Summary
Burada açıklanan nerede eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili düşmesine çapraz-sunum tarafından işlenen hücresel kompartmanlarda arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir.
Abstract
Dendritik hücreler (DC) işleme ve MHC sınıf (MHC) üzerine içselleştirilmiş eksojen antijen sunan son derece yetenekli ben moleküller olarak da bilinen çapraz-sunum (CP). CP çalış önemli bir rol sadece saf CD8 uyarılması+ T hücreleri ve bellek CD8+ T hücreleri için bulaşıcı ve tümör bağışıklığı ama aynı zamanda kendiliğinden hareket inactivation saf T hücreleri tarafından T hücre anerji veya T hücre silme. Her ne kadar aydınlatılmamıştır için CP kritik moleküler mekanizması kalır, biriken kanıtlar eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulması ile (ERAD) klasik olmayan ihracat sonra endositik işlenir gösterir bölmeleri. Çünkü eksojen antijenlere başka hiçbir belirli moleküler işaretleri vardı yakın zamana kadar bu endositik bölmeleri karakterizasyonu sınırlıydı. Burada açıklanan endositik bu bölmeleri arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir. Bu saf microsome kullanarak, biz ERAD benzeri taşıma, ubiquitination ve eksojen antijen vitro, işlenmesi Ubikuitin-proteasome sistemi ihracat bundan sonra eksojen antijen işleme düşündüren yeniden düzenlendi hücresel bölme. Bu iletişim kuralı daha fazla CP moleküler mekanizması netleştirmek için diğer hücre tipleri için uygulanabilir.
Introduction
MHC ı molekülleri ile kısa antijenik peptidler sitozol1Ubikuitin-proteasome sistemi tarafından işlenen endojen antijenleri türetilen tüm çekirdekli hücrelerin yüzeyinde ifade. İşlendikten sonra antijenik peptidler endoplazmik retikulum (ER) Lümen DOKUNUN peptid taşıyıcı tarafından taşınmaktadır. ER Lümen peptid yükleme ve doğru katlanır MHC ben karmaşık bir dizi belirli chaperones yardım. Molekülleri bu dizi acil servis merkezi a bölme için yükleme MHC ben2peptid olduğunu belirten peptid-yükleme karmaşık (PLC) denir. Yükleme, peptid MHC sonra ben moleküller hücre yüzeyine taşınır ve bir anahtar edinilmiş bağışıklık sistemi olarak kendini işaretleri ve etkinleştirir CD8+ sitotoksik T lenfositler (CTL) kanser hücreleri veya enfeksiyöz ajanlar algılamaya tarafından antijenik rolü peptidler olmayan kendine proteinler3.
Hücreleri (APC) sunulması antijen, eksojen antijenleri üzerinden antijenik peptidler de sunulan MHC ben esas olarak yapılan4,5,6,7,8 üzerinden CP, dışarı DCs9,10,11tarafından. CP esastır saf CD8+ T aktivasyonu için hem de hücreleri ve bellek CD8+ T hücreleri içine CTL'ler12,13Anti-bulaşıcı ve anti-tumoral ve immün tolerans bakım ihracı, kendi kendine oyunculuk saf T hücreleri14,15. CP moleküler mekanizmaları henüz ayrıntılı olarak tarif edilebilir ancak CP edinilmiş bağışıklık sisteminde birçok önemli rol oynar. Eksojen antijenleri ve acil servis ve endosome hem de lokalize ERAD, eksojen antijenleri ERAD benzeri işleme ve16 yükleme peptid acil servise endosome taşınmaktadır düşündüren tarafından işlenmiş olan CP önceki çalışmaların ortaya . Ancak, CP peptid yüklenmesini serviste değil ama da Ayrıca ER (şekil 1)17,18 farklı özelliklere sahip çok klasik olmayan endositik bölmeleri, gerçekleştirilir biriken kanıtlar gösteriyor ,19,20,21. Antijenik peptid öncüleri bozulma aminopeptidaz yüksek faaliyet tarafından önlemek için bu klasik olmayan endositik bölmeleri (şekil 1) proksimal bölgede22 sitozol, işleme ve peptid CP içinde yükleme oluşur. Endositik bu bölmeleri karakterizasyonu tartışmalı olmasına rağmen bu yerde eksojen antijenlere başka hiçbir varolan belirli moleküller vardır.
ERAD özellikle misfolded proteinler ER kaldırır hücresel bir yoludur. ERAD yolu misfolded proteinler retrogradely sitoplazma için ER membran aracılığıyla taşınır ve ubiquitin-proteasome sistemi23,24,25tarafından işlenen. Proteinler gibi büyük moleküllerin lipid bilayer ile taşınmaktadır zaman, bu moleküller Derlin ER26ve Tom karmaşık içinde karmaşık ve Tim ve Sec61 karmaşık gibi bir translocon kompleksi olarak adlandırılan bir moleküler aparatı ile başarılı mitokondri27. Ne zaman exogenously eklendi antijenleri ER membran taşınır, lipid bilayer ile translocons, Sec61 kompleksi gibi kompleks içinde nüfuz gerekir. Burada açıklanan yöntemi endositik salonlar için işaretleyici olarak bu zarı delici moleküller kullanarak hedeflenen vezikül saf.
Burada açıklanan yöntemi eksojen bir antijen DC benzeri hücre satırı DC2.428 ve biotinylated ovalbumin (bOVA) kullanarak yeni bir vezikül arıtma protokoldür. Endositik bölmeleri streptavidin (SA) tarafından saf-membran-Penetran bOVA bir üreticisi kullanarak manyetik boncuklar. Bu saf microsome, bazı exogenously bOVA hala membran kesirler korundu ama dışında microsome ve sonra ubiquitinated taşınan ve işlenen ekledi vitro29. Bu saf microsome ERAD ve karmaşık yükleme peptid için hem de ER yerleşik proteinler endositik yuvası özel proteinler yer alan; hücresel yuvası CP29potansiyel endositik yuvası olduğunu düşündüren. Bu iletişim kuralı eksojen antijenleri türüne bağlı değildir ve ayrıca diğer DC alt kümeleri ve DCs hassas moleküler mekanizması için yeterli CP netleştirmek için diğer hücre tipleri, endotel hücreleri, makrofajlar ve B hücreleri gibi için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. büyüyen hücreler ve ayrıca eksojen antijenleri
bir biotin proteinli etiketleme kullanarak- hazırla bOVA kit üretici takip ' s protokolü.
Not: Normalde, ortalama 1 M OVA başına 2 M biotin bOVA içerir. - RPMI-1640 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 0,1 mM gerekli olmayan amino asitler, 100 U/mL penisilin-streptomisin, 55 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) ve 5'te 37 ° C'de % 10 fetal buzağı serum (bundan sonra RPMI) ile takıma hücrelerde DC2.4 büyümek % CO 2 oksijen kuluçka (bundan sonra söz, hücreleri bu durum inkübe). DMEM % 10 fetal buzağı serum, 3.7 g/L NaHCO 3 (bundan sonra DMEM) yerine RPMI ile takıma kullanmak mümkündür.
- Bir gün önce arıtma, 1 x 10 5 hücre/ml bir doku kültürü plaka RPMI hücreleri bölün. Konfluent State hücreleri tutarak kaçının. DC2.4 hücreleri son derece eksojen antijenleri yarı Konfluent devlet kadar dahil ama hızla bir aşırı birleşmesi durumunda ulaştıktan sonra yeteneği kaybetmek.
- Daha önce DC2.4 hücreleri yarı Konfluent, 250 µg/mL 1 x 10 6 hücre/mL için bOVA ekleyin ve 2-4 h için kuluçkaya
Not: aşağı akım deneyler sırasında tüm arabellekleri ve Kimyasalları 4 ° C'de aksi belirtilmediği sürece tutulur.
2. Microsomes hazırlanması
- DC2.4 hücreler yumuşak doku tabaktan bir yeni 50 mL konik tüp içine pipetting tarafından hasat.
- 5 dk, 4 ° C için 1000 x g, santrifüj ve bOVA ile orta aspirasyon tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın.
- DC2.4 hücrelerle iki kez PBS arabelleği (1.37 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4, 2.68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) tarafından Santrifüjü 1000 x g 5 min, 4 ° C için de 40 mL yıkayın ve süpernatant aspirasyon her zaman atın. Homojenizasyon orta (0.25 M Sükroz, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) ile 1/1000 hacmi proteaz inhibitörü kokteyller ve transfer resuspended DC2.4
- resuspend Pelet adım 2.3 içinde 1 - 2 mL (1/20-1/10 cilt kültür ortamının) hücreleri içine bir buz gibi Dounce homogenizer.
- Bozmaya resuspended DC2.4 hücreleri nazikçe tarafından 10-20 vuruş ile buz gibi Dounce homogenizer.
Not: buz üzerinde Dounce homogenizer bozulma adımı sırasında soğutmalı - Yeni bir 15 mL konik tüp hücre kesintiye süspansiyon transfer.
- 10 mL toplam 8-9 mL homojenizasyon orta ekleyin ve konik tüp 2000 g x ve 4 10 dk santrifüj kapasitesi ° C.
- Süpernatant kırılmamış hücreleri ve hücre çekirdeği kaldırmak için bir yeni 15 mL konik tüp aktarmak ve konik tüp 10 min 2.000 g x ve 4 için tekrar santrifüj kapasitesi ° C.
- İçine a yeni ultrasantrifüj tüp ve 100.000 g x ve 4 45 dk santrifüj süpernatant transfer ° C.
- Süpernatant Aspire edin ve yukarı ve aşağı microsome kesir aşağı akım deneyler için yapmak için birkaç kez çözüm pipetting tarafından dikkatle içinde homojenizasyon orta 1-2 mL 1/1000 birim proteaz inhibitörü kokteyller ile Pelet resuspend.
- Transfer microsome kesir bir yeni 5 mL yuvarlak alt tüpüne.
Not: bu adımdan sonra iodixanol yoğunluk gradient Santrifüjü üreticiye göre tarafından objektif microsomes zenginleştirmek mümkün ' s protokolü, non-spesifik microsomes kaldırmak için. Tepe fraksiyonları eksojen antijenleri için toplanan ve sonra arıtma (Adım 3) sonraki adıma tabi.
3. Microsomes arıtma bOVA ile geçiren ERAD
- Ekle 1/100 birim taze SA-manyetik boncuklar 5 mL. adımda 2.11 microsome kısmını yuvarlak alt tüp.
Not: bu adımdan önce microsome kesir contaminations belirsiz microsomes azaltmak için denetim manyetik boncuklar tarafından önceden temizlemek mümkün mü. - Hafifçe karıştırın ve yavaş yavaş 30 dk için yuvarlak alt tüp 4'te döndürmek ° C.
- 2-3 mL homojenizasyon orta 4 mL toplam yuvarlak alt tüp içine ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- Yuvarlak alt tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya Veziküller için bağlı boncuk mıknatıs için ilgi vardır beri kahverengi mikro-boncuk mıknatıs için en yakın tüp duvar için yavaş yavaş birikir.
- Tüp ile dikkatli aspirasyon tarafından ilişkisiz veziküller kaldırmak için supernatants atmak kalan manyetik tribünde.
- Yıkama manyetik boncuklar veziküller homojenizasyon orta 5 mL ile iki kez için manyetik tarafından bağlı 4 ° C'de 10 dakika stand ve süpernatant her zaman dikkatli aspirasyon tarafından atın.
Not: Manyetik stand, arıtma centrifugations 10 dk, 2.000 x g de tarafından olmadan 4 ° C de mevcuttur. - Manyetik boncuklar bağlı veziküller dikkatle içinde 100 µL homojenizasyon çevre için yukarı ve aşağı birkaç kez çözüm pipetting resuspend.
- Aşağı akım deneyler için saf microsome olarak yeni bir microtube resuspended veziküller transfer.
Not: Genellikle, 5-20 µg proteinler 1 x 10 7 hücreleri içeren 50 µL microsome kesir ayrılmış olabilir.
4. Saf Microsomes analizini
veziküller bağlı- Resuspend manyetik boncuklar adım 3.8 TNE arabellek 100-200 µL tarafından (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, %1 Nonidet P-40) 1/1000 birim proteaz inhibitörü kokteyller ile homojenizasyon orta yerine.
- Lysate 4.1 adımından yeni bir 1.5 mL microtube transfer.
- Üretici başına BCA tahlil kit kullanarak adım 4.2 protein konsantrasyonu belirlemek ' s protokolü.
Not: Genellikle 5-10 µL 4.2 adımından lysate protein konsantrasyonu belirlemek için yeterlidir. - Lysate adım 4.2 (2 µg gümüş boyama için protein ve protein Western Blot için 10 µg) yeni mikrotüpler transfer.
- 1 SDS jel-yükleme arabellek x 95 ° C ve kaynatın proteinleri ısı bloğunda mikrotüpler koymak (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM dithiothreitol, % 4 SDS, %0,2 bromophenol mavi, % 20 gliserol) 5 dakika süreyle
- Mikrotüpler 21,500 g x ve 4 10 dk santrifüj kapasitesi ° C. toplamak supernatants yeni mikrotüpler çözünmez kesirler kaldırmak için.
- Adım 4.6 (2 µg) standart SD-sayfa tarafından çözümlenen proteinleri analiz.
- Protein bantları gümüş boyama kullanarak boyama gümüş tarafından kit üreticinin görselleştir ' s protokolü.
- Adım 4.6 (10 µg) standart SD-sayfa ve Western Blot tarafından çözümlenen proteinleri analiz. Üreticinin reaktif (SA-HRP) kullanmak ' s protokol ve fluorography tarafından görselleştirmek.
5. Vitro Sulandırma bOVA kullanarak saf Microsomes ERAD Ubiquitination
- Transfer saf microsomes (5-10 µg protein) adım 3.8 Retikülosit lysate (RL), % 50 hacmi ile reaksiyon arabellek (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl x 1 2) ve 0 pM 2 bayrak öğesini Ubikuitin yeni bir microtube içinde. 20-40 µL bu deneyin son birimdir.
- Incubate microtube 2 h 37 ° c
Not: ubiquitinated bOVA 5.12 adımda miktarı Western Blot tarafından tespit etmek için çok küçük ise, MG132 10 µM veya lactacystin proteasomes tarafından ubiquitinated bOVA işlenmesini engellemek için 2 µM ekleyin. - Buz üzerinde microtube yerleştirerek reaksiyonu durdurmak
- Microsomes 500 µL TNE arabellek proteaz inhibitörü kokteyller hacmi 1/1.000 ile ekleyerek çözümlemek.
- Microtube 21,50, 10 dk santrifüj kapasitesig ve 4 x 0 ° c ubiquitinated bOVA DC2.4 in vitro ubiquitination tahlil önce içeren çözünmez kesirler kaldırmak için yeni bir microtube içine supernatants toplamak.
- Süpernatant için yeni bir microtube transfer ve yeni SA-manyetik boncuklar (genellikle 5 µL supernatants 500 µL için) 1/100 birim ekleme.
- Hafifçe karıştırın ve 4'te microtube 30 dk için yavaş yavaş döndürmek ° C.
- Microtube 21,500 g x ve 4 10 dk santrifüj kapasitesi ° C. atma süpernatant bOVA ve ubiquitinated bOVA kurtarmak için aspirasyon tarafından bağlı SA-manyetik boncuklar ile.
- 21,500 g x ve 4 10 dk aralıklarla tarafından iki kez toplanan SA-manyetik boncuklar TNE arabelleği 1 mL ile yıkayın ° C. atma süpernatant her zaman aspirasyon.
- Arabellek arıtılmış proteinler tarafından SA-manyetik boncuklar gidermek için bir ısı blokta 95 ° C'de 5 min için yükleme SDS jel x 1 SA-manyetik boncuklar kaynatın.
- Microtube 21,500 g x ve 4 10 dk santrifüj kapasitesi ° C. çözünmez kesirler kaldırmak için yeni bir microtube supernatants toplamak.
- Standart SD-sayfa ve Western Blot proteinler için bağlı SA-manyetik boncuklar analiz. Antikorlar (Anti-bayrak, anti-multi-Ub ve anti-fare IgG-HRP) ve reaktif (SA-HRP) üreticisidir ' s Protokolü ve fluorography tarafından görüntülenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CP moleküler mekanizması aydınlatmak için nerede eksojen antijenleri ERAD benzeri taşıma ve işleme tabi hücresel kompartmanlarda tanımlamak gereklidir. Gözlemler immünfloresan mikroskopi veya elektron mikroskobu nerede eksojen antijenleri16,17,18,19birikmiş hücresel yuvası tespit ederken, 30,31,32,33, ERAD benzeri işleme için hücresel kompartmanlarda eksojen antijenleri açıkça tanımlı değil. Son zamanlarda bu ER ikamet molekülleri ile klasik olmayan endosomes CP34için sorumlu olduğunu, ancak bu hücresel kompartmanlarda unpurified gösterilmiştir. İzole ve hücresel kompartmanlarda arındırıcı zorluk Aslında eksojen antijenleri endosome ve ER benzeri bölmeleri hem de lokalizedir ve orada hiçbir tanımlayıcı molekül endositik bu salonlar için diğer bağlanabilir eksojen antijenleri. Ancak, eksojen antijenleri ERAD benzeri taşıma geçirmekte kararlı duruma farklı durumda; lipid bimolecular membran arasında Ulaştırma eksojen antijenleri membran translocons, Sec61 gibi üzerinden nüfuz (şekil 2A). Böylece, bOVA eksojen bir antijen kullanırken, bOVA Sec61 ile ilişkili olmalıdır. Membran ilişkili bOVA özellikle SA ile bağlı olduğundan, hangi bOVA ile ön işleme, DC2.4 hazırlanan microsome belirgin SA-manyetik boncuklar (şekil 2A) tarafından izole. O zaman eşdeğer miktarda saflaştırılmış microsomes veya bOVA ön kuluçka olmadan gelen proteinler SDS-sayfa ardından gümüş boyama ve Western Blot SA-HRP ile (şekil 2B, 2 C) tarafından çözüldü. Şekil 2B şekil 2Cgörüldüğü gibi izole microsomes exogenously eklenen bOVA ve SA-manyetik boncuklar bağımlı saf birkaç benzersiz proteinler yer. Bu benzersiz proteinler ek olarak, izole microsomes da SA-manyetik boncuklar ile ya da ezelî bOVA bağlı nonspesifik proteinler yer. Microsome arıtma mıknatıs tarafından gösteren microsomes (şekil 2B), arıtma arıtma yöntemleri engelledi önce tripsin ile tedavisinde membran-Penetran bOVA varlığı bağlıydı.
Saf microsomes ubiquitinate yeteneği dahil bOVA vitro, HBS (şekil 3A) varlığı altında gösterdi. BOVA ve poli-ubiquitinated bOVA miktarda MG132 huzurunda artar (şekil 3B), anonim bOVA ERAD sistem tarafından işlendi ve bizim saf microsomes ERAD makine proteinler yer gösteren.
Şekil 1: DCs CP için hücre içi yolları. DCs, eksojen antijenleri da ER yerleşik molekülleri yanı sıra klasik geç endosome molekülleri içeren klasik olmayan endositik bölmeleri içine taşınır. Bu bölümde eksojen antijenleri translocons Sec61 gibi aracılığıyla sitozol içine verilir. Sitozol eksojen antijenleri ERAD yüzeyler antijenik peptidler Ubikuitin-proteasome sistemi tarafından işlenir. Antijenik peptidler aynı veya bitişik klasik olmayan endositik bölmeleri veya bitişik ER DOKUNUN ışınlama aracılığıyla taşınır ve o zaman yüklü üzerinde MHC ı molekülleri PLC tarafından. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Microsomes bOVA ile arınma ERAD geçiyor. (A) A microsomes ERAD geçiren bOVA ile arınma şematik modeli. bOVA Sec61 translocon yoluyla membran ile ilişkilidir ve SA-manyetik boncuklar ile hedef. (B) Microsomes ile (+) veya (-) önceki bOVA eklenmesi saf (+) veya (-) SA-manyetik boncuklar olmadan. Proteinler (2 µg) veya karşılık gelen birimler arıtılmış proteinlerin % 7.5-15 SDS-sayfasında çözüldü ve gümüş boyama protein bantları görselleştirmek için kullanıldı. Üçgenler ve sağda nonspesifik proteinler için SA-manyetik boncuklar bağlama belirtir. Yıldız işareti ile üçgenler benzersiz proteinler sadece exogenously eklenen bOVA ve SA-manyetik boncuklar huzurunda bulunan belirtir. Oku bOVA gösterir. (C) Microsomes ile (+) veya (-) önceki bOVA eklenmesi saf (+) veya (-) SA-manyetik boncuklar olmadan. Proteinler (10 µg) veya saf protein karşılık gelen birimler 7.5-%15 SDS-sayfasında çözüldü ve Western Blot SA-HRP ile tabi. P.N.: Post-nükleer kesir. Yıldız sağ belirsiz bantları ile SA-HRP gösterir. Eşdeğer sonuçlar en az üç bağımsız deneyleri tarafından elde. (D) Microsomes bOVA önceden eklenmesi ile SA-manyetik boncuklar ile saf. Microsomes (+) ile tedavi ya da (-) tripsin ve TX-100 (iki şerit solda) arıtma önce veya sonra arıtma (şu iki şeritli) olmadan. Proteinler (2 µg) veya karşılık gelen birimler arıtılmış proteinlerin % 7.5-15 SDS-sayfasında çözüldü ve gümüş boyama protein bantları görselleştirmek için kullanıldı. Üçgenler ve sağda nonspesifik proteinler için SA-manyetik boncuklar bağlama belirtir. Yıldız işareti ile üçgenler benzersiz proteinler sadece exogenously eklenen bOVA ve SA-manyetik boncuklar huzurunda bulunan belirtir. Eşdeğer sonuçlar en az üç bağımsız deneyleri tarafından elde. Başvuru28izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Vitro sulandırma işleme ve OVA saf Microsomes kullanarak Ubiquitination. (A)saf microsomes ile (+) veya (-) önceki bOVA eklenmesi (+) ile tedavi ya da (-) olmadan RL ve bayrak-Ub için 1 h ve TNE kullanarak çözündürüldükten. bOVA SA-manyetik boncuklar ile saflaştırılmış ve Western Blot belirtilen antikorlar ile tabi. Yıldız sağ belirsiz bantları ile SA-HRP gösterir. Eşdeğer sonuçlar en az üç bağımsız deneyleri tarafından elde. (B) saf microsomes (+) ile tedavi ya da (-) olmadan RL, bayrak-Ub ve 1 h için MG132 ve sonra TNE kullanarak çözündürüldükten. bOVA SA-manyetik boncuklar ile saflaştırılmış ve Batı SA-bayrak ile kurutma için tabi. Yıldız sağ belirsiz bantları ile SA-HRP gösterir. Eşdeğer sonuçlar en az üç bağımsız deneyleri tarafından elde. Permissio ile yeniden basıldın başvuru28üzerinden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CP önceki çalışmalarda, immünfloresan mikroskobu16,30,31,32tarafından geç endosome veya ER kısıtlı alana eklenen eksojen antijenleri birikmiş. Hücresel yuvası Sükroz veya iodixanol yoğunluk gradient Santrifüjü kullanarak tanımlandığı gibi bu ERAD benzeri taşıma ve işleme eksojen antijenleri ER veya geç endosome, bu özel alanlarda yapılmaktadır olduğunu tahmin edilmektedir ubiquitinated bOVA ERAD benzeri işleme işareti olarak. Onların doğuştan gelen bağışıklık uyarıcı sonra CP verimliliği önemli ölçüde artmış ve tepe kesir ile birlikte ubiquitinated bOVA bOVA için daha yüksek bir yoğunluk kesir (yayınlanmamış sonuçlarımız) göç. ER veya geç endosome, göç bOVA veya ubiquitinated bOVA ile birlikte belirli moleküler işaretleyicileri tanımlamak için bu deneylerin amacı vardı. Ama sonuçlarda, birlikte bOVA ve bu deneyler ERAD benzeri ulaşım hücresel yuvası ascertaining başarısız olduğunu gösteren ubiquitinated bOVA, ER ikamet moleküller ve geç endosome yerleşik molekülleri göç ve klasik ER veya geç endosome olarak işleme. Bu deneylerde, orada endocytotic bölmeleri bOVA veya ubiquitinated bOVA dışında hiçbir belirli moleküller vardı. Ancak, ERAD benzeri taşıma eksojen antijen uygulandı ise, bu moleküller ER lipid bilayer membran translocons, Sec61 karmaşık gibi (şekil 1, şekil 2A) üzerinden nüfuz. BOVA yapışmasını membran endositik bölmeleri bir işareti olarak seçildi ve microsomes SA-manyetik boncuklar (şekil 2A, 2B) tarafından saf. Bu saf microsomes, ERAD benzeri ubiquitination ve işleme RL ve ATP vitro (şekil 3A, 3B) varlığı altında birikmiş bOVA rastladım. RL ubiquitination ilgili molekülleri ve proteasomes ek olarak çeviri ve transkripsiyon, molekül gibi tüm sitozolik moleküler apparati içerdiğinden RL ilavesi bOVA arıtılmış microsome içinde ubiquitination sağlar. Bu sonuçları, saf microsomes objektif hücresel kompartmanlarda olduğunu gösterir ERAD benzeri taşıma ve eksojen antijenleri işlenmesi için her ikisi de endosome özgü molekülleri ve ER yerleşik moleküller aynı anda; içeren Lamp1 habercisi ve olgun formları arıtılmış microsome gösterdi.
Bu iletişim kuralı eksojen antijenleri membran-Penetran miktarı bağlıdır; yeterince yarı Konfluent devlet eksojen antijenleri dahil etmek için yüksek bir yetenek gösteren eksojen antijenleri DC2.4 hücrelere dahil etmek önemlidir. 6-12 h kuluçka süresi için DC2.4 ile bOVA elongating anonim bOVA miktarını artırır. Yavaşlatıcılar, proteasomes, MG132 veya lactacystin, için ek orta derecede saflaştırılmış microsomes miktarda artırır. Microsome hazırlanması bu iletişim kuralı için en önemli adımlardan biri. DC2.4 hücre içine dahil değil, ücretsiz bOVA ücretsiz bOVA non-spesifik bağlama microsome kesir önlemek için PBS, hücrelerle yıkama tarafından kaldırılması gerekir. Membran bölmeleri üzerine zarar azaltmak için hücreleri dikkatle buz su Dounce homogenizer tarafından kesintiye. Sonra Post-nükleer kesir microsomes hazırlanırken kırılmamış hücreleri ve hücre çekirdeği Santrifüjü tarafından çıkarıldı. Microsomes hazırlanması sonra tek adımlı arıtma SA-manyetik boncuklar tarafından gerçekleştirilir. Bu adımda, dikkatli yıkamak için maddeler mıknatıs bağlı microsome diğer hücresel kompartmanlarda non-spesifik bağlantısını kaldırmak için ve özellikle ilişkili microsome kaybetmemek için gereklidir.
Bu bir adım arıtma yöntemde, hedef microsome önemli bir yüzdesini gereklidir. Objektif microsome oranı çok küçük ise, saflaştırılmış hedef microsome rekabet tarafından diğer hücresel kompartmanlarda non-spesifik bağlama ile azaltır. Sonuç olarak, hedef microsome enrichments ve non-spesifik microsome izni bu koşullar altında gerekli olacaktır. Arıtma önce ek adımlar SA-manyetik boncuklar tarafından takdim etmek mümkündür. Böyle bir adım Sükroz veya iodixanol yoğunluk gradient Santrifüjü, microsome olduğunu. Hazır microsomes tüm membran ürünleri içerdiğinden, antijen zengin kesirler arıtma seçerek önce SA-manyetik boncuklar arıtma hedef microsome zenginleştirmek mümkün olabilir. Microsome SA microsomes SA-manyetik Boncuklar karşı spesifik olmayan arka plan dernekleri azaltmak için olmadan denetim manyetik boncuklar tarafından ön izni başka bir olası adımdır. Bu deneylerde her iki adım hedef microsome saflığı etkili bir şekilde gelişmiş, ama saflaştırılmış ürünler, aşağıdaki ek adımları daha fazla deney aracı olarak seçilir gösteren toplam miktarı azalmış.
Bilindiği de bu yüksek hızlı Santrifüjü füzyon veya hücre içi veziküller, pıhtılaşma neden olduğu gösterilmiştir. Bu füzyon veya clottings veziküller organel kaynaklı çeşitleri arasında non-spesifik etkileşim türetilmiştir yapay microsomes üretecek. Bu yapay microsomes istatistiksel olarak mitokondriyal ikamet molekül, Golgi aygıtı ikamet molekül, vbgibi her membran molekülü içerir. Bu saf microsomes caveosome ikamet proteinler, Golgi aygıtı ikamet proteinler veya SA-saf microsomes yapay ürünler değildir gösteren erken endosome yerleşik proteinler, caveolin1, GM130 ve EEA1, gibi içermez veziküller çeşitleri arasında füzyon elde. Yüksek hızlı Santrifüjü olmadan bOVA yapışmasını veziküller izole edildi ama non-spesifik moleküllerin yüksek miktarlarda veziküller bOVA olmadan denetim deneylerden gösterdi. Bu ön bu yöntem başarılı deneyler için yetersiz olduğunu ve yüksek hızlı Santrifüjü adım bu arıtma iletişim kuralı için gerekli olduğunu gösterir.
Bu iletişim kuralı farklı DC alt kümelerini veya diğer ZPT gibi diğer hücre tipleri için geçerlidir. Floresan proteinleri, antijen-antikor kompleksi, bağlı boncuk antijenleri, vbgibi farklı koşullarda eksojen antijenleri çeşitli türleri kullanmak mümkündür. Ayrıca eksojen antijenlere karşı belirli antikor kullanarak hedef microsomes arındırmak. Birkaç ek adımlar veya değişiklikler diğer hücreleri ve antijenleri bu iletişim kuralı uygulamak için gerekli, ancak proteasome bağımlı CP moleküler mekanizmaları arasında farklı deneyler arıtılmış molekülleri karşılaştırarak aydınlatmak. Böylece, açıklanan protokolünde değişiklik ve iyileştirme için bir oda vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Takasaki Üniversitesi Sağlık ve refah tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S.
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A.
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
