Summary
El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de los compartimentos celulares donde se procesan los antígenos exógenos por degradación retículo endoplasmático asociado en presentación cruzada.
Abstract
Las células dendríticas (DCs) son altamente capaces de procesar y presentar antígenos exógenos internalizados a clase principal de histocompatibilidad (MHC) las moléculas también conocido como Cruz-presentación (CP). CP desempeña un papel importante no sólo en la estimulación de la ingenua CD8+ T memoria CD8 y células+ T las células infecciosas e inmunidad del tumor sino también en la inactivación de automática ingenuo T células por anergia de células T o células T de supresión. Aunque el mecanismo molecular crítico de CP queda por ser aclarada, acumulando indicios que antígenos exógenos se procesan a través del retículo endoplasmático asociado degradación (ERAD) después de su exportación de no clásicas endocíticas compartimientos. Hasta hace poco, las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos fueron limitadas porque no había marcadores moleculares específicos distintos antígenos exógenos. El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de estos compartimentos endocíticos. Usando esta purificado microsoma, hemos reconstituido la ERAD-como transporte, ubiquitinación y procesamiento de los antígenos exógenos en vitro, sugiriendo que el sistema ubiquitina-proteasoma procesado el antígeno exógeno después de la exportación de este compartimiento celular. Este protocolo se puede aplicar más a otros tipos de células para aclarar el mecanismo molecular de CP.
Introduction
El MHC las moléculas se expresan en la superficie de todas las células nucleadas, con cortos péptidos antigénicos derivados de antígenos endógenos, que son procesados por el sistema ubiquitina-proteasoma en el citosol1. Después de procesar, se transportan péptidos antigénicos en el lumen del retículo endoplásmico (ER) por el transportador de péptidos TAP. En el lumen del re, una serie de chaperonas específicas ayudan a la carga del péptido y el plegamiento correcto del MHC I complejo. Esta serie de moléculas se llama el complejo de carga (PLC), que indica que el ER es un compartimiento central para péptido cargando al MHC y2. Después de la carga, de péptidos del MHC las moléculas son transportadas a la superficie de la célula y juega un papel clave en el sistema inmune adaptativo auto marcadores, como permite el CD8+ los linfocitos T citotóxicos (CTLs) para detectar células cancerosas o agentes infecciosos por antigénica péptidos de las proteínas del mismo3.
En el antígeno que presenta las células (APC), péptidos antigénicos de los antígenos exógenos son también presentados en MHC4,5,6,7,8 a través de CP, que es fundamentalmente por DCs9,10,11. CP es esencial tanto para la activación de ingenuo CD8+ T memoria CD8 y células+ T células antiinfecciosas y anti-tumoral CTLs12,13y en el mantenimiento de la tolerancia inmune mediante la inactivación de autoactuante ingenuo T células14,15. El CP juega un papel importante muchos en el sistema inmune adaptativo, sin embargo, los mecanismos moleculares de CP tienen todavía ser descrito en detalle. Estudios previos de CP revelaron que antígenos exógenos fueron localizados en el retículo endoplasmático y el endosome y fueron procesados por ERAD, lo que sugiere que los antígenos exógenos son transportados desde el endosome a ER para ERAD-como proceso y péptido carga16 . Sin embargo, evidencia acumulada indica que la carga de péptido de CP se realiza no en la sala de emergencia sino en compartimentos endocíticos no clásica, que también tienen características distintivas de la ER (figura 1)17,18 ,19,20,21. Para evitar la degradación de los precursores del péptido antigénico por la alta actividad de aminopeptidasa22 en el citosol, el procesamiento y el péptido carga en CP se produce en la zona proximal de estos compartimentos endocíticos no clásica (figura 1). Aunque las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos son polémicas, hay no hay moléculas específicas existentes distintos antígenos exógenos en este compartimiento.
ERAD es una vía celular, que elimina específicamente proteínas mal plegadas de la ER. En el camino ERAD, proteínas mal plegadas retrogradely son transportadas a través de la membrana del ER al citoplasma y procesadas por el sistema de ubiquitina-proteasoma23,24,25. Cuando las moléculas grandes, como las proteínas, son transportadas a través de la bicapa lipídica, estas moléculas pasan a través de un aparato molecular llamado un translocon, tales como el complejo Sec61 y Derlin complejo en el ER26y el complejo de Tom y Tim complejo en la las mitocondrias27. Cuando exógeno agregado antígenos son transportados a través de la membrana del ER, que deben penetrar la bicapa lipídica en complejo con translocons, como el complejo Sec61. El método descrito aquí purificada la vesícula específica mediante la utilización de estas moléculas de penetración de la membrana como marcadores para los compartimentos endocíticos.
El método descrito aquí es un nuevo protocolo de purificación de vesícula usando el celular de DC como línea DC2.428 y biotinilado ovoalbúmina (bOVA) como un antígeno exógeno. Los compartimentos endocíticos se purificaron por estreptavidina (SA)-granos magnéticos mediante la penetración de la membrana bOVA como fabricante. En esta purificado microsoma, algunos añaden exógenamente bOVA se conservan en fracciones de membrana pero se transporta al exterior del microsoma y entonces ubiquitinated, procesaron en vitro29. Este microsome purificada contiene proteínas específicas del compartimiento endocíticas, sino también proteínas ER residente para ERAD y el péptido carga compleja; lo que sugiere que el compartimiento celular el compartimiento endocítico prospectivo para CP29. Este protocolo no es dependiente en el tipo de antígenos exógenos y también es aplicable para otros subconjuntos de DC y otros tipos de células, como macrófagos, células B y las células endoteliales, para aclarar el mecanismo molecular exacto de DCs para perito CP.
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Protocol
1. cultivo de células y la adición de antígenos exógenos
bOVA- preparar utilizando un etiquetado de biotina-proteína kit siguiendo el fabricante ' Protocolo s.
Nota: Normalmente, bOVA contiene biotina de 2 M por 1 M huevos en promedio. - DC2.4 crecer las células en RPMI-1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 0.1 mM aminoácidos no esenciales, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 2-Mercaptoetanol de 55 mM, 10 mM HEPES (pH 7,5) y suero de ternera fetal 10% (en lo sucesivo RPMI) a 37 ° C en 5 % CO 2 en una incubadora humidificada (en lo sucesivo sin mención, las células se incuban en esta condición). También es posible utilizar DMEM suplementado con 10% de suero fetal de becerro, 3,7 g/L de NaHCO 3 (en adelante DMEM) en lugar del RPMI.
- Un día antes de la purificación, dividir las células en RPMI a 1 x 10 5 células/mL en una placa de cultivo de tejidos. Evitar mantener las células en un estado confluente. Las células DC2.4 pueden altamente incorporar antígenos exógenos hasta un estado semi-confluente, pero pierde rápidamente la capacidad después de alcanzar un estado de excesiva confluentes.
- Antes la DC2.4 las células son parcialmente confluentes, Añadir 250 μg/mL de bOVA para 1 x 10 6 células/mL e incube durante 2-4 h.
Nota: Durante los experimentos posteriores, todos los buffers y reactivos se mantienen a 4 ° C a menos que se indique lo contrario.
2. Preparación de los microsomas
- las células DC2.4 de la cosecha mediante pipeteo suave de la placa de tejido en un tubo cónico de 50 mL nuevo.
- Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min, 4 ° C y retirar cuidadosamente el medio con bOVA por la aspiración de.
- Lavar las DC2.4 las células dos veces con 40 mL de tampón PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min, 4 ° C y descarte el sobrenadante cada vez por la aspiración de. Células
- Resuspender el precipitado en el paso 2.3 en 1-2 mL (1/20-1/10 volumen de medio de cultivo) de homogeneización medio (0.25 M sacarosa, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) con el volumen de 1/1.000 de cócteles inhibidores de proteasa y transferencia DC2.4 resuspendidos en un helada homogeneizadores Dounce.
- Romper las células DC2.4 resuspendidas suavemente por 10-20 movimientos con la helada homogeneizadores Dounce.
Nota: Durante la etapa de interrupción, los homogeneizadores Dounce es enfriado en hielo. - La suspensión celular interrumpió la transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 mL.
- Medio de homogeneización de 8-9 mL total 10 mL y centrifugar el tubo cónico 10 min a 2.000 x g y 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 15 mL para eliminar las células intactas y núcleos y centrifugar el tubo cónico nuevamente durante 10 minutos a 2.000 x g y 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de ultracentrifugación y centrifugar durante 45 min a 100.000 x g y 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado cuidadosamente en 1-2 mL de medio de homogeneización con volumen de 1/1.000 de cócteles inhibidores de proteasa por pipetear la solución arriba y abajo varias veces para hacer una fracción del microsoma para experimentos posteriores.
- Transferencia de la fracción del microsoma en un nuevo tubo de fondo redondo 5 mL.
Nota: Después de este paso, es posible enriquecer los microsomas objetivo de iodixanol centrifugación gradiente de densidad según el fabricante ' protocolo de s, para quitar los microsomas no específicos. Las fracciones de pico para los antígenos exógenos son recogidas y luego sometidas al siguiente paso de purificación (paso 3).
3. Purificación de los microsomas con bOVA que ERAD
- Agregar de 1/100 volumen de frescos granos SA-magnéticos para la fracción del microsoma de paso 2.11 en 5 mL redondo tubo inferior.
Nota: Antes de este paso, es posible borrar previamente la fracción del microsoma por perlas de control magnético para reducir la contaminación de los microsomas no específico. - Mezclar bien suavemente y gire el tubo de fondo redondo despacio durante 30 minutos a 4 ° C.
- Añadir 2-3 mL de medio de homogeneización total 4 ml en el tubo de fondo redondo y suavemente mezclar bien.
- Coloque el tubo de fondo redondo sobre un soporte magnético e incubar 10 min a 4 ° C. Puesto que los granos a las vesículas son atraídos por el imán, micro-beads marrón poco a poco se acumularán a la pared del tubo más cercana al imán.
- Con el tubo restante en el soporte magnético, descartar cuidadosamente el sobrenadante por aspiración para eliminar las vesículas.
- Lavado los granos magnéticos enlazados a las vesículas dos veces con 5 mL de medio de homogeneización por el magnético reposar 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante cada vez por aspiración cuidadosamente.
Nota: Sin el soporte magnético, purificación por centrifugados a 2.000 x g durante 10 min, 4 ° C está también disponible. - Resuspender las bolas magnéticas vinculadas a las vesículas con cuidado en 100 μl de medio de homogeneización por pipetear la solución arriba y abajo varias veces.
- Transferir las vesículas resuspendidas en un microtubo nuevo como del microsoma purificado para experimentos posteriores.
Nota: Típicamente, 50 fracción del microsoma de μl que contiene 1 x 10 7 células de 5-20 μg proteínas puede ser aislado.
4. Análisis de los microsomas purificada
perlas- Resuspender el magnético a las vesículas de paso 3.8 por 100-200 μL de tampón de TNE (pH de 20 mM Tris-HCl 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 M de EDTA, de 1% Nonidet P-40) con volumen de 1/1.000 de cócteles inhibidores de proteasa en lugar del medio de homogeneización.
- Transferir el lisado de paso 4.1 a un nuevo microtubo de 1.5ml.
- Determinar la concentración de proteína de paso 4.2 usando un kit de ensayo BCA por el fabricante ' Protocolo s.
Nota: Normalmente, 5-10 μl lisado de paso 4.2 es suficiente para determinar la concentración de proteína. - Transferir el lisado de paso 4.2 (2 μg de proteína para la tinción de plata y 10 μg de proteína para el borrar occidental) en microtubos nuevo.
- Colocar los microtubos en un bloque de calor las proteínas 95 ° C y hervir en 1 x de tampón de carga de gel SDS (100 mM Tris-HCl de pH 6.8, azul de bromofenol 200 mM Ditiotreitol, 4% SDS, de 0,2%, 20% de glicerol) por 5 min
- Centrifugar microtubos 10 min a 21.500 x g y 4 º C. recoger el sobrenadante en nuevos microtubos para quitar las fracciones insolubles.
- Analizar las proteínas resueltas en el paso 4.6 (2 μg) por página de SD standard.
- Visualiza las bandas de proteínas por la tinción utilizando la tinción de plata de plata kit siguiendo el fabricante ' Protocolo s.
- Analizar las proteínas resueltas en el paso 4.6 (10 μg) por estándar SD-PAGE y Western-blotting. Utilizar el reactivo (SA-HRP) por el fabricante ' s protocolo y visualizar por fluorografía.
5. In Vitro Reconstitución de ubiquitinación ERAD de bOVA usando microsomas de purificada
- transferencia la purificada microsomas (5-10 μg de proteína) de paso 3.8 con un volumen de 50% de reticulocitos lisado (RL), en 1 x buffer de reacción (50 mM Tris, pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl 2) y 12:02 bandera etiqueta ubiquitina en un microtubo nuevo. El volumen final de este experimento es 20-40 μl.
- Incubar los microtubos por 2 h a 37 ° C.
Nota: Si la cantidad de ubiquitinated bOVA en paso 5.12 es demasiado pequeña para detección por Western blotting, agregue 10 μm de MG132 o 2 μm de lactacystin para inhibir el procesamiento de la bOVA ubiquitinated por proteasomas. - Detener la reacción mediante la colocación de los microtubos en hielo.
- Resolver los microsomas por agregar 500 μl de tampón de TNE con volumen de 1/1.000 de cócteles inhibidores de proteasa.
- Centrifugar microtubos 10 min a 21,500 x g y 4 º C. recoger el sobrenadante a un nuevo microtubo para quitar las fracciones insolubles, que contienen ubiquitinated bOVA en DC2.4 antes del ensayo de ubiquitinación en vitro.
- Transferir el sobrenadante a un microtubo nuevo y añadir volumen 1/100 de nuevos granos SA-magnético (generalmente 5 μL para 500 μl del sobrenadante).
- Mezclar bien suavemente y gire el microtubo lentamente durante 30 minutos a 4 ° C.
- Centrifugar microtubos 10 min a 21.500 x g y 4 ° C. desechar el sobrenadante por aspiración a recuperar la bOVA y bOVA ubiquitinated atado con las bolas magnéticas SA.
- Lavar dos veces los granos SA-magnético recogidos con 1 mL de tampón de la TNE por centrifugación 10 min a 21.500 x g y 4 ° C. descarte el sobrenadante cada vez por la aspiración de.
- Hervir los granos SA-magnético en 1 x gel SDS cargando buffer por 5 min a 95 ° C en un bloque de calor para resolver las proteínas purificadas por las bolas magnéticas SA.
- Centrifugar microtubos 10 min a 21.500 x g y 4 º C. recoger el sobrenadante a un nuevo microtubo para quitar las fracciones insolubles.
- Analizar los granos SA-magnético enlazados a las proteínas por estándar SD-PAGE y Western-blotting. Es el uso de anticuerpos (Anti-Flag, anti-multi-Ub y anti-mouse IgG-HRP) y el reactivo (SA-HRP) por el fabricante ' Protocolo s y visualizados por fluorografía.
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Representative Results
Para dilucidar el mecanismo molecular de la CP, es necesario identificar los compartimentos celulares donde someterse a antígenos exógenos ERAD-como transporte y procesamiento. Mientras que observaciones por microscopía de inmunofluorescencia o microscopia electrónica identificaron el compartimento celular donde antígenos exógenos acumularon16,17,18,19, 30,31,32,33, los compartimentos celulares para ERAD-como procesamiento de antígenos exógenos no están claramente definidos. Fue demostrado recientemente que no clásicas endosomas con moléculas residente ER fueron responsables de CP34, pero estos compartimentos celulares fueron no purificados. La dificultad de aislar y purificar los compartimentos celulares se puede atribuir al hecho de que los antígenos exógenos se localizan en el endosome y ER-como compartimentos y que no existe ninguna molécula de identificación de estos compartimentos endocíticos otros de antígenos exógenos. Sin embargo, la condición de antígenos exógenos que ERAD-como transporte es diferente del de estado estacionario; en el transporte a través de membrana bimolecular de lípidos, antígenos exógenos penetran en la membrana vía translocons, como Sec61 (figura 2A). Por lo tanto, cuando utilice bOVA como un antígeno exógeno, bOVA debe asociarse a Sec61. Puesto que bOVA asociada a membrana específicamente limitado con SA, microsome preparado a partir de DC2.4, que fue pretratado con bOVA, podría aislarse distintivo por granos SA-magnéticos (figura 2A). Entonces cantidades equivalentes de proteínas a partir de microsomas purificadas con o sin preincubación de bOVA se resolvieron mediante SDS-PAGE seguido por plata y Western blotting con SA-HRP (figura 2B, 2C). Como se muestra en la figura 2y figura 2B , los microsomas aislados contienen varias proteínas únicas que fueron purificadas depende exógeno agregado bOVA y granos SA-magnéticos. Además de estas proteínas únicas, microsomas aislados también contienen proteínas inespecíficas, que granos SA-magnéticos con o sin bOVA. Tratamiento del del microsoma con tripsina antes de purificación por el imán impidió la purificación de los microsomas (Figura 2D), lo que indica que los métodos de purificación depende de la presencia de bOVA de penetración de la membrana.
Los microsomas purificados mostraron la capacidad ubiquitinate la bOVA incorporado en vitro, bajo la presencia del SPI (Figura 3A). Las cantidades de bOVA y poly-ubiquitinated bOVA fueron aumentadas en presencia de MG132 (figura 3B), indicando que la bOVA incorporado fue procesado por el sistema ERAD y que los microsomas purificados contenían las proteínas de la maquinaria ERAD.
Figura 1: vías intracelulares de CP en DCs. En DCs, los antígenos exógenos son transportados en compartimentos endocíticos no clásica, que también contienen moléculas de ER residente además de moléculas de la clásica último endosome. En este compartimiento, los antígenos exógenos se exportan en el citosol a través de translocons como Sec61. En el citosol, los antígenos exógenos son procesados por el sistema ubiquitina-proteasoma en péptidos antigénicos como sustratos ERAD. Péptidos antigénicos son transportados en compartimentos endocíticos no clásicas mismos o adyacentes, o ER adyacente a través del transportador del grifo y luego cargan en el MHC I las moléculas por el PLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: purificación de los microsomas con bOVA ERAD sometidos a. (A) A modelo esquemático de la purificación de los microsomas con bOVA en ERAD. bOVA está asociada a la membrana a través del translocon Sec61 y dirigidos con granos SA-magnéticos. Los microsomas (B) con (+) o sin (-) previa adición de bOVA se purificaron con (+) o sin granos SA-magnéticos (-). Proteínas (2 μg) o los volúmenes correspondientes de las proteínas purificadas fueron resueltas en SDS-PAGE de 7.5-15%, y la plata fue utilizado para visualizar las bandas de proteínas. Triángulos en el lado derecho indican no específicas proteínas vinculantes a las bolas magnéticas de SA. Triángulos con asteriscos indican únicas proteínas que se encuentran solamente en presencia de bOVA exógeno agregado y granos SA-magnéticos. La flecha muestra bOVA. Los microsomas (C) con (+) o sin (-) previa adición de bOVA se purificaron con (+) o sin granos SA-magnéticos (-). Proteínas (10 μg) o los volúmenes correspondientes de las proteínas purificadas fueron resueltas en SDS-PAGE de 7.5-15% y sometidos a Western Blot con SA-HRP. P.N.: fracción postnuclear. Asteriscos a la derecha indican bandas inespecíficas con SA-HRP. Resultados equivalentes fueron logrados por al menos tres ensayos independientes. (D) los microsomas con adición previa de bOVA se purificaron con granos SA-magnéticos. Los microsomas fueron tratados con (+) o sin (-) tripsina y TX-100 antes de purificación (dos carriles a la izquierda) o después de la purificación (derecha dos carriles). Proteínas (2 μg) o los volúmenes correspondientes de las proteínas purificadas fueron resueltas en SDS-PAGE de 7.5-15%, y la plata fue utilizado para visualizar las bandas de proteínas. Triángulos en el lado derecho indican no específicas proteínas vinculantes a las bolas magnéticas de SA. Triángulos con asteriscos indican únicas proteínas que se encuentran solamente en presencia de bOVA exógeno agregado y granos SA-magnéticos. Resultados equivalentes fueron logrados por al menos tres ensayos independientes. Reimpreso con el permiso de referencia28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: In Vitro reconstitución de procesamiento y ubiquitinación usando óvulos en microsomas purificada. Microsomas purificado (A) con (+) o sin (-) previa adición de bOVA fueron tratados con (+) o sin (-) RL y bandera-Ub para 1 h y fueron solubilizados con TNE. bOVA fue purificada con granos SA-magnéticos y sometido a Western Blot con anticuerpos indicados. Asteriscos a la derecha indican bandas inespecíficas con SA-HRP. Resultados equivalentes fueron logrados por al menos tres ensayos independientes. (B) purificada microsomas fueron tratados con (+) o sin (-) RL, bandera-Ub y MG132 para 1 h y luego fueron solubilizados con TNE. bOVA fue purificada con granos SA-magnéticos y sometido a Western Blot con SA-bandera. Asteriscos a la derecha indican bandas inespecíficas con SA-HRP. Resultados equivalentes fueron logrados por al menos tres ensayos independientes. Reimpreso con permisosn de referencia28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En estudios previos de CP, los antígenos exógenos incorporados acumulan en el área restricta del último endosome o ER por microscopía inmunofluorescente16,30,31,32. Se estima que ERAD-como transporte y procesamiento de antígenos exógenos se llevan a cabo en estas áreas especializadas de la ER o último endosome, el compartimento celular fue identificado por sacarosa o iodixanol centrifugación del gradiente de densidad utilizando ubiquitinated bOVA como marcador ERAD-como proceso. Después de la estimulación de la inmunidad innata, CP eficacia significativamente aumentada y la fracción máxima de bOVA junto con bOVA ubiquitinated emigraron a una mayor fracción de la densidad (nuestros resultados no publicados). Los objetivos de estos experimentos fueron identificar marcadores moleculares específicos para la ER o último endosome, que emigró junto con bOVA o bOVA ubiquitinated. Pero en los resultados, moléculas residente ER y último endosome residente moléculas migran junto con el bOVA y bOVA ubiquitinated, indicando que estos experimentos tuvieron éxito en determinar el compartimiento celular para el transporte de ERAD-como procesamiento y ER clásico como último endosome. En estos experimentos, no había moléculas específicas en los compartimentos endocytotic excepto bOVA o bOVA ubiquitinated. Sin embargo, mientras que el antígeno exógeno experimentó ERAD-como transporte, estas moléculas penetraron la membrana de bicapa lipídica de ER a través de translocons, como el complejo Sec61 (figura 1, figura 2A). La membrana se adhiera bOVA fue seleccionada como un marcador de los compartimentos endocíticos y los microsomas se purificaron por granos SA-magnéticos (figura 2A, 2B). En estos microsomas purificados, bOVA acumulada encontré ERAD-como ubiquitinación y transformación bajo la presencia de RL y ATP en vitro (Figura 3A, 3B). Desde RL contiene todos estomáticos molecular citosólica, tales como las moléculas de ubiquitinación y proteasomas además de moléculas para la traducción y transcripción, la adición de RL permite ubiquitinación de bOVA en purificada del microsoma. Estos resultados indican que los microsomas purificados eran los compartimientos celulares objetivo para ERAD-como transporte y procesamiento de antígenos exógenos, tanto que contengan endosome específicos moléculas y moléculas de ER residente al mismo tiempo; Lamp1 mostró precursor y formas maduras en el purificado microsoma.
Este protocolo depende de la cantidad de penetración de la membrana los antígenos exógenos; es importante incorporar suficiente de los antígenos exógenos a las células DC2.4, que muestra una alta capacidad de incorporar antígenos exógenos en el estado de semi-confluente. Alarga el tiempo de incubación de 6 a 12 h para DC2.4 con bOVA aumenta la cantidad de bOVA incorporado. La adición de inhibidores de proteasomas, MG132 o lactacystin, aumenta moderadamente la cantidad de microsomas purificadas. La preparación del microsoma es uno de los pasos más críticos de este protocolo. La bOVA gratis, que no se incorpora en las células DC2.4, debe ser retirada por lavado las células con PBS para evitar la fijación no específica de la bOVA libre a la fracción del microsoma. Para reducir los daños en los compartimentos de membrana, las células se interrumpen cuidadosamente por los homogeneizadores Dounce en agua con hielo. Luego los núcleos y células intactas fueron quitados por centrifugación como se prepararon los microsomas de la fracción post nuclear. Después de la preparación de los microsomas, se realiza depuración de un solo paso mediante bolas magnéticas SA. En este paso, lavado cuidadoso del del microsoma imán atado es necesario eliminar el atascamiento no específico de otros compartimentos celulares y para no perder del microsoma específicamente.
En este método de purificación de un paso, un porcentaje significativo del del microsoma de destino se requiere. Si la relación de lo objetivos del microsoma es demasiado pequeña, la cantidad de microsoma destino purificada disminuye por la competencia con el atascamiento no específico de otros compartimentos celulares. En consecuencia, bajo esas condiciones, el enriquecimiento del del microsoma de destino y la liquidación del microsoma no específicos necesitarían. También es posible introducir medidas adicionales antes de purificación por las bolas magnéticas de SA. Una tal medida es la sacarosa o iodixanol centrifugación gradiente densidad del microsoma. Ya que los microsomas preparados contienen todos los productos de membrana, es posible enriquecer del microsoma de destino antes de purificación de granos SA-magnético seleccionando las fracciones ricas de antígeno para la purificación. Otro paso posible es la liquidación previa de lo del microsoma de cuentas control magnético sin SA, para reducir las asociaciones de fondo no específica de microsomas contra granos SA-magnéticos. En estos experimentos, ambos pasos mejoraron la pureza del microsoma objetivo eficazmente, pero disminuyeron la cantidad total de productos purificados, indicando que estas medidas adicionales son seleccionados como medio de otros experimentos.
Es bien sabido que centrifugación de alta velocidad se ha demostrado para causar la fusión o la coagulación de las vesículas intracelulares. Estas fusiones o clottings producirá microsomas artificiales, que se derivan de la interacción no específica entre diferentes tipos de vesículas derivadas de organelas. Estos microsomas artificiales estadísticamente contienen cada molécula de membrana como el mitocondrial molécula residente, molécula residente de aparato de Golgi, etcetera. Estos microsomas purificados no incluyó la proteínas residentes caveosome, proteínas residentes del aparato de Golgi o tempranas endosome residente proteínas, tales como caveolin1 y GM130 EEA1, indicando que los microsomas SA-purificado no son productos artificiales derivado de la fusión entre diferentes tipos de vesículas. La centrifugación de alta velocidad, se aislaron vesículas bOVA-que se pega sin los experimentos de control de vesículas sin bOVA mostró mayores cantidades de moléculas inespecíficas. Esto indica que este método preliminar es insuficiente para los sucesivos experimentos y que el paso de centrifugación de alta velocidad es necesario para este protocolo de purificación.
Este protocolo se aplica a otros tipos celulares, tales como diferentes subconjuntos de DC, u otros vehículos blindados. También es posible utilizar los distintos tipos de antígenos exógenos en diversas condiciones, tales como proteínas fluorescentes, complejo antígeno-anticuerpo, antígenos de granos vinculados, etcetera. Además, podemos purificar los microsomas de destino utilizando anticuerpos específicos contra los antígenos exógenos. Aunque varios pasos adicionales o modificaciones podrían ser necesario aplicar este protocolo a otras células y antígenos, pueden dilucidar los mecanismos moleculares de la CP dependiente del proteosoma comparando las moléculas purificadas entre diferentes experimentos. Así, el protocolo descrito tiene habitación para la modificación y mejora.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la Universidad de Takasaki de la salud y el bienestar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
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