Summary
这里介绍的方法是一种新的囊泡隔离协议，允许纯化细胞的车厢外源性抗原处理由内质网关联退化跨演示文稿中的地方。
Abstract
树突状细胞 (Dc) 是高度能够处理和后主要组织相容性类 (MHC) 的内化外源抗原呈递我分子也被称为跨演示文稿 (CP)。CP 扮演重要的角色，不仅在天真 CD8 的刺激+ T 细胞和 CD8 记忆+ T 细胞的传染性，而且在自立式灭活肿瘤免疫 t 细胞的 T 细胞无能或 T 细胞删除。虽然 CP 的关键分子机制仍有待澄清，越来越多的证据表明外源抗原进行处理通过内质网关联降解 (ERAD) 后从非古典出口内吞隔间。直到最近，刻画这些细胞内吞的车厢都有限，因为有没有除了外源性抗原的特异分子标记。这里介绍的方法是一种新的囊泡隔离协议，允许纯化这些细胞内吞的车厢。我们使用此纯化的微粒，重组 ERAD 像运输、 泛素化和处理的外源性抗原体外，暗示泛素-蛋白酶体系统后从这出口加工外源性抗原细胞的隔间。该协议可以进一步应用于其他细胞类型以澄清 CP 的分子机制。
Introduction
MHC 我用内源性抗原，由泛素-蛋白酶体系统在胞浆1处理短抗原肽表达上所有的有核细胞表面的分子。经处理后，抗原肽被送入内质网 (ER) 腔通过肽转运蛋白水龙头。在 ER 腔，一系列特定的分子伴侣的协助肽加载和正确折叠的 MHC I 复合。这一系列的分子称为肽加载复杂 (PLC)，指示 ER 车厢中部为肽加载在 MHC2。后加载，多肽 MHC 我分子被运送到细胞表面，在发挥关键作用自适应免疫系统自我标记，以及使 CD8+细胞毒性 T 淋巴细胞 (Ctl) 来检测癌细胞或传染性病原体的抗原从非自我蛋白质3肽。
在抗原提呈细胞 (APC)，从外源抗原的抗原肽也出示 MHC 我4，，56，7，8 通过CP，其中主要进行由 DCs9，，1011。CP 是必不可少的两个为激活天真 CD8+ T 细胞和 CD8 记忆+ T 细胞抗感染和抗肿瘤 Ctl12，13，和在维持免疫耐受的失活自署理幼稚 T 细胞14，15。CP 许多重要作用中自适应的免疫系统，然而 CP 的分子机制尚未予以详细说明。以前对 CP 的研究揭示了外源性抗原被本地化在急诊室和内体和通过 ERAD，暗示外源抗原从内体运到 ERAD 样加工和肽加载16 ER 进行处理.然而，越来越多的证据表明 CP 的肽加载进行不在急诊室，而在于非经典的内吞车厢，也有特色的 ER (图 1)17，18 ，19，，2021。通过来避免退化的抗原肽前体肽氨基肽酶活性较高22胞液、 加工和多肽在 CP 中加载发生在近端地区的这些非经典的内吞车厢 (图 1)。虽然这些细胞内吞的车厢的刻画是有争议的没有现有的特定分子，除了这个包间的外源性抗原。
ERAD 是细胞通路，专门从急诊室中移除错误折叠的蛋白质。ERAD 通路中错误折叠的蛋白是逆行通过对细胞质 ER 膜运输和处理由泛素-蛋白酶体系统23，，2425。大分子，比如蛋白质，运输时通过脂质双分子层，这些分子通过分子的装置称为解，如 Sec61 复杂和德林在 ER26，和汤姆复杂复杂和蒂姆在复杂线粒体27。当外部添加抗原是通过内质网膜，他们必须穿透脂质双分子层中复杂的 translocons，例如 Sec61 复杂。这里介绍的方法通过利用这些膜穿透的分子标志物在细胞内吞的隔间作为纯化有针对性的囊泡。
这里介绍的方法是一种新的使用作为外源性抗原的树突状细胞线 DC2.428和生物素化的卵清蛋白 （宝物） 的囊泡净化协议。内吞的车厢进行纯化的链霉亲和 (SA)-磁珠作为制造商使用膜穿透宝物。在这纯净的微粒，一些外部添加宝物仍保持膜组分中但被运到外面的微粒体，然后泛素化和处理体外29。这纯净的微粒体载不仅吞隔间特异性蛋白二村居民蛋白质 ERAD 和肽加载复杂;建议细胞隔间 CP29前瞻性吞车厢。本议定书依赖外源性抗原，这种并不是也适用于其他 DC 亚群和其他细胞类型，如巨噬细胞、 B 细胞和内皮细胞，以澄清精通 CP DCs 的精确分子机制。
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Protocol
1.生长细胞与外源性抗原另外
- 准备宝物使用生物素蛋白标记试剂盒随着制造商 ' s 协议。
注意： 通常，宝物平均包含 2 M 生物素每 1 M OVA。 - 成长 DC2.4 细胞在 RPMI 1640 辅以 2 毫米 L-谷氨酰胺、 丙酮酸钠 1 毫米、 0.1 毫米非必需氨基酸，100 U/mL 青霉素-链霉素、 2-巯基乙醇 55 毫米，10 毫米复 (pH 7.5)，10%胎牛血清 (以下简称 RPMI) 在 37 ° C 在 5%CO 2 在湿的孵化器 （以下简称未提及，细胞孵育在这种情况）。它也是可以使用辅以 3.7 g/L 碳酸氢钠 3 (以下简称 DMEM) 代替 RPMI 10%胎牛血清的 DMEM。
- 提纯前, 一天，细胞分成 RPMI 细胞培养板 1 × 10 5 细胞/毫升。避免将存放在汇合状态细胞。DC2.4 细胞可以高度纳入外源性抗原直到半汇合的国家，但迅速达到过度汇合状态后失去能力。
- 前 DC2.4 细胞半汇合，添加 250 微克/毫升的宝物为 1 x 10 6 细胞/毫升，孵育 2 4 h.
注： 下游在试验期间，所有缓冲区及试剂均都保持 4 ° C 除非另有说明。
2。微粒的制备
- 收获 DC2.4 细胞吹打温柔从组织板成一种新型的 50 毫升锥形管。
- 在 1,000 x g 离心 5 分钟，4 ° C 和小心取出宝物的介质由志向。
- 洗 DC2.4 细胞两次 40 毫升的 PBS 缓冲 (1.37 mM NaCl，8.1 毫米 Na 2 HPO 4，2.68 毫米 KCl，1.47 毫米 KH 2 PO 4) 在 1 5 分钟，4 ° C，x 000g 离心，弃上清每次吸入。
- 重悬颗粒在步骤 2.3 在 1-2 毫升 （1/20-1/10 体积的培养基） 的均质介质 （0.25 M 蔗糖，1 毫米乙二胺四乙酸，10 毫米复-氢氧化钠 [pH 7.4]） 与 1/1,000 容量的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和转让再悬浮 DC2.4 细胞移植冰冷的 Dounce 均质机。
- 破坏悬浮的 DC2.4 细胞轻轻由 10-20 笔画用冰冷的 Dounce 均质机。
注意： 在中断步骤中，Dounce 均质机在冰上冷却 - 转移到新的 15 毫升锥形管中细胞破坏悬浮。
- 8 9 毫升同质化培养基添加 10 毫升总和离心 10 分钟 x g 2000 及 4 的锥形管 ° C.
- 将上清液转移到新的 15 毫升锥形管，若要删除连续的细胞和细胞核，和离心机的锥形管再 10 分钟 x g 2000 及 4 ° C.
- 上清液转移到新的离心管和离心机 45 分钟在 100000 x g 及 4 ° C.
- 吸出上清液和悬小球仔细在 1-2 毫升的均质介质与 1/1,000 容量的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒吹打数次，使下游实验的微粒分数解决方案。
- 将微粒体部分转移到新 5 毫升圆底管。
注： 此步骤完成后，有可能通过努力丰富客观微粒碘密度梯度离心法根据制造商 ' s 协议，删除非特定微粒体。对外源性抗原的峰值分数是收集，然后遭受净化 （步骤 3） 的下一步。
3。宝物的微粒净化术 ERAD
- 添加 1/100 卷的新鲜 SA 磁珠步 2.11 在 5 毫升的微粒分数圆底管。
注意： 在此步骤中之前, 有可能预先通过控制磁性微球，以减少非特定微粒污染物清除微粒分数。 - 轻轻拌匀，旋转圆底管慢慢为 30 分钟，在 4 ° C.
- 2-3 毫升的均质介质 4 毫升总成圆底管加上轻轻拌匀。
- 将圆底管放在磁性表座和孵育 10 分钟在 4 ° c。由于绑定到囊泡的珠子都被磁铁吸引，棕色微珠便会逐渐积聚到管壁靠近磁铁。
- 与管剩余的磁性的立场，认真上清液通过放弃愿望要删除未绑定的囊泡。
- 洗磁珠绑定到两次用 5 毫升的均质介质囊泡的磁站 10 分钟在 4 ° C，弃上清，每次通过仔细的愿望。
注： 无磁性的支架，通过在 2,000 x g 10 分钟洗涤净化 4 ° C 也是可用。 - 重悬磁珠绑定到 100 µ L 均质介质中仔细囊泡吹打数次解决方案。
- 中，再悬浮小泡将转入新的微管作为纯化微粒体下游实验。
注意： 通常情况下，包含 5-20 微克蛋白质从 1 × 10 7 细胞的 50 µ L 微粒分数可以是孤立。
4。分析纯化微粒
- 重磁悬珠绑定到囊泡从加强开展自评、 缓冲区的 100-200 微升 3.8 (20 毫米三 HCl pH 7.4，150 毫米氯化钠，0.5 M EDTA 1%Nonidet P-40) 与 1/1,000 容量的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒而不是同质化介质。
- 转移裂解步骤 4.1 到新 1.5 毫升捩。
- 通过使用 BCA 试剂按制造商确定蛋白质浓度的步骤 4.2 ' s 协议。
注意： 通常情况下，5-10 µ L 裂解液从步 4.2 就足以确定蛋白质浓度。 - 转入裂解步骤 4.2 （的银染蛋白 2 微克和 10 微克的蛋白质印迹） 从新微细管。
- 微细管放在 95 ° C 和煮蛋白 1 x SDS 凝胶加载缓冲区中的加热块 (100 毫米三 HCl pH 6.8，200 毫米醇，4%的 SDS，0.2%溴酚蓝，20%的甘油) 5 分钟
- 离心 10 分钟 x g 21,500 和 4 微细管 ° C.收集上清液到新微细管来删除不溶性小数。
- 分析步骤 4.6 （2 微克） 的标准 SD 页的解决的蛋白质。
- 可视化蛋白条带的银染采用银染技术工具包之后制造商 ' s 协议。
- 分析步骤 4.6 （10 微克） 的标准 SD 页和蛋白印迹的解决的蛋白质。按制造商使用试剂 (SA-HRP) ' s 协议和透视的照相机通过可视化。
5。在体外重构的 ERAD 泛素化的宝物使用纯化微粒体
- 转让纯化微粒 （5-10 微克的蛋白） 从 50%体积的网织红细胞裂解液 (RL)，在 x 反应缓冲区 (50 毫米三 pH 7.4，3 毫米 ATP，0.5 毫米氯化镁 1 步 3.82)，和 12:02 下午旗子标记泛素新的微管。这个实验的最终数量是 20-40 微升。
- 孵育 2 h 37 微 ° C.
注意： 如果步骤 5.12 中泛素化宝物量太小，免疫印迹法检测，添加 MG132 10 μ M 或随着由蛋白酶体抑制的泛素化宝物处理 2 μ M。 - 阻止通过放置在冰上的微反应
- 解决微粒体加入 500 µ L 开展自评、 缓冲区 1/1,000 量的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。
- 微管离心机以离心 10 分钟 21,50x g 和 4 0 ° C.收集上清液到新的微管，要删除的不溶性的分数，包含在 DC2.4 前测定 体外 泛素化的泛素化宝物。
- 将上清液转移到新的微管和添加新 SA-磁珠 （通常为 500 µ L 的上清液 5 μ） 的 1/100 卷。
- 轻轻拌匀，慢慢为 30 分钟微圆管内旋转在 4 ° C.
- 离心 10 分钟 x g 21,500 和 4 微 ° C.Discard 的渴望恢复的宝物和泛素化宝物上清绑定与 SA 磁珠。
- 洗两次收集的 SA-磁珠与 1ml 上层缓冲液离心 10 分钟 x g 21,500 和 4 ° C.丢弃每次吸上清液。
- 煮 1 x SDS 凝胶缓冲液 5 分钟在 95 ° C 加热块以 SA 磁珠解决纯化的蛋白对 SA-磁珠。
- 离心 10 分钟 x g 21,500 和 4 微 ° C.收集上清液到新的微管，要删除的不溶性的分数。
- 分析绑定到蛋白质的标准 SD 页和蛋白印迹 SA 磁珠。使用抗体 （抗旗、 反-多-Ub 和抗鼠 IgG HRP） 和试剂 （SA-辣根过氧化物酶） 是按制造商 ' s 协议和可视化的透视的照相机。
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Representative Results
为了阐明 CP 的分子机制，是有必要确定细胞的隔间，外源抗原在哪里接受 ERAD 样运输和加工。虽然通过免疫荧光显微镜或电子显微镜的观察确定外源抗原在那里积累16，17，，1819，细胞室 30，，3132，33，ERAD 样加工外源性抗原的细胞隔间没有明确的界定。最近研究表明，非经典细胞质与 ER 驻地分子负责 CP34，但这些细胞的车厢被粗。在分离与纯化细胞车厢困难可以归因于事实外源性抗原被本地化体膜和 ER-车厢和是有这些细胞内吞的车厢没有识别分子其他比外源性抗原。不过，外源性抗原经历 ERAD 样运输的条件是不同的稳定状态;在跨脂质双分子膜运输，外源性抗原渗透膜通过 translocons，Sec61 等 (图 2A)。因此，当使用作为外源性抗原的宝物，宝物应与 Sec61 相关联。由于膜相关宝物专门绑定与 SA，微粒制备 DC2.4，预处理的宝物，会被孤立鲜明 SA 磁珠 (图 2A)。然后采用 SDS — PAGE 银染色和免疫印迹 SA-辣根过氧化物酶 (图 2B、 2c) 其后解决了相同数量的蛋白质纯化微粒体有无预孵化的宝物。如图 2B和图 2所示，孤立的微粒所载纯化取决于外部添加的宝物和 SA 磁珠的几种独特蛋白质。除了这些独特的蛋白质，孤立的微粒还载有非特异性蛋白，绑定到 SA-磁珠有无宝物。微粒体胰蛋白酶净化由磁铁禁止纯化微粒 (图 2D)，表明分离纯化方法之前的治疗取决于膜穿透宝物的存在。
纯化的微粒体注册的宝物体外，RLs (图 3A) 存在下显示 ubiquitinate 的能力。大量宝物和聚泛素化宝物被扩充在 MG132 (图 3B)，指示注册的宝物由 ERAD 系统处理和我们纯净的微粒体载 ERAD 机械蛋白质。
图 1： 细胞内通路在 DCs 中的 cp。在 DCs，外源性抗原运入非经典内吞的隔间，也含有二村居民分子除了古典后期体膜的分子。在这个车厢里，外源性抗原被出口入胞液通过 translocons Sec61 等。在细胞质内外源性抗原由泛素-蛋白酶体系统成抗原肽作为处理 ERAD 基板。抗原肽被送入相同或相邻的非经典吞车厢或通过水龙头转运体相邻 ER，然后装上 MHC 我分子由 PLC。请点击这里查看此图的大版本。
图 2： 纯化与宝物微粒体经历 ERAD。(A) A 的原理模型的纯化与宝物经历 ERAD 微粒。宝物是通过 Sec61 解膜与关联和有针对性的与 SA 磁珠。(B) 微粒体带有 （+） 或 （-） 没有事先加法的宝物被纯化 （+） 或无 （-） SA 磁珠。7.5-15 %sds — page，解决了蛋白质 (2 µ g) 或相应数量的纯化蛋白和银染技术用于可视化蛋白条带。在右边的三角形指示绑定到 SA 磁珠的非特异性蛋白。三角形与星号表明独特的蛋白质发现只有在外部添加的宝物和 SA 磁珠。箭头显示宝物。(C) 微粒体带有 （+） 或 （-） 没有事先加法的宝物被纯化 （+） 或无 （-） SA 磁珠。蛋白质 （10 微克） 或相应数量的纯化蛋白 7.5 15 %sds — page，解决并遭受 SA-辣根过氧化物酶免疫印迹。大法官： 后核分数。在权利的星号表示非特定波段 SA-辣根过氧化物酶。通过至少三个独立化验得出了相同的结果。(D) 微粒的宝物事先加与 SA 磁珠进行纯化。微粒体患者 （+） 或无 （-） 胰蛋白酶和 TX-100 （左两条行车线） 的提纯前或后净化 （右二车道）。7.5-15 %sds — page，解决了蛋白质 (2 µ g) 或相应数量的纯化蛋白和银染技术用于可视化蛋白条带。在右边的三角形指示绑定到 SA 磁珠的非特异性蛋白。三角形与星号表明独特的蛋白质发现只有在外部添加的宝物和 SA 磁珠。通过至少三个独立化验得出了相同的结果。转载引用28日许可。请点击这里查看此图的大版本。
图 3：体外重组的加工和泛素化在纯化的肝微粒体中使用 OVA。(A) 纯化微粒体带有 （+） 或 （-） 没有事先加法的宝物被处理 （+） 或无 （-） RL 和国旗 Ub 为 1 h 和全部溶解使用上层。宝物被净化与 SA 磁珠和遭受表明抗体免疫印迹。在权利的星号表示非特定波段 SA-辣根过氧化物酶。通过至少三个独立化验得出了相同的结果。(B) 纯化微粒体患者 （+） 或无 （-） RL、 国旗 Ub 和 1 h MG132，然后全部溶解使用上层。宝物被纯化 SA 磁珠和遭受印迹与 SA 旗。在权利的星号表示非特定波段 SA-辣根过氧化物酶。通过至少三个独立化验得出了相同的结果。转载与安家从参考28n。请点击这里查看此图的大版本。
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Discussion
在以往研究中的 CP，注册外源抗原在禁区的晚体膜或 ER 通过免疫荧光显微镜16，30，，3132积累。据估计在这些专业领域的 ER 或晚体膜进行 ERAD 样运输和加工的外源性抗原细胞室是由蔗糖或碘密度梯度离心法分离使用标识泛素化作为一种 ERAD 样处理标记的宝物。后刺激他们先天免疫，CP 效率显著提高，和峰值分数为与泛素化宝物宝物迁移到更高的密度分数 （我们未发表的结果）。这些实验的目的是为 ER 或晚体膜，迁移和宝物或泛素化宝物确定特定的分子标记。但在结果中，ER 驻地分子和晚体膜驻地分子迁移以及宝物和泛素化宝物，指示这些实验被成功地确定细胞 ERAD 样运输车厢和作为古典 ER 或晚体膜的处理。在这些实验中，没有具体的分子吞车厢内除了宝物或泛素化宝物。然而，虽然外源性抗原术 ERAD 样运输，这些分子渗透到脂质双层膜 ER 的通过 translocons，Sec61 复杂如 (图 1， 图 2A)。膜贴宝物被选为标记内, 吞的车厢和微粒体纯化 SA 磁珠 (图 2A、 2B)。在这些纯化的微粒，累积的宝物偶遇 ERAD 般泛素化和 RL 和 ATP体外(图 3A、 3B) 存在下的处理。因为 RL 包含所有胞浆的分子仪器，如泛素化相关的分子和蛋白酶体除了翻译和转录，分子，附加的 RL 支持泛素化的纯化微粒体中的宝物。这些结果表明，纯化微粒体客观的细胞隔间 ERAD 样运输和外源性抗原的处理，都可以包含在同一时间; 的体膜特定分子和二村居民分子Lamp1 表明前体和成熟形式纯化的微粒体中。
本议定书是取决于所用的膜穿透的外源性抗原;它是重要纳入足够的外源性抗原 DC2.4 细胞，具有高的能力，将外源抗原在半汇合状态。拉长的 6 ~ 12 小时孵化时间为 DC2.4 与宝物增加了注册的宝物。抑制蛋白酶体、 MG132 或随着，适度增加大量纯化的微粒。微粒体的制备是本议定书的最关键步骤之一。免费的宝物，不纳入 DC2.4 细胞，应该删除洗细胞用 PBS，以防止微粒分数免费宝物的非特异性结合。为了减少损害赔偿膜车厢，细胞都仔细地打乱了 Dounce 均质机在冰水中。然后用离心法作为微粒制备后核馏分去除成分完整的细胞和细胞核。微粒体的制备后, 一步纯化 SA 磁珠进行。在此步骤中，绑定的磁铁微粒体仔细清洗是必要删除非特定绑定的其他细胞的车厢，不失去专门绑定微粒体。
在这一步纯化方法中，有相当比例的目标微粒体是必需的。如果客观微粒体比太小，纯化的目标微粒减少竞争与非特定绑定的其他细胞的车厢。因此，这些条件下，富集作用目标微粒体和非特定微粒体间隙将需要。它也是可以引入提纯前由 SA 磁珠的额外步骤。这样的一个步骤是蔗糖或碘密度梯度离心法微粒体。由于准备的微粒包含所有膜产品，有可能通过努力丰富目标微粒体 SA 磁性珠提纯前的选择纯化抗原丰富分数。另一个可能的步骤是通过控制磁珠没有 SA，以减少对 SA 磁珠微粒体的非特定背景协会微粒体预检。在这些实验中，这两个步骤有效，提高目标微粒体的纯度，但减少总量的纯化产品，指示这些附加步骤选择作为进一步的实验手段。
众所周知，高速离心法已被证明导致融合或凝血的细胞内的囊泡。这些融合或 clottings 会产生人工肝微粒体，源于不同种类的细胞衍生的囊泡的非特异性相互作用。这些人工肝微粒体统计包含每个膜分子驻地分子线粒体、 高尔基驻地分子等。这些纯化的微粒体不包括 caveosome 驻地蛋白质、 高尔基驻地蛋白质或早期的体膜居民蛋白质，如 caveolin1、 GM130 和 EEA1，指示 SA 纯微粒体不人工产品来自中不同种类的囊泡融合。没有高速离心，宝物粘囊泡是孤立的但从没有宝物囊泡控制实验表明非特定分子的较高数额。这表明这种初步的方法是不足为连续实验和高速离心步骤是这个纯化方案的必要条件。
本议定书适用于其他类型的细胞，不同的直流子集或其他装甲运兵车等。它也是可以使用的各种类型的外源抗原在不同条件下，荧光蛋白，磁珠抗原，抗原抗体复合物等。此外，我们可以净化目标微粒体对外源性抗原的特异性抗体。虽然几个额外的步骤或修改可能需要适用本议定书于其他细胞和抗原，它可以通过比较不同的实验中，纯化的分子澄清蛋白酶体依赖 CP 的分子机制。因此，描述的协议有修改和改进的余地。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
这项工作被支持由高崎大学健康和福利。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
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