Summary
השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.
Abstract
תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים מאוד עיבוד והצגת אנטיגנים אקסוגני למביטה על מחלקה histocompatibility הגדולות (MHC) אני מולקולות הידוע גם בשם צלב-מצגת (CP). CP ממלא תפקיד חשוב לא רק על הגירוי של תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים עבור זיהומיות וחסינות הגידול אלא גם ב איון של self-acting תמים T תאים על-ידי anergy תא T או מחיקה תא T. למרות המנגנון המולקולרי קריטי של CP נשאר כדי להיות הובהר, ראיות המצטבר מעיד כי אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באמצעות רשתית תוך-פלזמית-הקשורים השפלה (עירד) לאחר הייצוא מקלאסי endocytic תאים. עד לאחרונה, אפיוני של תאים endocytic אלה היו מוגבלים כי היו אין סמנים מולקולריים ספציפי חוץ אנטיגנים אקסוגני. השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, אשר מאפשר ולטיהור אלה תאים endocytic. משתמש זה מטוהרים microsome, אנחנו מחדש את עירד כמו תחבורה, ubiquitination, עיבוד של ה אנטיגן אקסוגני במבחנה, רומז כי המערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום מעובד אנטיגן אקסוגני לאחר ייצוא מזה תא הסלולר. פרוטוקול זה יכול להחיל עוד יותר על סוגי תאים אחרים כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי של CP.
Introduction
MHC אני מולקולות באים לידי ביטוי על פני השטח של כל התאים nucleated, עם פפטידים קצרים antigenic נגזר אנטיגנים אנדוגני, אשר מעובדות על-ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום ציטוזול1. לאחר עיבוד, פפטידים antigenic מועברים לתוך לומן (ER) רשתית תוך-פלזמית על ידי פפטיד לגבי המעלית מהברז. ב- ER לומן, סדרה של משגיחים ספציפית לסייע ההעמסה פפטיד, הנכון קיפול של MHC אני מורכבים. סדרה זו של מולקולות נקרא המתחם פפטיד העמסה (PLC), המציינת כי המיון תא מרכזי בשביל פפטיד מעמיסים על MHC אני2. לאחר טעינה, פפטיד MHC אני מולקולות מועברים אל פני השטח של התא, לשחק את תפקיד מרכזי במערכת החיסונית מסתגלת כמו סמני עצמית, ומאפשר CD8+ לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (Ctl) כדי לזהות תאים סרטניים או מדבקים לפי antigenic פפטידים-עצמי חלבונים3.
פפטידים antigenic מ אקסוגני אנטיגנים אנטיגן הצגת תאים (APC), הם גם מוצג בעת MHC אני4,5,6,7,8 דרך CP, אשר מתבצע בעיקר ליד DCs9,10,11. CP חיוני הן עבור הפעלת תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים לתוך אנטי-זיהומית, anti-tumoral Ctl12,13, של קיום רגישות המערכת החיסונית על-ידי inactivating של בפועל עצמית תמים T תאים14,15. החפ ק ממלא תפקידים חשובים רבים במערכת החיסון מסתגלת, אולם טרם ניתן לתאר בפירוט המנגנונים המולקולריים של CP. מחקרים קודמים של CP חשף כי אנטיגנים אקסוגני נרשמו נקודתית הן המיון והן את אנדוזום, שעובדו על-ידי עירד, רומז כי אנטיגנים אקסוגני מועברים מ אנדוזום לחדר המיון עבור עירד כמו עיבוד ופפטיד טעינת16 . עם זאת, ראיות המצטבר עולה הטעינה פפטיד של CP מתבצעת לא בחדר המיון, אלא דווקא בקלאסי מדורים endocytic, יש גם את התכונות המיוחדות של ה ER (איור 1)17,18 ,19,20,21. כדי למנוע השפלה של סימנים מקדימים פפטיד antigenic על ידי פעילות גבוהה של aminopeptidase22 ציטוזול, עיבוד, פפטיד טעינה ב CP מתרחשת באזור הפרוקסימלית של אלה תאים endocytic-קלאסי (איור 1). למרות אפיוני של תאים endocytic אלה שנויים במחלוקת, יש אין מולקולות ספציפיות קיים מלבד אנטיגנים אקסוגני במחלקה הזו.
עירד הוא מסלול סלולרי, אשר במיוחד מסיר חלבונים misfolded מחדר המיון. ב מסלול עירד, חלבונים misfolded retrogradely מועבר דרך קרום אר אל הציטופלסמה, שעובדו על-ידי24,2523,מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כאשר מולקולות גדולות, כגון חלבונים, מועברים דרך ליפידית, מולקולות אלה עוברים דרך מנגנון מולקולרי הנקרא translocon, כגון Sec61 מתחם, מתחם מיון26, ו טום מורכבים Derlin וטים מתחם המיטוכונדריה27. כאשר exogenously-נוסף אנטיגנים מועברים דרך קרום בחדר המיון, הם חייבים לחדור ליפידית במתחם עם translocons, כגון המתחם Sec61. השיטה המתוארת כאן לטהר את שלפוחית ממוקד על ידי ניצול מולקולות אלה חודר ממברנה כסמני עבור התאים endocytic.
השיטה המתוארת כאן הוא פרוטוקול טיהור שלפוחית חדשה באמצעות את התא DC דמוי קו DC2.428 , biotinylated אובלבומין (בווה) כמו אנטיגן אקסוגני. התאים endocytic היו מטוהרת על-ידי streptavidin (SA)-beads מגנטי באמצעות את בווה חודר קרום כמו מכונת. זה מטוהרים microsome, כמה exogenously נוספו בווה השתמר עדיין בחלקים ממברנה אבל היו מועברים אל מחוץ microsome ולאחר מכן ubiquitinated ומעובדים במבחנה29. זה microsome מטוהרים הכיל לא רק חלבונים ספציפיים תא endocytic, אלא גם חלבוני ER-תושב עירד, את פפטיד טעינת מורכבים; רומז תא הסלולר הוא תא endocytic פוטנציאליים עבור CP29. פרוטוקול זה אינו תלוי הסוג של אנטיגנים אקסוגני, והוא גם ישימים עבור קבוצות משנה אחרים DC וסוגי תאים אחרים, כגון מקרופאגים, תאי B ותאי אנדותל, כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי מדויק של בקרי קבוצת מחשבים CP שגורה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול תאים, תוספת של אנטיגנים אקסוגני
- הכן בווה באמצעות תיוג של ביוטין-חלבון קיט בעקבות היצרן ' פרוטוקול s.
הערה: בדרך כלל, בווה מכיל 2 מ' ביוטין לכל ביצית 1 מ' בממוצע- - DC2.4 לגדל תאים RPMI-1640 בתוספת 2 מ מגלוטמין 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ, פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, 55 מ"מ מרקפטואתנול, 10 מ מ HEPES (pH 7.5), סרום עגל עוברית 10% (להלן RPMI) ב 37 ° C 5 % CO 2 ב חממה humidified (להלן ללא אזכור, תאים מודגרת ב מצב זה). אפשרי גם להשתמש בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 3.7 g/L NaHCO 3 (להלן DMEM) במקום RPMI DMEM.
- ביום אחד לפני טיהור, פצל את התאים RPMI עונה 1 פרק 10 5 תאים/מ בצלחת תרביות רקמה. הימנע להשאיר את התאים במצב confluent. תאים DC2.4 יכול מאוד לשלב אנטיגנים אקסוגני עד מדינה confluent למחצה, אבל במהירות מאבדים את היכולת כשמגיעים למצב של יתר confluent. תאים
- לפני DC2.4 הם confluent למחצה, להוסיף µg/mL 250 של בווה עבור 1 x 10 6 תאים למ"ל, תקופת דגירה של 2-4 ה
הערה: במהלך הניסויים במורד הזרם, כל מאגרי, ריאגנטים נשמרים ב 4 ° C אלא אם צוין אחרת.
2. הכנת Microsomes
- לקצור את התאים DC2.4 על ידי pipetting עדין מהצלחת רקמה לתוך צינור חרוטי 50 מ ל.
- צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות, 4 ° C בזהירות להסיר את המדיום עם בווה על-ידי שאיפה.
- לרחוץ את התאים DC2.4 פעמיים עם 40 מ של מאגר PBS (1.37 מ מ NaCl, 8.1 מ מ נה 2 HPO 4, 2.68 מ מ אשלגן כלורי, 2 PO 1.47 אינץ מ מ ח' 4) על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות, 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי שאיפה.
- Resuspend בגדר בשלב 2.3 ב- 1 - 2 מ ל (כרך 1/20-1/10 של תרבות בינוני) המגון בינוני (0.25 M סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 10 מ מ HEPES-NaOH [pH 7.4]) עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז והעברה DC2.4 resuspended תאים לתוך מהמגן דאונס קר כקרח.
- לשבש את התאים DC2.4 resuspended בעדינות על ידי 10-20 משיחות עם מהמגן דאונס קר כקרח.
הערה: במהלך השלב שיבושים, מהמגן דאונס הוא מקורר על קרח - להעביר את המתלים שיבשו תא צינור חרוטי 15 mL-
- להוסיף 8-9 מ ל המגון בינוני הכולל 10 מ"ל, centrifuge את הצינור חרוט 10 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
- להעביר את תגובת שיקוע צינור חרוטי 15-mL החדש כדי להסיר תאים רצופה, גרעינים, centrifuge את צינור חרוטי שוב 10 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
- להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור ultracentrifugation חדש צנטריפוגה למשך 45 דקות ב 100,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בקפידה תוך 1-2 מ של המגון בינוני עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז מאת pipetting הפתרון לאורך מספר פעמים כדי להפוך שבר microsome לניסויים במורד הזרם.
- להעביר את השבר microsome לתוך צינור התחתון עגול 5-mL-
הערה: לאחר שלב זה, זה אפשרי להעשיר microsomes אובייקטיבי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות iodixanol על פי היצרן ' פרוטוקול s, כדי להסיר את microsomes שאינם ספציפיים. שברים שיא אנטיגנים אקסוגני של נאספים וכוח נתון אז השלב הבא של טיהור (שלב 3).
3. טיהור של Microsomes עם בווה עירד שעברו
- נפח הוסף 1/100 מערכו של טרי חרוזים SA-מגנטי כדי השבר microsome של צעד 2.11 ב 5 mL סיבוב התחתית התחתונה.
הערה: לפני שלב זה, זה אפשרי לנקות את השבר microsome מראש על ידי חרוזים שליטה-מגנטי כדי להפחית את contaminations של microsomes שאינם ספציפיים. - מערבבים היטב ובעדינות לסובב את הצינור התחתון עגול לאט במשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס
- להוסיף 2-3 מ"ל של מדיום המגון הכולל 4 מ"ל לתוך הצינור התחתון עגול ומערבבים בעדינות היטב.
- למקם את הצינור התחתון עגול על דוכן מגנטי, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס. מאז החרוזים קשורה השלפוחיות המוגלתיות נמשכים למגנט, חום מיקרו-חרוזים יצטברו בהדרגה אל הקיר הצינור הקרוב למגנט.
- עם הצינור שנותרו הדוכן מגנטי, בזהירות למחוק את supernatants על ידי השאיפה להסיר את השלפוחיות המוגלתיות לא מאוגד.
- לשטוף החרוזים מגנטי קשורה השלפוחיות המוגלתיות פעמיים עם 5 מיליליטר המגון בינוני על ידי המגנטי לעמוד 10 דקות ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי השאיפה בזהירות.
הערה: ללא העמדה מגנטי, טיהור על ידי centrifugations ב g x 2,000 למשך 10 דקות, 4 ° C זמין גם. - Resuspend החרוזים מגנטי קשורה השלפוחיות המוגלתיות היטב במדיום 100 µL המגון על-ידי pipetting הפתרון לאורך מספר פעמים.
- להעביר השלפוחיות המוגלתיות resuspended microtube חדשים כמו microsome מטוהרים לניסויים במורד הזרם.
הערה: בדרך כלל, 50 שבר microsome של µL, המכיל 5-20 חלבונים µg מתאי 7 עונה 1 פרק 10 ניתן לבודד.
4. ניתוח של Microsomes לטהר
- Resuspend המגנטי חרוזים מאוגדים השלפוחיות המוגלתיות מ 3.8 צעד 100-200 µL TNE מאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז במקום המדיום המגון.
- להעביר את lysate שלב 4.1 microtube החדש 1.5-mL-
- לקבוע ריכוז חלבון שלב 4.2 באמצעות ערכת assay BCA לכל היצרן ' פרוטוקול s.
הערה: בדרך כלל, 5-10 µL lysate מהשלב 4.2 מספיקה כדי לקבוע ריכוז חלבון. - להעביר את lysate מהשלב 4.2 (2 µg של חלבון עבור צביעת כסף ו 10 µg של חלבון עבור סופג המערבי) לתוך חדש microtubes.
- לשים את microtubes על גוש חום-95 ° C ומרתיחים חלבונים 1 x מרחביות ג'ל-טעינת מאגר (100 מ מ טריס-HCl pH 6.8, 200 מ"מ dithiothreitol, 4% מרחביות, 0.2% bromophenol כחול, 20% גליצרול) עבור 5 דק
- Centrifuge את microtubes 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtubes חדש כדי להסיר את השברים לא מסיסים.
- לנתח את החלבונים נפתרה בשלב 4.6 (2 µg) מאת SD רגיל-דף.
- Visualize הלהקות חלבונים על ידי כסף מכתים באמצעות צביעת כסף קיט בעקבות היצרן ' פרוטוקול s.
- לנתח את החלבונים נפתרה בשלב 4.6 (10 µg) על ידי SD-דף רגיל סופג-מערבי. השתמש הכימית (SA-HRP) לכל היצרן ' s פרוטוקול והמחש מאת fluorography.
5. במבחנה בנייתו מחדש של עירד Ubiquitination של בווה באמצעות מטוהר Microsomes
microsomes- העברה מטוהרים (5-10 µg של חלבון) משלב 3.8 עם נפח 50% של רטיקולוציט lysate (RL), 1 x תגובת מאגר (50 מ מ טריס pH 7.4, 3 מ מ ATP, 0.5 מ מ MgCl 2), ו- 0-שתיים pM מתויג דגל אוביקוויטין ב microtube החדש. הנפח הסופי של הניסוי הזה הוא 20-40 µL.
- Incubate microtube עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: אם כמות ubiquitinated בווה בשלב 5.12 הוא קטן מדי כדי לזהות סופג המערבי, להוסיף 10 מיקרומטר של MG132 או 2 מיקרומטר של lactacystin כדי לעכב את העיבוד של בווה ubiquitinated מאת proteasomes. - לעצור את התגובה על ידי הצבת את microtube על קרח
- לפתור את microsomes על-ידי הוספת 500 מאגר TNE µL עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז.
- צנטריפוגה microtube 10 דקות ב- 21,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtube חדשים להסיר את השברים לא מסיסים, אשר מכילים בווה ubiquitinated ב DC2.4 לפני וזמינותו ubiquitination במבחנה.
- להעביר את תגובת שיקוע microtube חדש ולהוסיף 1/100 בכמויות החרוזים SA-מגנטי חדש (בדרך כלל 5 µL עבור 500 µL של supernatants).
- מערבבים היטב ובעדינות לסובב את microtube לאט לאט במשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס
- Centrifuge את microtube 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע על ידי השאיפה לשחזר את בווה ואת ubiquitinated בווה מאוגד עם החרוזים SA-מגנטית.
- לשטוף פעמיים את החרוזים SA-מגנטית שנאספו עם 1 מ"ל של מאגר TNE על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע בכל פעם על ידי שאיפה.
- להרתיח את החרוזים SA-מגנטית 1 x ג'ל מרחביות טעינת מאגר עבור 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס על חום-בלוק לפתור את החלבונים מטוהרת על-ידי החרוזים SA-מגנטית.
- Centrifuge את microtube 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtube חדשים להסיר את השברים לא מסיסים.
- לנתח את החרוזים SA-מגנטית חייבים את החלבונים על ידי עמודים SD סטנדרטי, לא סופג-מערבי. השימוש של נוגדנים (אנטי-דגל נגד-multi-Ub, העכבר אנטי איג-HRP) ו הכימית (SA-HRP) הוא לפי היצרן ' פרוטוקול s ודמיינו ידי fluorography.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התירי את המנגנון המולקולרי של CP, יש צורך לזהות את התאים הסלולר, איפה אנטיגנים אקסוגני עוברים עירד כמו תחבורה, עיבוד. בעוד תצפיות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescent או באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מזוהה תא הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני שנצבר16,17,18,19, 30,31,32,33, התאים הסלולר עירד כמו עיבוד של אנטיגנים אקסוגני אינם מוגדרים בבירור. לאחרונה זה הראו כי endosomes-קלאסי עם מולקולות תושב בחדר המיון היו אחראים על CP34, אבל אלה תאים סלולריים היו ולזרימה. הקושי לבודד וטיהור התאים הסלולר ניתן לייחס לעובדה אנטיגנים אקסוגני מותאמים הן אנדוזום, כמו מיון תאי וכי אין מולקולה מזהים עבור אלה תאים endocytic אחרים מאשר אנטיגנים אקסוגני. עם זאת, התנאי של אנטיגנים אקסוגני שעברו עירד כמו תחבורה שונה ממצב למצב יציב; במעבר על פני הממברנה ריאקציה דו-מולקולרית השומנים, אנטיגנים אקסוגני לחדור את הקרום ויה translocons, כגון Sec61 (איור 2 א). לפיכך, בעת שימוש בווה כמו אנטיגן אקסוגני, בווה אמור להיות משויך Sec61. מאז בווה ממברנה-הקשורים מאוגדים באופן ספציפי עם SA, microsome המוכן DC2.4, אשר היה pretreated עם בווה, יכול להיות מבודדת לגמרי על ידי beads מגנטי-SA (איור 2 א). ואז כמויות שוות ערך של חלבונים מן מטוהרים microsomes עם או בלי קדם דגירה של בווה שנפתרו על ידי מרחביות-דף ואחריו צביעת כסף, סופג המערבי עם SA-HRP (איור 2B, ג 2). כפי שמוצג באיור 2B , איור 2C, microsomes מבודדים הכיל מספר חלבונים ייחודיים היו מטוהרים תלויה בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. בנוסף חלבונים ייחודיים אלה, microsomes מבודדים הכיל גם חלבונים ספציפי, אשר קשורה beads מגנטי-SA עם או בלי בווה. טיפול microsome עם טריפסין לפני טיהור על-ידי המגנט מנעה הטיהור של microsomes (איור דו-ממדי), המציין את שיטות טיהור תלויים הנוכחות של קרום חודר בווה.
Microsomes מטוהרים הראה היכולת ubiquitinate ה בווה incorporated במבחנה, תחת הנוכחות של RLs (איור 3 א). כמויות בווה, בווה פולי-ubiquitinated היו augmented בנוכחות MG132 (איור 3B), המציין בווה incorporated היה מעובד על ידי מערכת עירד שלנו microsomes מטוהרים הכיל עירד מכונות חלבונים.
איור 1: מסלולים תאיים על CP in DCs- ב- Dc, אנטיגנים אקסוגני מועברים לתוך מדורים endocytic-קלאסי, גם מכילים מולקולות אר-תושב בנוסף מולקולות של אנדוזום מאוחר קלאסית. במחלקה הזו, אנטיגנים אקסוגני מיוצאים לתוך ציטוזול דרך translocons כגון Sec61. ב ציטוזול, מעובדים אנטיגנים אקסוגני על ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום לתוך פפטידים antigenic בשם דיאלקטריים עירד. פפטידים antigenic מובלים אל תוך תאי endocytic-קלאסי זהה או סמוכים, או ER סמוכים דרך המעלית מהברז והעמיסו מכן על MHC אני מולקולות על ידי בקר לוגי מיתכנת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: טיהור של Microsomes עם בווה עירד שעברו. (א) א דגם סכימטי של טיהור של microsomes עם בווה שעברו עירד. בווה מזוהה עם הקרום דרך translocon Sec61, ממוקד עם חרוזים SA-מגנטית. Microsomes (B) עם (+) או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה היו מטוהרים (+) עם או בלי חרוזים SA-מגנטית (-). חלבונים (2 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים שנפתרו בדף-7.5-15% מרחביות, צביעת כסף שימש כדי להמחיש להקות חלבון. משולשים בצד ימין מציינים חלבונים ספציפי מחייב את החרוזים SA-מגנטית. משולשים עם כוכביות מציינים חלבונים ייחודיים נמצאו רק בנוכחות בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. החץ מראה בווה. (ג) Microsomes (+) עם או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה היו מטוהרים (+) עם או בלי חרוזים SA-מגנטית (-). חלבונים (10 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים היו נפתרה בדף-7.5-15% מרחביות, שעבר Western סופג עם SA-HRP. P.N.: שבר כור גרעיני. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. (ד) Microsomes עם תוספת מוקדמת של בווה היו טהור עם חרוזים SA-מגנטית. Microsomes שטופלו (+) או בלי טריפסין (-) ו- TX-100 לפני טיהור (שמאל שני נתיבים) או לאחר טיהור (נכון בשני נתיבים). חלבונים (2 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים שנפתרו בדף-7.5-15% מרחביות, צביעת כסף שימש כדי להמחיש להקות חלבון. משולשים בצד ימין מציינים חלבונים ספציפי מחייב את החרוזים SA-מגנטית. משולשים עם כוכביות מציינים חלבונים ייחודיים נמצאו רק בנוכחות בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. הודפס מחדש באישור מ הפניה28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: במבחנה הכינון של עיבוד, Ubiquitination באמצעות ביצית Microsomes טהור. Microsomes (א) Purified עם (+) או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה שטופלו (+) או בלי (-) RL, דגל-Ub עבור 1 h, היו solubilized באמצעות TNE. בווה היה טהור עם חרוזים SA-מגנטית, שעבר Western סופג עם נוגדנים המצוין. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. (B) Purified microsomes שטופלו (+) או בלי (-) RL הדגל-Ub, MG132 עבור 1 h, היו אז solubilized באמצעות TNE. בווה היה טהור עם חרוזים SA-מגנטית, נתון סופג המערבי עם SA-דגל. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. הודפס מחדש עם permission מ הפניה28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקרים קודמים של CP, אנטיגנים אקסוגני incorporated שהצטברו באזור הסגור של אנדוזום מאוחר או מיון על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent16,30,31,32. ההערכה היא כי עירד כמו תחבורה, עיבוד של אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באזורים מיוחדים אלה של מיון או אנדוזום מאוחר, כמו תא הסלולר זוהה על ידי סוכרוז או iodixanol צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע באמצעות בווה ubiquitinated כמו סמן עיבוד עירד דמוי. לאחר גירוי שלהם מולדת חסינות, יעילות CP גדל באופן משמעותי, השבר שיא עבור בווה יחד עם ubiquitinated בווה היגרו לשבר צפיפות גבוהה יותר (שלנו שלא פורסמו תוצאות). המטרות של ניסויים אלה היו לזהות סמנים מולקולריים ספציפי עבור מיון או אנדוזום המנוח, אשר הועברו יחד עם בווה או ubiquitinated בווה. אבל בתוצאות, הן מולקולות תושב ER ומולקולות מאוחר אנדוזום תושב הועבר יחד עם בווה, ubiquitinated בווה, המציין כי ניסויים אלה היו כושלים ברור תא הסלולר להעברה כמו עירד ועיבוד ER קלאסית או אנדוזום מאוחר. בניסויים אלה, היו מולקולות ספציפיות לא התאים endocytotic למעט בווה או ubiquitinated בווה. עם זאת, בעוד אקסוגניים אנטיגן עברה עירד כמו תחבורה, מולקולות אלה חדרו קרום bilayer השומנים של חדר המיון דרך translocons, כגון Sec61 מורכבים (איור 1, דמות 2A). קרום דבק בווה נבחר כסמן של התאים endocytic, microsomes היו מטוהרת על-ידי beads מגנטי-SA (איור 2 א, 2 ב). באלה microsomes מטוהרים, בווה שהצטברו נתקלתי עירד דמוי ubiquitination ועיבוד תחת הנוכחות של RL ו- ATP במבחנה (איור 3A, 3B). כיוון RL מכיל את כל apparati cytosolic מולקולרית, כגון מולקולות הקשורות ubiquitination ו- proteasomes בנוסף מולקולות תרגום, תמלול, התוספת של RL מאפשר ubiquitination של בווה ב microsome מטוהרים. תוצאות אלה מציינים כי מטוהרים microsomes היו תאים סלולריים אובייקטיבית עירד כמו תחבורה, עיבוד של אנטיגנים אקסוגני, שניהם המכילה מולקולות ספציפיות אנדוזום ומולקולות שוכנת בחדר המיון באותו הזמן; Lamp1 הראה קודמן וטפסים בוגר microsome מטוהרים.
פרוטוקול זה הוא תלוי כמות חודר ממברנה אנטיגנים אקסוגני; חשוב לשלב מספיק של אנטיגנים אקסוגני לתאים DC2.4, שמציג יכולת גבוהה לשלב אנטיגנים אקסוגני במדינה confluent למחצה. מתארך זמן הדגירה 6-12 h עבור DC2.4 עם בווה מגדילה את כמות בווה incorporated. התוספת של מעכבי proteasomes, MG132 או lactacystin, במתינות מגדילה את כמויות microsomes מטוהרים. הכנת microsome הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר עבור פרוטוקול זה. בווה חינם, אשר היא אינה מעוגנת לתוך תאים DC2.4, יש להסיר על ידי שטיפת התאים עם PBS, כדי למנוע שאינם ספציפיים עקידת בווה חינם השבר microsome. כדי לצמצם את הנזקים על קרום התאים, התאים הם מובסים בקפידה מהמגן דאונס במי קרח. ואז תאים רצופה, גרעינים הוסרו על ידי צנטריפוגה כפי microsomes הוכנו מן השבר כור גרעיני. לאחר הכנת microsomes, מתבצע טיהור בשלב אחד על ידי חרוזים SA-מגנטית. בשלב זה, רחיצת בזהירות microsome מגנט מאוגד יש צורך להסיר את הכריכה לא ספציפית של תאים סלולריים אחרים, ולא לאבד את microsome מאוגדים באופן ספציפי.
בשיטה זו טיהור צעד אחד, נדרש אחוז משמעותי של microsome המטרה. אם היחס בין microsome אובייקטיבית הוא קטן מדי, כמות היעד מטוהרים microsome מקטין על ידי תחרות עם איגוד שאינם ספציפיים של תאים סלולריים אחרים. כתוצאה מכך, בתנאים האלה, את enrichments של microsome המטרה, את הסיווג של microsome שאינם ספציפיים יהיה צורך. אפשרי גם להציג צעדים נוספים לפני טיהור מאת החרוזים SA-מגנטית. צעד כזה הוא סוכרוז או iodixanol צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה של microsome. מאז microsomes מוכן להכיל כל המוצרים ממברנה, זה יכול להיות אפשרי להעשיר את microsome היעד לפני SA-מגנטית טיהור חרוזים על-ידי בחירת אנטיגן שברים עשיר לטיהור צעד אפשרי נוסף הוא סיווג מראש של microsome על ידי שליטה-מגנטית חרוזים בלי SA, כדי להפחית את אגודות שאינם ספציפיים רקע microsomes נגד beads מגנטי-SA. בניסויים אלה, שני צעדים משופרת על טוהר microsome היעד ביעילות, אך פחתה הסכום הכולל של מוצרים מטוהרים, המציין שאלה צעדים נוספים נבחרו כאמצעי לניסויים נוספים.
ידוע שצנטריפוגה במהירות גבוהה זה הוכח לגרום היתוך או קרישה של שלפוחית תאיים. אלה fusions או clottings תפיק microsomes מלאכותי, אשר נגזרות שאינם ספציפיים האינטראקציה בין סוגים שונים של אברון-derived שלפוחית. Microsomes מלאכותיים אלה מכילים סטטיסטית בכל מולקולה ממברנה כגון מולקולה תושב מיטוכונדריאלי, מולקולה תושב גולג'י, ועוד. Microsomes מטוהרים הללו לא כללו caveosome תושב חלבונים, חלבונים תושב גולג'י, או חלבונים תושב אנדוזום מוקדם, כגון caveolin1, GM130, EEA1, המציין כי microsomes SA-לטהר אינם מוצרים מלאכותיים נגזר המיזוג בין סוגים שונים של שלפוחית. ללא צנטריפוגה במהירות גבוהה, שלפוחית. לאונרד-בווה היו מבודדים, אבל הניסויים שליטה של שלפוחית ללא בווה הראתה כמויות גבוהות יותר של מולקולות שאינם ספציפיים. אפשרות זו מציינת כי שיטה ראשונית זו היא די לניסויים רצופים, כי הצעד צנטריפוגה מהירה הכרחי עבור פרוטוקול זה טיהור.
פרוטוקול זה חל על סוגי תאים אחרים, כגון קבוצות משנה DC שונה או אחרים נגמ שים. . זה גם ניתן להשתמש סוגים שונים של אנטיגנים אקסוגני במצבים שונים, כגון חלבונים פלורסנט, קומפלקס אנטיגן-נוגדן, חרוזים מאוגד אנטיגנים, וכו '. יתר על כן, אנו יכולים לטהר microsomes היעד באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד אנטיגנים אקסוגני. למרות מספר פעולות נוספות או שינויים, ייתכן שיהיה צורך להחיל לפרוטוקול זה על תאים ו אנטיגנים אחרים, זה יכול להבהיר את המנגנונים המולקולריים של המוצב פרוטאוזום תלוית על-ידי השוואת מולקולות מטוהרים בין ניסויים שונים. כך, הפרוטוקול המתואר יש חדר שינוי ושיפור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסאקי של בריאות ורווחה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S.
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A.
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
