Summary
Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.
Abstract
Dendritische Zellen (DCs) sind leistungsfähige Verarbeitung und verinnerlichten exogene Antigene auf großen Histocompatibility-Klasse (MHC) zu präsentieren ich Moleküle auch bekannt als Kreuz-Präsentation (CP). CP spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Stimulation der naiven CD8+ T Zellen und Gedächtnis CD8+ T-Zellen für infektiöse und Tumor Immunität sondern auch bei der Inaktivierung von selbsttätige naive T-Zellen durch T-Zell-Anergie oder T-Zell-Löschung. Wenn auch der kritischen molekularen Mechanismus der CP geklärt werden noch, gibt es sammeln Hinweise darauf, dass exogene Antigene durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau (ERAD) nach dem Export aus nichtklassischen endocytic verarbeitet werden Fächer. Bis vor kurzem waren Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen beschränkt, denn es keine spezifische molekulare Marker als exogene Antigene gab. Die hier beschriebene Methode ist ein neues Protokoll Vesikel Isolierung, die für die Reinigung dieser endocytic Abteilungen ermöglicht. Mit diesem gereinigten Microsome, rekonstituiert wir ERAD-wie Transport, Ubiquitination und Verarbeitung des exogene Antigen in Vitro, was darauf hindeutet, dass das Ubiquitin-Proteasom-System die exogene Antigen nach dem Export aus dieser verarbeitet Handy-Fach. Dieses Protokoll kann weiter auf andere Zelltypen zu klären, den molekularen Mechanismus der CP angewendet werden.
Introduction
Die MHC ich Moleküle auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen, mit kurzen Antigene Peptide abgeleitet endogene Antigene, die durch das Ubiquitin-Proteasom-System in der Zellflüssigkeit1verarbeitet werden ausgedrückt werden. Nach der Bearbeitung werden Antigene Peptide in das endoplasmatische Retikulum (ER)-Lumen von Peptid-Transporter TAP transportiert. Das ER-Lumen eine Reihe von spezifischen Chaperone unterstützen das Peptid-laden und die korrekte Faltung des MHC ich komplexe. Diese Reihe von Molekülen nennt man die Peptid-laden-Komplex (PLC), darauf hinweist, dass ER ein zentrales Fach für Peptid laden auf MHC ich2. Nach Peptid laden, MHC ich Moleküle an der Zelloberfläche transportiert und spielen eine Schlüsselrolle bei der adaptiven Immunsystems als selbständige Marker und ermöglicht die CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), Krebszellen oder Krankheitserreger erkennen von Antigenen Peptide aus Nichtselbst Proteine3.
Antigenpräsentierende Zellen (APC), Antigene Peptide aus exogene Antigene sind auch auf MHC habe ich4,5,6,7,8 über CP, das hauptsächlich getragen wird vorgestellt von DCs9,10,11. CP ist wichtig sowohl für die Aktivierung von naiven CD8+ T Zellen und Gedächtnis CD8+ T-Zellen gegen Infektionen und Anti-Tumor CTLs12,13, und bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz durch die Inaktivierung der selbsttätige naive T-Zellen14,15. Der CP spielt viele wichtige Rollen in das adaptive Immunsystem jedoch die molekularen Mechanismen der CP müssen noch im Detail beschrieben werden. Frühere Studien der CP ergab, dass exogene Antigene, in der ER und das Endosom lokalisiert wurden und wurden von ERAD, was darauf hindeutet, dass exogene Antigene, die ER für ERAD-wie Verarbeitung und laden16 Peptid aus dem Endosom transportiert werden verarbeitet . Sammeln Beweise deutet jedoch darauf hin, dass das Peptid-Laden von CP durchgeführt wird, nicht in der Notaufnahme sondern im nicht-klassischen endocytic Fächer, die auch Besonderheiten der ER (Abbildung 1)17,18 ,19,20,21. Zur Vermeidung von Abbau der Antigen Peptid Vorläufer von der hohen Aktivität des Aminopeptidase tritt22 im Zytosol, Verarbeitung und Peptid im CP laden im proximalen Bereich dieser nichtklassischen endocytic Abteilungen (Abbildung 1). Obwohl die Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen umstritten sind, gibt es keine bestehende spezifische Moleküle als exogene Antigene in diesem Fach.
ERAD ist ein zellulärer Weg, der speziell fehlgefaltete Proteine aus dem ER entfernt. In dem ERAD Weg fehlgefaltete Proteine Doppelthebel durch die ER-Membran, das Zytoplasma transportiert und verarbeitet von den Ubiquitin-Proteasom System23,24,25. Beim Transport von großer Molekülen wie Proteinen, durch die Lipid-Bilayer durchlaufen diese Moleküle ein molekularer Apparat namens ein Translocon, wie der Sec61 komplex und Delrin Komplex in die ER26, und die komplexe Tom und Tim Komplex in der Mitochondrien-27. Wenn exogen hinzugefügt Antigene durch die ER-Membran transportiert werden, müssen sie die Lipid-Bilayer im Komplex mit Translocons, wie den Sec61-Komplex eindringen. Die hier beschriebene Methode gereinigt die gezielte Blase durch die Nutzung dieser Membran durchdringen Moleküle als Marker für die endocytic Fächer.
Die hier beschriebene Methode ist ein neues Vesikel-Reinigung-Protokoll mit der DC-ähnliche Zelle Zeile DC2.428 und biotinylierte Ovalbumin (bOVA) als eine exogene Antigen. Die endocytic Fächer wurden gereinigt, indem Streptavidin (SA)-magnetische Beads, die mit der Membran durchdringen bOVA als Hersteller. In diesem gereinigten Microsome hinzugefügt einige exogen bOVA blieb noch in Bruchteilen Membran aber waren an der Außenseite des Microsome und dann Ubiquitinated transportiert und verarbeitet in-vitro-29. Dieses gereinigte Microsome enthielt nicht nur endocytic Fach-spezifische Proteine, sondern auch ER ansässigen Proteine für ERAD und das Peptid Komplex laden; darauf hindeutet, dass das zelluläre Fach das prospektive endocytic Fach für CP29. Dieses Protokoll ist nicht abhängig von der Art der exogene Antigene und gilt auch für andere DC-Subsets und andere Zelltypen, z. B. Endothelzellen, Makrophagen und B-Zellen, den genaue molekularen Mechanismus der DCs für kompetente CP zu klären.
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Protocol
1. wachsenden Zellen und Ergänzung der exogene Antigene
- Prepare bOVA mit einem Biotin-Protein-Kennzeichnung kit nach dem Hersteller ' s Protokoll.
Hinweis: Normalerweise bOVA enthält 2 M Biotin pro 1 M OVA durchschnittlich. - Wachsen DC2.4 Zellen RPMI-1640 ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 55 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) und 10 % fetalen Kälberserum (im folgenden RPMI) bei 37 ° C in 5 % CO 2 in einem befeuchteten Inkubator (im folgenden ohne Erwähnung, Zellen sind inkubiert in diesem Zustand). Es ist auch möglich, verwenden Sie DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum, 3,7 g/L Nahco3 3 (im folgenden DMEM) anstelle von RPMI ergänzt.
- Einen Tag vor der Reinigung, die Zellen in RPMI bis 1 x 10 5 Zellen/mL in einer Gewebekultur Platte aufgeteilt. Vermeiden Sie die Zellen an einem konfluierende Zustand zu halten. DC2.4 Zellen können exogene Antigene hoch bis semi-konfluierende Zustand zu übernehmen, aber schnell verlieren die Fähigkeit nach einer übermäßigen Zusammenfluss Zustand zu erreichen.
- Vor der DC2.4 Zellen sind semi-konfluierende, fügen Sie 250 µg/mL bOVA für 1 x 10 6 Zellen/mL und inkubieren Sie für 2-4 h
Hinweis: Während der nachfolgenden Experimente alle Puffer und Reagenzien sind gehalten bei 4 ° C sofern nicht anders angegeben.
2. Vorbereitung der Microsomen
- die DC2.4 Zellen durch sanfte Pipettieren von der Gewebe-Platte in ein neues 50 mL konische Röhrchen ernten.
- Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min, 4 ° C und entfernen Sie vorsichtig das Medium mit bOVA durch Aspiration.
- Die DC2.4 Zellen zweimal mit 40 mL PBS-Puffer (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min, 4 ° C zu waschen und entsorgen des Überstands jedesmal durch Absaugen.
- Aufschwemmen das Pellet in Schritt 2.3 in 1-2 mL (1/20-1/10 Volumen Kulturmedium) Homogenisierung Medium (0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails und Übertragung der resuspendierte DC2.4 Zellen in einer eiskalte Dounce-Homogenisator.
- Stören die resuspendierte DC2.4 Zellen sanft von 10-20 Schläge mit dem eiskalten Dounce-Homogenisator.
Hinweis: Während der Unterbrechung Schritt Dounce-Homogenisator wird gekühlt auf Eis - Übertragen die Zelle gestört Aussetzung zu einem neuen 15 mL konische Schlauch.
- 10 mL insgesamt 8-9 mL Homogenisierung Medium hinzu und Zentrifugieren die konische Röhre für 10 min bei 2.000 x g und 4 ° c
- Übertragen den Überstand auf eine neue 15 mL konische Rohr, ungebrochene Zellen und Kerne entfernen und Zentrifugieren die konische Röhre wieder für 10 min bei 2.000 x g und 4 ° c
- Übertragen den Überstand in ein neues Ultrazentrifugation Rohr und Zentrifuge für 45 Minuten bei 100.000 x g und 4 ° c
- Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Pellet sorgfältig in 1-2 mL Homogenisierung Medium mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails durch pipettieren die Lösung nach oben und unten mehrmals in Sekundenbruchteilen Microsome für nachgeschaltete Experimente machen.
- Übertragen die Microsome Bruchteil in ein neues Röhrchen 5 mL Rundboden.
Hinweis: Nach diesem Schritt ist es möglich, Objektive Microsomen durch Iodixanol Dichte Gradienten Zentrifugation laut Hersteller bereichern ' s-Protokoll, um unspezifische Microsomen zu entfernen. Die Peak-Fraktionen für exogene Antigene werden gesammelt und dann mit dem nächsten Schritt der Reinigung (Schritt 3) unterworfen.
3. Reinigung von Microsomen mit bOVA unterziehen ERAD
- Add 1/100 Volumen von frischen SA-magnetischen Kügelchen auf den Microsome Bruchteil Schritt 2.11 in der 5 mL Runde Unterrohr.
Hinweis: Bevor Sie diesen Schritt, es ist möglich, Microsome Bruchteil von Kontrolle-magnetische Beads zu Verunreinigungen der unspezifischen Microsomen vorab klar. - Sanft vermischen und drehen die Rundboden-Röhre langsam für 30 min bei 4 ° c
- Insgesamt 4 mL in die Rundboden Röhrchen ca. 2-3 mL Homogenisierung Medium hinzufügen und vorsichtig vermengen.
- Ein Magnetstativ Rundboden Rohr aufsetzen und 10 min bei 4 ° c inkubieren Da die Perlen an die Vesikel gebunden der Magnet angezogen sind, braune Mikro-Perlen werden allmählich reichern sich an der Rohrwand am nächsten an den Magneten.
- Mit dem Rohr in der Magnetstativ verbleibenden sorgfältig verwerfen die Überstände durch Absaugen, die ungebundenen Vesikel zu entfernen.
- Waschen die magnetische Beads die Vesikel zweimal mit 5 mL Medium Homogenisierung durch die magnetische verpflichtet stehen für 10 min bei 4 ° C und entsorgen des Überstands jedesmal durch sorgfältig absaugen.
Hinweis: Ohne Magnetstativ, Reinigung von Centrifugations bei 2.000 x g für 10 min, 4 ° C ist auch verfügbar. - Aufschwemmen der magnetischen Kügelchen durch pipettieren die Lösung nach oben und unten mehrmals an die Vesikel sorgfältig in 100 µL Homogenisierung Medium gebunden.
- Übertragen die resuspendierte Vesikel in eine neue Reaktionscup als die gereinigten Microsome für nachgeschaltete Experimente.
Hinweis: In der Regel 50 µL Microsome Bruch mit 5-20 µg Proteinen aus 1 x 10 7 Zellen isoliert werden kann.
4. Analyse der gereinigt Microsomen
- Aufschwemmen der magnetischen Perlen verpflichtet die Vesikel aus Schritt 3,8 für 100-200 µL Puffer TNE (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 % Nonidet p-40) mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails anstelle der Homogenisierung Medium.
- Übertragen die lysate aus Schritt 4.1 auf eine neue 1,5-mL-Reaktionscup.
- Bestimmen die Proteinkonzentration Schritt 4.2 mithilfe einer BCA Assay Kit pro Hersteller ' s Protokoll.
Hinweis: In der Regel 5-10 µL lysate aus Schritt 4.2 genügt, um festzustellen, die Proteinkonzentration. - Übertragen die lysate aus Schritt 4.2 (2 µg Protein für silberne Färbung und 10 µg Protein für das westliche Beflecken) in neue Mikroröhrchen.
- Setzen die Mikroröhrchen auf einem Heizblock bei 95 ° C und Kochen Proteine in 1 x SDS-Gel-laden-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 200 mM Dithiothreitol, 4 % SDS, 0,2 % Bromophenol Blue, 20 % Glycerin) für 5 min.
- Zentrifugieren Mikroröhrchen für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. sammeln die Überstände in neue Mikroröhrchen die unlöslichen Anteile entfernen.
- Die aufgelöste Proteine in Schritt 4.6 (2 µg) von standard SD-Seite zu analysieren.
- Visualisieren die Protein-Bands durch die silberne Färbung mit silbernen Färbung nach dem Hersteller Kit ' s Protokoll.
- Analysieren die aufgelöste Proteine in Schritt 4.6 (10 µg) von standard SD-PAGE und Western-Blot. Verwenden Sie das Reagenz (SA-HRP) pro Hersteller ' s-Protokoll und visualisieren von Fluorography.
5. In-vitro- Rekonstitution des ERAD Ubiquitination von bOVA Verwendung gereinigt Microsomen
- Übertragung der gereinigten Microsomen (5-10 µg Protein) von 3,8 Schritt mit einem Volumen von 50 % der Retikulozytenzahl lysate (RL), 1 x Reaktion Puffer (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl (2), und 12:02-Flag gekennzeichnet Ubiquitin in eine neue Reaktionscup. Der letzte Band dieses Experiments ist 20-40 µL.
- Inkubation die Reaktionscup für 2 h bei 37 ° c
Hinweis: Wenn die Menge an Ubiquitinated bOVA in Schritt 5.12 zu klein, durch westliche Beflecken zu erkennen ist, fügen Sie 10 µM MG132 oder 2 µM Lactacystin, die Verarbeitung von Ubiquitinated bOVA durch Proteasomen hemmen. - Stoppen Sie die Reaktion indem man die Reaktionscup auf Eis.
- Lösen die Microsomen durch Zugabe von 500 µL TNE Puffer mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails.
- Die Reaktionscup Zentrifuge für 10 min bei 21,500 x g und 4 ° C. sammeln die Überstände in eine neue Reaktionscup die unlöslichen Brüche zu entfernen, die Ubiquitinated bOVA in DC2.4 vor der in-vitro- Ubiquitination Assay enthalten.
- Den Überstand auf eine neue Reaktionscup übertragen und Volumen 1/100 der neuen SA-magnetische Beads (in der Regel 5 µL für 500 µL Überstände).
- Sanft vermischen und drehen die Reaktionscup langsam für 30 min bei 4 ° c
- Zentrifugieren Sie die Reaktionscup für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. verwerfen der Überstand durch Absaugen, bOVA und Ubiquitinated bOVA wiederherzustellen mit der SA-magnetische Beads gebunden.
- Waschen zweimal die gesammelten SA-magnetische Beads mit 1 mL TNE Puffer durch Zentrifugation für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. verwerfen des Überstands jedesmal durch Aspiration.
- Kochen der SA-magnetischen Kügelchen in 1 x SDS-Gel Ladepuffer für 5 min bei 95 ° C auf einem Hitze-Block, der gereinigten Proteine durch die SA-magnetische Beads zu lösen.
- Zentrifugieren Sie die Reaktionscup für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° c in eine neue Reaktionscup, die unlöslichen Anteile zu entfernen die Überstände sammeln.
- Analysieren die SA-magnetische Beads durch standard SD-Seite und Western-Blot-an die Proteine gebunden. Der Einsatz von Antikörpern (Anti-Flag, Anti-Multi-Ub und Anti-Maus IgG-HRP) und das Reagenz (SA-HRP) ist pro Hersteller ' s-Protokoll und visualisiert durch Fluorography.
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Representative Results
Um den molekularen Mechanismus der CP zu erhellen, ist es notwendig, die zellulare Fächer zu identifizieren, wo exogene Antigene ERAD-wie Transport und Verarbeitung unterzogen werden. Während Beobachtungen durch immunofluorescent Mikroskopie oder durch Elektronenmikroskopie der zelluläre Fach wo exogene Antigene16,17,18,19angesammelt identifiziert, 30,31,32,33, die zellularen Fächern für ERAD-ähnliche Verarbeitung exogene Antigene sind nicht klar definiert. Vor kurzem zeigte sich, dass nichtklassischen Endosomen mit ER resident Moleküle verantwortlich für CP34 waren, aber diese zellulären Kompartimenten ungereinigten. Die Schwierigkeit bei der Isolierung und Reinigung der zellularen Fächern lässt sich zurückführen auf die Tatsache, dass exogene Antigene im Endosom und ER-wie Fächer lokalisiert sind und dass es keine identifizierenden Molekül für diese endocytic Fächer andere als exogene Antigene. Jedoch unterscheidet sich der Zustand der exogenen Antigenen unterziehen ERAD-wie Transport von Steady-State; beim Transport über bimolekulare Lipidmembran exogene Antigene durchdringen die Membran über Translocons, wie Sec61 (Abbildung 2A). Daher sollte bei Verwendung von bOVA als exogene Antigen bOVA Sec61 zugeordnet werden. Da membranassoziierten bOVA speziell mit SA gebunden, konnte die Microsome aus DC2.4, die mit bOVA vorbehandelt wurde, vorbereitet unterscheidend von SA-magnetische Beads (Abbildung 2A) isoliert werden. Dann wurden die Äquivalenzbeträge von Proteinen aus gereinigtem Microsomen mit oder ohne Vorinkubation von bOVA durch SDS-PAGE, gefolgt von Silber Färbung und westliche Beflecken mit SA-HRP (Abb. 2 b, 2 C) gelöst. Wie in Abbildung 2 b und Abbildung 2gezeigt, enthalten die isolierten Microsomen mehrere einzigartige Proteine, die abhängig von EXOGEN hinzugefügt bOVA und SA-magnetische Beads gereinigt wurden. Neben dieser einzigartigen Proteine enthielt isolierende Microsomen auch unspezifische Proteine, die an SA-magnetische Beads mit oder ohne bOVA gebunden. Behandlung von Microsome mit Trypsin vor Reinigung durch den Magneten der Reinigung des Microsomen (Abb. 2D), darauf hinweist, dass die Reinigungsverfahren verhindert hing auf das Vorhandensein von bOVA Membran eindringen.
Die gereinigten Microsomen zeigte der Fähigkeit, Ubiquitinate das eingearbeitete bOVA in Vitro, unter Anwesenheit von RLs (Abb. 3A). Die Mengen an bOVA und Poly-Ubiquitinated bOVA wurden in Anwesenheit von MG132 ergänzt (Abb. 3 b), darauf hinweist, dass die eingebaute bOVA ERAD verarbeitet wurde und unsere gereinigten Microsomen ERAD Maschinen Proteine enthalten.
Abbildung 1: intrazelluläre Signalwege für CP in DCs. DCs werden exogene Antigene in nicht-klassischen endocytic Fächer, transportiert ER ansässige Moleküle zusätzlich zu Molekülen von der klassischen späten Endosom enthalten. In diesem Fach werden exogene Antigene in Zytosol durch Translocons wie Sec61 exportiert. Im Zytosol sind exogene Antigene durch das Ubiquitin-Proteasom-System zu Antigene Peptide als ERAD Substrate verarbeitet. Antigene Peptide werden in gleichen oder benachbarten nicht-klassischen endocytic Fächer oder angrenzenden ER durch Tippen Transporter transportiert und dann lud ich auf MHC Moleküle durch PLC. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Reinigung von Microsomen mit bOVA unterziehen ERAD. (A) A schematische Modell der Reinigung der Microsomen mit bOVA ERAD unterziehen. bOVA ist verbunden mit der Membran durch Sec61 Translocon und gezielt mit SA-magnetische Beads. (B) Microsomen mit (+) oder ohne (-) vorheriger Zugabe von bOVA gereinigt wurden, mit (+) oder ohne (-) SA-magnetische Beads. Proteine (2 µg) oder entsprechende Mengen der gereinigten Proteine auf 7,5-15 % SDS-PAGE gelöst wurden, und silberne Färbung wurde verwendet, um Protein-Bands zu visualisieren. Dreiecke auf der rechten Seite zeigen unspezifische Proteine binden an die SA-magnetische Beads. Dreiecke mit Sternchen zeigen eindeutige Proteine nur in Anwesenheit von EXOGEN hinzugefügt bOVA und SA-magnetische Beads. Der Pfeil zeigt bOVA. (C) Microsomen mit (+) oder ohne (-) vorheriger Zugabe von bOVA gereinigt wurden, mit (+) oder ohne (-) SA-magnetische Beads. Proteine (10 µg) oder entsprechende Mengen der gereinigten Proteine wurden gelöst auf 7,5-15 % SDS-PAGE und Western Blot mit SA-HRP ausgesetzt. P.n.: postnukleare Bruchteil. Sternchen in der rechten Ecke geben unspezifische Bänder mit SA-HRP. Gleichwertige Ergebnisse wurden von mindestens drei unabhängigen Tests erreicht. (D) Microsomen mit vorheriger Zugabe von bOVA wurden mit SA-magnetische Beads gereinigt. Microsomen behandelt wurden, mit (+) oder ohne (-) Trypsin und TX-100 vor der Reinigung (links zweispurig) oder nach der Reinigung (rechts zweispurig). Proteine (2 µg) oder entsprechende Mengen der gereinigten Proteine auf 7,5-15 % SDS-PAGE gelöst wurden, und silberne Färbung wurde verwendet, um Protein-Bands zu visualisieren. Dreiecke auf der rechten Seite zeigen unspezifische Proteine binden an die SA-magnetische Beads. Dreiecke mit Sternchen zeigen eindeutige Proteine nur in Anwesenheit von EXOGEN hinzugefügt bOVA und SA-magnetische Beads. Gleichwertige Ergebnisse wurden von mindestens drei unabhängigen Tests erreicht. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-28. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: In-vitro- Rekonstitution von Verarbeitung und Ubiquitination mit Eizellen in Microsomen gereinigt. (A) Purified Microsomen mit (+) oder ohne (-) vorheriger Zugabe von bOVA behandelt wurden, mit (+) oder ohne (-) RL und Flag-Ub für 1 h und wurden mit TNE solubilisiert. bOVA wurde gereinigt mit SA-magnetische Beads und Western Blot mit der angegebenen Antikörper unterzogen. Sternchen in der rechten Ecke geben unspezifische Bänder mit SA-HRP. Gleichwertige Ergebnisse wurden von mindestens drei unabhängigen Tests erreicht. (B) Purified Microsomen behandelt wurden, mit (+) oder ohne (-) RL, Flag-Ub und MG132 für 1 h und wurden dann mit TNE solubilisiert. bOVA wurde gereinigt mit SA-magnetische Beads und westliche Beflecken mit SA-Flag unterzogen. Sternchen in der rechten Ecke geben unspezifische Bänder mit SA-HRP. Gleichwertige Ergebnisse wurden von mindestens drei unabhängigen Tests erreicht. Nachdruck mit permission von Referenz-28. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In früheren Studien von CP eingearbeitete exogene Antigene in den geschützten Bereich des späten Endosom oder ER durch immunofluorescent Mikroskopie16,30,31,32angesammelt. Es wird geschätzt, dass ERAD-wie Transport und Verarbeitung von exogenen Antigenen in diesen spezialisierten Bereichen ER oder späten Endosom durchgeführt werden, wie das zelluläre Fach von Saccharose oder Iodixanol Dichte Gradienten Zentrifugation mit identifiziert wurde Ubiquitinated bOVA als ein ERAD-ähnliche Verarbeitung Marker. Nach Stimulierung ihrer angeborene Immunität, CP Effizienz erheblich gesteigert und der Spitze Anteil für bOVA zusammen mit Ubiquitinated bOVA migriert auf einen höheren Dichte Bruchteil (unsere unveröffentlichte Ergebnisse). Das Ziel dieser Versuche war, spezifische molekulare Marker zu identifizieren, für die ER oder späten Endosom, die zusammen mit bOVA oder Ubiquitinated bOVA migriert. Aber in den Ergebnissen ER resident Moleküle und späten Endosom-Resident-Moleküle zusammen mit dem bOVA und Ubiquitinated bOVA, darauf hinweist, dass diese Versuche erfolglos bei der Ermittlung der zellulären Fach für ERAD-wie Transport waren migriert und Verarbeitung als die klassischen ER oder späten Endosom. In diesen Experimenten gab es keine spezifische Moleküle in den endocytotic Fächern außer bOVA oder Ubiquitinated bOVA. Jedoch während die exogene Antigen ERAD-wie Transport unterzog, drangen diese Moleküle Lipid Bilayer Membran des ER durch Translocons, wie Sec61 Komplex (Abbildung 1, Abbildung 2A). Die Membran kleben bOVA wurde als ein Marker für die endocytic Fächer ausgewählt, und die Microsomen wurden durch SA-magnetische Beads (Abb. 2A, 2 b) gereinigt. Kumulierte bOVA stieß diese gereinigten Microsomen ERAD-wie Ubiquitination und Verarbeitung unter Anwesenheit des RL und ATP in Vitro (Abb. 3A, 3 b). Da RL alle cytosolischen molekulare Wissenschaftsliteratur, z. B. im Zusammenhang mit der Ubiquitination Moleküle und Proteasomen zusätzlich zu Molekülen für die Übersetzung und Transkription enthält, ermöglicht die Zugabe von RL Ubiquitination bOVA in gereinigtem Microsome. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass gereinigte Microsomen der objektiven zellulare Fächer waren für ERAD-wie Transport und Verarbeitung von exogenen Antigenen, beide Endosom-spezifische Moleküle, und enthält ER ansässige Moleküle gleichzeitig; Lamp1 zeigte die gereinigten Microsome Vorläufer und ausgereifte Formen.
Dieses Protokoll ist abhängig von der Membran durchdringen exogene Antigene; Es ist wichtig, genug der exogene Antigene zu DC2.4 Zellen, die zeigt eine hohe Fähigkeit, exogene Antigene in den semi-konfluierende Staat zu integrieren zu integrieren. Verlängern die Inkubationszeit 6-12 h für DC2.4 mit bOVA erhöht die Menge der eingebauten bOVA. Die Zugabe von Inhibitoren für Proteasomen, MG132 oder Lactacystin, erhöht mäßig die Beträge der gereinigten Microsomen. Die Vorbereitung der Microsome ist einer der wichtigsten Schritte für dieses Protokoll. Die kostenlose bOVA, die nicht in DC2.4 Zellen aufgenommen wird, sollte entfernt werden, durch das Waschen der Zellen mit PBS, um unspezifische Bindung des freien bOVA Microsome Bruch zu verhindern. Um Schäden, die auf Membran Fächer zu reduzieren, sind Zellen vorsichtig durch die Dounce-Homogenisator in Eiswasser gestört. Dann wurden ungebrochen Zellen und Kerne durch Zentrifugieren entfernt, da die Microsomen der postnuklearen Fraktion bereit waren. Nach der Zubereitung von den Microsomen One-Step Reinigung durch SA-magnetische Beads erfolgt. In diesem Arbeitsschritt ist sorgfältiges Waschen der Magnet gebunden Microsome notwendig, die unspezifische Bindung von anderen zellulären Kompartimenten entfernen und nicht spezifisch gebundenen Microsome verlieren.
In diesem einen Schritt Reinigungsverfahren ist ein erheblicher Prozentsatz der Ziel-Microsome erforderlich. Wenn das Verhältnis der objektiven Microsome zu klein ist, verringert die Menge des gereinigten Ziel Microsome durch Konkurrenz mit unspezifischen Bindung von anderen zellularen Fächern. Infolgedessen unter diesen Bedingungen wäre die Bereicherungen der Ziel-Microsome und die Clearance von unspezifischen Microsome erforderlich. Es ist auch möglich, zusätzliche Schritte vor der Reinigung durch die SA-magnetische Beads einzuführen. Ein solcher Schritt ist die Saccharose oder Iodixanol Dichte Gradienten Zentrifugation von der Microsome. Da die vorbereiteten Microsomen alle Membranprodukte enthalten, könnte das Ziel Microsome vor SA-magnetische Beads Reinigung bereichern durch die Auswahl der Antigen reiche Fraktionen zur Reinigung möglich. Ein weiterer möglicher Schritt ist die Pre-Clearance von Microsome durch Kontrolle-magnetische Beads ohne SA, um die unspezifischen Hintergrund Verbände der Microsomen gegen SA-magnetische Beads zu reduzieren. In diesen Experimenten beide Schritte verbessert die Reinheit des Ziel-Microsome effektiv, aber vermindert den Gesamtbetrag der gereinigten Produkte, darauf hinweist, dass diese zusätzlichen Schritte als Mittel zur weiteren Experimenten ausgewählt sind.
Es ist bekannt, dass diese High-Speed-Zentrifugation gezeigt worden, um die Fusion oder von intrazellulären Vesikeln Blutgerinnung führen. Diese Fusionen oder Clottings wird künstliche Microsomen produzieren die unspezifische Interaktion zwischen verschiedenen Arten von Vesikeln Organelle abgeleitet abgeleitet werden. Diese künstliche Microsomen enthalten statistisch jedes Molekül Membran wie mitochondriale resident Molekül, Golgi-Apparat resident Molekül, etc.. Diese gereinigten Microsomen enthalten der Caveosom ansässigen Proteine, Golgi-Apparat ansässigen Proteine oder frühen Endosom ansässigen Proteine, wie caveolin1, GM130 und EEA1, darauf hinweist, dass die SA-gereinigte Microsomen nicht künstliche Produkte sind nicht abgeleitet aus der Fusion zwischen verschiedenen Arten von Vesikeln. Ohne die High-Speed-Zentrifugation bOVA kleben Vesikel wurden isoliert, aber die Experimente von Vesikeln ohne bOVA zeigte höhere Mengen an nicht-spezifische Moleküle. Dies bedeutet, dass diese vorläufige Methode für aufeinander folgende Experimente nicht ausreicht und die High-Speed-Zentrifugationsschritt für dieses Protokoll Reinigung notwendig ist.
Dieses Protokoll gilt für andere Zelltypen, wie verschiedene DC Teilmengen oder andere APCs. Es ist auch möglich, die verschiedenen Arten von exogenen Antigenen unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. fluoreszierende Proteine, Antigen-Antikörper-Komplex, Perlen gebunden Antigenezu verwenden. Darüber hinaus können wir Ziel Microsomen mit spezifischen Antikörpern gegen exogene Antigene reinigen. Obwohl mehrere zusätzliche Schritte oder Änderungen erforderlich werden könnten, dieses Protokoll auf andere Zellen und Antigene anzuwenden, kann es die molekularen Mechanismen des Proteasom-abhängige CP aufzuklären, indem Sie die gereinigten Moleküle unter verschiedenen Experimenten vergleichen. So hat das beschriebene Protokoll Raum für Veränderung und Verbesserung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der Takasaki Hochschule für Gesundheit und Soziales unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
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