9 mL homogenisering medium till 10 mL totalt och centrifugera koniska röret under 10 minuter vid 2000 x g och 4 ° C.
- Överför supernatanten till en ny 15 mL koniska tub ta bort obruten celler och kärnor, och centrifugera koniska röret igen under 10 minuter vid 2000 x g och 4 ° C.
- Överför supernatanten till en ny ultracentrifugering tub och Centrifugera i 45 min på 100 000 x g och 4 ° C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten försiktigt i 1-2 mL homogenisering medium med 1/1 000 volym av proteas hämmare cocktails av pipettering lösningen upp och ner flera gånger att göra en levermikrosom bråkdel för nedströms experiment.
- Överför den levermikrosom fraktionen till en ny 5-mL rund botten tub.
Observera: Efter detta steg, är det möjligt att berika objektiva mikrosomer iodixanol täthet lutning centrifugering enligt tillverkaren ' s-protokollet, att ta bort icke-specifik mikrosomer. Topp fraktioner för exogena antigen samlas in och sedan genomgå nästa steg i reningen (steg 3).
3. Rening av mikrosomer med bOVA genomgår ERAD
- Lägg till 1/100 volym av färska SA-magnetiska pärlor till den levermikrosom fraktionen av steg 2.11 i 5 mL rund botten tube.
Obs: Innan detta steg, det är möjligt att klara före den levermikrosom fraktionen av kontroll-magnetiska pärlor att minska föroreningar av icke-specifika mikrosomer. - Försiktigt blanda väl och rotera rund botten röret sakta i 30 minuter vid 4 ° C.
- Lägg till 2-3 mL homogenisering medium till 4 mL totalt i rund botten röret och blanda försiktigt väl.
- Placera rund botten röret på en magnetisk stå och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C. Eftersom pärlorna bunden till blåsor dras till magneten, brun mikro-pärlor kommer gradvis ackumuleras till närmast magneten rörväggen.
- Med röret kvar i magnetiska stativet, noggrant kasta supernatanterna av strävan att ta bort de obundna vesicles.
- Tvätta de magnetiska pärlorna bunden till blåsor två gånger med 5 mL av homogenisering medium av den magnetiska stå i 10 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten varje gång av noggrant aspiration.
Obs: Utan magnetiska stativ, rening av centrifugations vid 2000 x g i 10 min, 4 ° C är också tillgänglig. - Omsuspendera magnetiska pärlor bunden till blåsor noggrant i 100 µL homogenisering medium av pipettering lösningen upp och ner flera gånger.
- Överför de återsuspenderade blåsor till en ny mikrorör som den renade levermikrosom för nedströms experiment.
Obs: Vanligtvis 50 µL levermikrosom fraktion som innehåller 5-20 µg proteiner från 1 x 10 7 celler kan isoleras.
4. Analys av den renade mikrosomer
- Omsuspendera magnetiska pärlor bunden till blåsor från steg 3,8 för 100-200 µL av TNE buffert (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1% Nonidet p-40) med 1/1 000 volym av proteas hämmare cocktails i stället för homogenisering mediet.
- Överför den lysate från steg 4.1 till en ny 1,5 mL mikrorör.
- Att bestämma steg 4,2 proteinkoncentration med hjälp av ett BCA assay kit per tillverkaren ' s protokollet.
Obs: 5 – 10 µL lysat från steg 4,2 är vanligtvis tillräckligt för att avgöra proteinkoncentration. - Överför den lysate från steg 4,2 (2 µg av protein för silverfärgning och 10 µg av protein för Western blotting) till nya mikrorör.
- Pålagt en värme blocket vid 95 ° C och koka upp proteiner i 1 x SDS gel-lastning buffert mikrorör (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Ditiotreitol, 4% SDS, 0,2% bromophenol blå, 20% glycerol) för 5 min.
- Centrifugera mikrorör för 10 min vid 21 500 x g och 4 ° C. samla supernatanterna i nya mikrorör ta bort olösligt fraktioner.
- Analysera lösta proteinerna i steg 4,6 (2 µg) av standard SD-.
- Visualisera protein band av silver färgning med silverfärgning kit efter tillverkaren ' s protokollet.
- Analysera lösta proteinerna i steg 4,6 (10 µg) av standard SD-PAGE och Western-analys. Använd reagens (SA-HRP) per tillverkaren ' s protokoll och visualisera av fluorography.
5. In Vitro Beredning av ERAD ubikvitinering av bOVA använder renat mikrosomer
- överföring renat mikrosomer (5-10 µg av protein) från steg 3.8 med 50% volym av retikulocyter lysate (RL), 1 x reaktion buffert (50 mM Tris pH 7,4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl (2), och 0.2 pM flagga-taggade ubiquitin i en ny mikrorör. Den avslutande volymen i detta experiment är 20-40 µL.
- Inkubera i mikrorör för 2 h vid 37 ° C.
Obs: Om mängden ubiquitineras bOVA i steg 5.12 är för liten för att upptäcka genom Western blotting, lägga till 10 µM av MG132 eller 2 µM av lactacystin hämma behandlingen av ubiquitineras bOVA av proteasomen. - Stoppa reaktionen genom att placera mikroröret på ice.
- Lösa mikrosomer genom att lägga till 500 µL TNE buffert med 1/1 000 volym av proteas hämmare cocktails.
- Mikroröret Centrifugera i 10 min vid 21,500 x g- och 4 ° C. samla supernatanterna i en ny mikrorör ta bort olösligt fraktioner, som innehålla ubiquitineras bOVA i DC2.4 innan ubikvitinering in vitro- analysens.
- Överför supernatanten till ett nytt mikrorör och tillsätt 1/100 volym av nya SA-magnetiska pärlor (vanligtvis 5 µL för 500 µL av supernatanterna).
- Försiktigt blanda väl och rotera mikroröret långsamt under 30 minuter vid 4 ° C.
- Centrifugera mikroröret för 10 min vid 21 500 x g och 4 ° C. Kassera supernatanten med strävan att återvinna bOVA och ubiquitineras bOVA bunden med SA-magnetiska pärlor.
- Tvätta två gånger de insamlade SA-magnetiska pärlorna med 1 mL av TNE buffert genom centrifugering i 10 min på 21 500 x g och 4 ° C. Kassera supernatanten varje gång av aspiration.
- Koka SA-magnetiska pärlor 1 x SDS gel lastning buffert för 5 min vid 95 ° C på en värme-block för att lösa de renade proteinerna av SA-magnetiska pärlor.
- Centrifugera mikroröret för 10 min vid 21 500 x g och 4 ° C. samla supernatanterna i en ny mikrorör ta bort olösligt fraktioner.
- Analysera SA-magnetiska pärlor bundna till proteiner av standard SD-sidan och Western-analys. Användning av antikroppar (anti-Flag, anti-multi-Ub och antimus IgG-HRP) och reagens (SA-HRP) är per tillverkaren ' s-protokollet och visualiseras av fluorography.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att belysa den molekylära mekanismen av CP, är det nödvändigt att identifiera de cellulära fack, där exogena antigen genomgår ERAD-liknande transporter och bearbetning. Samtidigt observationer av Immunofluorescerande mikroskopi eller elektronmikroskopi identifieras de mobilfack där exogena antigen ackumulerade16,17,18,19, 30,31,32,33, de cellulära fack för ERAD-liknande bearbetning av exogena antigen inte är tydligt definierade. Nyligen visades att icke-klassisk endosomes med ER bosatt molekyler var ansvariga för CP34, men dessa cellulära avdelningar var orenat. Det är svårighet att isolera och renande cellulära facken kan tillskrivas det faktum att exogena antigen är lokaliserade både i endosome och ER-liknande fack och det finns inga identifierande molekyl för dessa endocytic fack andra än exogena antigen. Villkora av exogena antigen genomgår ERAD-liknande transporter är dock olika från steady state; vid transport över lipid bimolecular membran, exogena antigen penetrera membranet via translocons, såsom Sec61 (figur 2A). Således, när du använder bOVA som exogena antigen, bOVA ska associeras med Sec61. Eftersom membran-associerade bOVA bundna specifikt med SA, kunde den levermikrosom beredd från DC2.4, som var förbehandlats med bOVA, isoleras tydligt av SA-magnetiska pärlor (figur 2A). Sedan löstes motsvarande mängder proteiner från renat mikrosomer med eller utan före inkubering av bOVA av SDS-PAGE följt av silverfärgning och Western blotting med SA-HRP (figur 2B, 2 C). Som visas i figur 2B och 2 c figur, innehöll de isolerade mikrosomer flera unika proteiner som var renat beroende av exogent extra bOVA och SA-magnetiska pärlor. Utöver dessa unika proteiner innehöll isolerade mikrosomer också ospecifik proteiner, som bundna till SA-magnetiska pärlor med eller utan bOVA. Behandling av levermikrosom med trypsin innan rening av magneten förhindra rening av mikrosomer (figur 2D), vilket indikerar att reningsmetoder berodde på förekomsten av membran-penetrerande bOVA.
De renade mikrosomer visade möjligheten att ubiquitinate den bolagiserade bOVA i vitro, under närvaro av RLs (figur 3A). Mängderna bOVA och poly-ubiquitineras bOVA utökades i närvaro av MG132 (figur 3B), vilket indikerar att den införlivas bOVA bearbetades av ERAD systemet och att vårt renade mikrosomer innehöll ERAD maskiner proteiner.
Figur 1: sockernivån för CP i DCs. I DCs transporteras exogena antigen i icke-klassisk endocytic fack, som även innehåller ER boförälder molekyler förutom molekyler av det klassiskt sena endosome. I kupén är exporteras exogena antigen in cytosol genom translocons såsom Sec61. I cytosolen bearbetas exogena antigen av den ubiquitin-proteasomsystemet till antigena peptider som ERAD substrat. Antigena peptider transporteras till samma eller intilliggande icke-klassisk endocytic fack eller intilliggande ER genom tryck på transportören och sedan lastas på MHC jag molekyler av PLC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: rening av mikrosomer med bOVA genomgår ERAD. (A) A Schematisk modell av rening av mikrosomer med bOVA genomgår ERAD. bOVA associeras med membranet genom den Sec61 translocon och riktade med SA-magnetiska pärlor. (B) mikrosomer med (+) eller utan (-) före tillsats av bOVA blev renat med (+) eller utan (-) SA-magnetiska pärlor. Proteiner (2 µg) eller motsvarande volymer av renade proteiner löstes på 7,5-15% SDS-PAGE och silverfärgning användes för att visualisera protein band. Trianglar på höger sida visar ospecifik proteiner binder till SA-magnetiska pärlor. Trianglar med asterisker visar unika proteiner som finns endast i närvaro av exogent extra bOVA och SA-magnetiska pärlor. Pilen visar bOVA. (C) mikrosomer med (+) eller utan (-) före tillsats av bOVA blev renat med (+) eller utan (-) SA-magnetiska pärlor. Proteiner (10 µg) eller motsvarande volymer av renade proteiner var löst på 7,5-15% SDS-PAGE, och utsätts för Western blotting med SA-HRP. P.N.: efter kärnvapen fraktion. Asterisker i rätt ange icke-specifika band med SA-HRP. Likvärdiga resultat avlades av minst tre oberoende analyser. (D) mikrosomer med tidigare tillägg av bOVA blev renat med SA-magnetiska pärlor. Mikrosomer behandlades med (+) eller utan (-) trypsin och TX-100 före rening (vänster två körfält) eller efter rening (höger två körfält). Proteiner (2 µg) eller motsvarande volymer av renade proteiner löstes på 7,5-15% SDS-PAGE och silverfärgning användes för att visualisera protein band. Trianglar på höger sida visar ospecifik proteiner binder till SA-magnetiska pärlor. Trianglar med asterisker visar unika proteiner som finns endast i närvaro av exogent extra bOVA och SA-magnetiska pärlor. Likvärdiga resultat avlades av minst tre oberoende analyser. Omtryckt med tillåtelse från referens28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: In Vitro beredning av bearbetning och ubikvitinering använder ägg i renat mikrosomer. (A) renat mikrosomer med (+) eller utan (-) före tillsats av bOVA behandlades med (+) eller utan (-) RL och flagga-Ub för 1 h och var solubilized med TNE. bOVA var renas med SA-magnetiska pärlor och utsätts för Western blotting med de angivna antikropparna. Asterisker i rätt ange icke-specifika band med SA-HRP. Likvärdiga resultat avlades av minst tre oberoende analyser. (B) renat mikrosomer behandlades med (+) eller utan (-) RL, flagg-Ub och MG132 för 1 h och var sedan solubilized med TNE. bOVA var renas med SA-magnetiska pärlor och utsätts för Western blotting med SA-flagga. Asterisker i rätt ange icke-specifika band med SA-HRP. Likvärdiga resultat avlades av minst tre oberoende analyser. Omtryckt med behörighetn från referens28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I tidigare studier av CP ackumulerade de bolagiserade exogena antigenerna i det begränsade området av sena endosome eller ER av Immunofluorescerande mikroskopi16,30,31,32. Det uppskattas att ERAD-liknande transporter och bearbetning av exogena antigen genomförs i dessa specialiserade områden av ER eller sent endosome, som mobilfack identifierades av sackaros eller iodixanol täthet lutning centrifugering med hjälp ubiquitineras bOVA som en ERAD-liknande bearbetning markör. Efter stimulera deras medfödd immunitet, CP effektivitet ökade betydligt, och andelen peak för bOVA tillsammans med ubiquitineras bOVA migrerat till en högre densitet bråkdel (vår opublicerade resultat). Syftet med dessa experiment var att identifiera specifika molekylära markörer för ER eller sent endosome, som vandrat tillsammans med bOVA eller ubiquitineras bOVA. Men i resultaten, både ER bosatt molekyler och sena endosome-resident molekyler migrerats tillsammans med bOVA och ubiquitineras bOVA, vilket indikerar att dessa experiment misslyckades i att fastställa mobilfack ERAD-liknande transporter och bearbetning som klassiskt ER eller sena endosome. Dessa experiment fanns inga specifika molekyler i de endocytotic fack utom bOVA eller ubiquitineras bOVA. Men medan den exogena antigenen genomgick ERAD-liknande transporter, penetrerad dessa molekyler lipid lipidens membranet i ER genom translocons, såsom Sec61 komplexa (figur 1, figur 2A). Membranet sticker bOVA valdes som en markör för endocytic facken och mikrosomer var renat av SA-magnetiska pärlor (figur 2A, 2B). I dessa renat mikrosomer, ackumulerade bOVA kom över ERAD-liknande ubikvitinering och bearbetning under närvaro av RL och ATP i vitro (figur 3A, 3B). Eftersom RL innehåller alla cytosoliska molekylär apparati, till exempel ubikvitinering-relaterade molekyler och proteasomen förutom molekyler för översättnings- och transkriptionsavdelningen, kan tillägg av RL ubikvitinering av bOVA i renat levermikrosom. Dessa resultat indikerar att renat mikrosomer var de objektiva cellulära fack ERAD-liknande transport och behandling av exogena antigen, båda innehållande endosome-specifika molekyler och ER-resident molekyler samtidigt; Lamp1 visade både föregångare och mogna former i den renade levermikrosom.
Detta protokoll är beroende av mängden membran-penetrerande exogena antigen; Det är viktigt att införliva nog av de exogena antigen till DC2.4 celler, som visar en hög förmåga att införliva exogena antigen i semi konfluenta staten. Elongating 6-12 h inkubationstiden för DC2.4 med bOVA ökar mängden bildat bOVA. Tillägg av hämmare för proteasomen, MG132 eller lactacystin, ökar måttligt mängder renat mikrosomer. Utarbetandet av levermikrosom är en av de viktigaste stegen för detta protokoll. Den gratis bOVA, som inte införlivas i DC2.4 celler, bör tas bort genom att tvätta cellerna med PBS, att förhindra icke-specifik bindning av den gratis bOVA till den levermikrosom fraktionen. För att minska skador på membran fack, störs noggrant celler av Dounce homogenisatorn i isvatten. Sedan togs obruten celler och atomkärnor bort genom centrifugering som mikrosomer utarbetades den efter nukleära delen. Efter beredning av mikrosomer utförs one-step rening av SA-magnetiska pärlor. I det här steget krävs noggrann tvättning av den magnet bundna levermikrosom att ta bort icke-specifik bindning av andra cellulära fack och att inte förlora de specifikt bunden levermikrosom.
I detta steget reningsmetod krävs en betydande andel av de mål levermikrosom. Om förhållandet mellan den objektiva levermikrosom är för liten, minskar mängden renat mål levermikrosom av konkurrensen med icke-specifik bindning av andra cellulära fack. Följaktligen, under dessa förhållanden, rikedomar av i målet levermikrosom och clearance av den icke-specifik levermikrosom skulle krävas. Det är också möjligt att införa ytterligare steg innan rening av SA-magnetiska pärlor. Ett sådant steg är den sackaros eller iodixanol täthet lutning centrifugeringen av levermikrosom. Sedan de beredda mikrosomer innehåller alla membran produkter, skulle det vara möjligt att berika de mål levermikrosom innan SA-magnetiska pärlor rening genom att välja antigen rik fraktioner för rening. Ett annat möjligt steg är före avslutandet av levermikrosom av kontroll-magnetiska pärlor utan SA, att minska icke-specifik bakgrund sammanslutningar av mikrosomer mot SA-magnetiska pärlor. I dessa experiment, båda stegen bättre renhet i målet levermikrosom effektivt, men minskade den totala mängden renat produkter, som anger dessa ytterligare steg väljs som medel för ytterligare experiment.
Det är väl känt att höghastighetståg centrifugering har visat sig orsaka den fusion eller koagulering av intracellulära blåsor. Dessa fusioner eller clottings kommer att producera konstgjorda mikrosomer, som härrör från icke-specifik interaktionen mellan olika sorters organell-derived blåsor. Dessa konstgjorda mikrosomer innehåller statistiskt varje membran molekyl som mitokondrie bosatt molekyl, Golgiapparaten bosatt molekyl, etc. Dessa renat mikrosomer innehöll inte den caveosome bosatta proteiner, Golgiapparaten bosatt proteiner eller tidig endosome-resident-proteiner, såsom caveolin1, GM130 och EEA1, när de som anger att de SA-renat mikrosomer inte är konstgjorda produkter härrör från fusion bland olika sorters blåsor. Den snabba centrifugeringen, bOVA-sticker blåsor var isolerade utan kontroll experimenten från blåsor utan bOVA visade större mängder av icke-specifika molekyler. Detta indikerar att denna preliminära metod är otillräcklig för successiva experiment och att den snabba centrifugeringssteget är nödvändigt för denna rening-protokollet.
Detta protokoll gäller andra celltyper, till exempel olika DC undergrupper eller andra trupptransportfordon. Det är också möjligt att använda olika typer av exogena antigen i olika villkor, till exempel fluorescerande proteiner, antigen / antikroppkomplex, pärlor bunden antigener, etc. Dessutom kan vi rena målet mikrosomer med specifika antikroppar mot de exogena antigenerna. Även om flera ytterligare åtgärder eller ändringar kan vara skyldiga att tillämpa detta protokoll till andra celler och antigener, kan det klarlägga molekylära mekanismer för proteasom-beroende CP genom att jämföra de rena molekylerna bland olika experiment. Således har beskrivs protokollet utrymme för förändring och förbättring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Takasaki universitet av hälsa och välbefinnande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S.
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A.
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
