Summary
ここで説明する方法は、外因性の抗原クロス プレゼンテーションで小胞体関連分解によって処理される細胞コンパートメントの浄化は、新しい小胞の分離プロトコルです。
Abstract
樹状細胞 (Dc) は、主要組織適合抗原 (MHC) クラスに内面化された外因性抗原の提示や画像処理能力が高く、私分子として知られているクロス プレゼンテーション (CP)。CP は+ T ナイーブ CD8 の刺激だけでなく、重要な役割を果たしている細胞とメモリー CD8+ T 細胞の感染と動圧の不活性化にも腫瘍免疫ナイーブ T 細胞、T 細胞アネルギーや T 細胞削除。CP の重要な分子機構になって、蓄積された証拠を示すことが外因性の抗原は小胞体関連分解 (ERAD) 非古典からエクスポート後エンドサイトーシスを介して処理されます。コンパートメント。最近まで、外因性の抗原以外の特定の分子マーカーがなかったので、これらのエンドサイトーシスのコンパートメントの特徴は限られていた。ここで説明する方法は、これらのエンドサイトーシスのコンパートメントの浄化では、新しい小胞の分離プロトコルです。この精製微粒体を使用して、我々 再構成 ERAD のようなトランスポート、ユビキチン化、および外因性抗原の体外、処理ユビキチン-プロテアソーム システムがこれからの輸出後外因性抗原を処理することを示唆しています。細胞内コンパートメント。このプロトコルは、CP の分子機構を明らかにする他の細胞型にさらに適用できます。
Introduction
MHC 私分子すべての有核細胞の表面に細胞質1ユビキチン-プロテアソーム システムによって処理される内因性抗原由来抗原ペプチドを発現しています。処理後、抗原ペプチドは、ペプチド輸送体タップで小胞体 (ER) の内腔に運ばれます。小胞体内腔に特定シャペロンのシリーズは、ペプチドの読み込みと、フォールディング MHC I の複合体を支援します。分子のこのシリーズは、小胞体、ペプチドを MHC に私2の読み込みのため中央のコンパートメントであることを示すペプチド負荷複合体 (PLC) と呼ばれます。読み込み、ペプチッド MHC 後私分子細胞表面に運ばれ、キーとして役割を果たす適応免疫系の自己のマーカー、および CD8 を有効に+細胞傷害性 T リンパ球 (Ctl) がん細胞や感染性病原体を検出する抗原によって3非自己蛋白質由来ペプチド。
抗原提示細胞 (APC)、外因性の抗原の抗原性ペプチドもいる4,5,6,7,8 経由でCP、主に運ばれる私 MHC に提示で Dc9,10,11。CP が不可欠であるナイーブ CD8+ T の活性化のための両方セルとメモリ CD8 の不活化による+ T 細胞の免疫寛容の維持、抗感染症、抗腫瘍 Ctl12,13に自己演技ナイーブ T 細胞14,15。CP は、CP の分子メカニズムがまだ詳細に記載する適応免疫系の多くの重要な役割を果たしています。外因性の抗原が小胞体と、エンドソームの両方にローカライズされ、外因性の抗原がエンドソームから ERAD のような処理とペプチド16 の読み込みの小胞体に輸送されることを示唆している、ERAD で処理された CP の以前の研究で明らかに.しかし、蓄積された証拠は、小胞体ではなく、ER (図 1)17,18 の特徴がまたある非古典的エンドサイトーシス コンパートメントではなく CP のペプチド読み込みの実施を示します ,,1920,21。アミノペプチダーゼの高活性で抗原ペプチド前駆体の劣化を避けるためにこれらの非古典的エンドサイトーシス コンパートメント (図 1) の近位領域に細胞質、処理およびペプチドの CP で読み込みで22が発生します。これらのエンドサイトーシスのコンパートメントのキャラクタリゼーションが物議を醸すが、この区画で外因性の抗原以外の既存の特定の分子があります。
ERAD です具体的には小胞体からタンパク質を除去する細胞経路です。ERAD 経路の誤って折りたたまれたタンパク質は細胞質に小胞体膜を経由、ユビキチン-プロテアソーム システム23,24,25によって処理される逆行性。これらの分子が通過 Sec61 複合体とデルリン26ER と複雑なトムの複雑なティムなど、透過装置を複合体と呼ばれる分子装置、タンパク質などの大きな分子は脂質二重膜を輸送の際、ミトコンドリア27。外追加抗原は、小胞体膜を通じて転送されます、彼らは Sec61 複合体などの translocons との複合体の脂質二重膜を貫通する必要があります。ここで説明する方法は、エンドサイトーシスのコンパートメントのためのマーカーとしてこれらの膜貫通分子を利用してターゲットを絞った小胞を精製しました。
ここで説明する方法は、外因性抗原として DC のような細胞ライン DC2.428とビオチン化アルブミン (bOVA) を使用して新しい小胞浄化プロトコルです。エンドサイトーシスのコンパートメントにより精製されたストレプトアビジン (SA)-磁気ビーズ メーカーとして膜貫通ボーヴァを使用します。この精製のミクロゾームで外因 bOVA 膜画分でまだ維持されたが、ミクロソームとし、ユビキチンの外側に運搬・処理を追加いくつかの in vitro29。この精製ミクロゾーム ERAD とペプチド複合体での読み込みのエンドサイトーシスのコンパートメントに固有のタンパク質だけでなく、小胞体のタンパク質に含まれるCP29将来エンドサイトーシス コンパートメントを細胞内コンパートメントには示唆しています。このプロトコルは、外因性の抗原の種類に依存しない、また他 DC サブセットおよび他の細胞型、マクロファージ、B 細胞、内皮細胞など熟練した CP の Dc の正確な分子機構を明らかにするために適当。
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Protocol
1 細胞の成長および外因性抗原添加
ビオチンはタンパク質ラベリングを使用して- 準備 bOVA キット次の製造元 ' s プロトコル。
。 注: 通常、bOVA 含まれています 1 M OVA あたり 2 M ビオチン平均します 。
- 55 mM 2-メルカプトエタノール、10 mM HEPES (pH 7.5) と 5 の 37 ° C で 10% ウシ胎仔血清 (以下 RPMI) 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 0.1 mM 必須でないアミノ酸 2 mM L グルタミン 1 mM ピルビン酸ナトリウム添加 RPMI 1640 年に成長 DC2.4 細胞加湿のインキュベーターで % CO 2 (以下、言及せず細胞に孵化するこの条件で)。10% 牛胎児血清、3.7 g/L NaHCO 3 (以下 DMEM) RPMI 代わりに DMEM を使用する可能です 。
- A 浄化、前日 RPMI 1 × 10 5 セル/ml 培養プレートに、セルを分割しました。コンフルエントの状態で細胞を保つことは避けてください。DC2.4 細胞ことができます高半コンフルエントの状態まで外因性の抗原を組み込むが急速に過剰合流状態に到達した後の能力を失う 。
- 前に、DC2.4 細胞は半合流、1 x 10 6 セル/mL の bOVA の 250 μ g/mL を追加し、2-4 h. インキュベート
注意: 下流の実験の間にすべてのバッファーと試薬が保管 4 ° C で特に明記しない限り 。
2。ミクロソームの準備
- 新しい 50 mL の円錐管に組織プレートから穏やかなピペッティングによる DC2.4 細胞を収穫します 。
- 1,000 x g で 4 ° C、5 分間遠心吸引により bOVA の中を慎重に取り外します.
- 40 mL の PBS バッファー (1.37 mM NaCl、8.1 mM Na 2 HPO 4、2.68 ミリメートル KCl、1.47 mM KH 2 PO 4) 5 分、4 ° C の 1,000 × g で遠心分離によって、2 回 DC2.4 細胞を洗浄し、吸引するたびに上澄みを廃棄します 。 手順 2.3 で 1-2 でペレットを再懸濁します
- mL (1/20-1/10 培地量) プロテアーゼ阻害剤のカクテルと転送再懸濁 DC2.4 の 1/1,000 ボリュームと均質化媒体 (0.25 M ショ糖, 1 mM EDTA、10 mM HEPES NaOH [Ph7.4]) の細胞に、冷たい Dounce ホモジナイザー 。
- 中断再懸濁 DC2.4 細胞優しく冷たい Dounce ホモジナイザーと 10-20 ストロークで
。 注: 停止手順の間に氷で冷却は Dounce ホモジナイザー - セル中断の懸濁液を新しい 15 mL の円錐管に転送します 。
- 10 mL 合計に 8-9 mL 均質媒体を追加し、2,000 g x と 4 で 10 分の円錐形の管を遠心分離機 ° C
- 上清を新しい 15 mL の円錐管を切れ目のない細胞や核を削除するに転送し、g x 2,000 と 4 で 10 分間のために再度円錐管を遠心分離機 ° C
- 新しい遠心チューブに 100,000 g x と 4 の 45 分の遠心上清を転送 ° C
- 、上清を吸引し、ピペッティングを上下に数回下流実験用微粒体の一部分をするソリューションによってプロテアーゼ阻害剤カクテルの 1/1,000 ボリュームと均質媒体の 1-2 mL で慎重にペレットを再懸濁します 。
- は、新しい 5 mL 丸底チューブに微粒体の一部分を移す
。 注: この手順の後ことはメーカーによれば iodixanol 密度勾配遠心による客観的ミクロソームを豊かに ' s プロトコル、非特異的ミクロソームを削除します。外因性の抗原のピーク画分を収集し、浄化 (ステップ 3) の次のステップを受ける 。
3。ボーヴァとミクロソームの浄化を受けて ERAD
ステップ 2.11 5 mL 中の微粒体の一部分に- 追加 1/100 新鮮な量 SA 磁気ビーズ ラウンド底部チューブ
。 注: この手順の前にそれは事前非特異的ミクロソームの汚染を減らすために制御磁気ビーズによる微粒体の一部分を消去することです 。
- 優しく混ぜるし、4 で 30 分間ゆっくりと丸底チューブを回転させて ° C
- 丸底チューブに 4 mL 合計に均質媒体の 2-3 mL を追加し、そっと混ぜる 。
- マグネット スタンドの丸底チューブを置き、4 ° C で 10 分間インキュベート小胞にバインドされているビーズは磁石に引き付けられる、ので茶色のマイクロ ビーズが磁石に最も近い管壁に徐々 に蓄積されます 。
- チューブとマグネット スタンドに残って慎重に培養上清によって破棄非連結の小胞を削除する吸引 。
- 磁気によって均質媒体の 5 mL で 2 回小胞にバインドされた磁気ビーズ洗浄 4 ° C で 10 分間立って、慎重に吸引のたびに滅菌蒸留水します
。 注: 磁気スタンド、10 分間 2,000 × g で遠心により精製なし 4 ° C もあり 。
- 100 μ L の均質化の中で慎重に小胞を上下に数回ソリューションをピペッティングによってバインドされる磁気ビーズを再懸濁します 。
- は、下流の実験用精製微粒体として新しいチューブに再懸濁の小胞を転送します
。 注: 通常、1 x 10 の 7 セルから 5-20 μ g 蛋白質を含んでいる 50 μ L ミクロゾーム画分に分離できます 。
4。精製ミクロソームの解析
- 磁気再懸濁します
- ビーズから小胞にステップ 3.8 TNE バッファーの 100-200 μ L (20 mM トリス塩酸 pH 7.4 では、150 mM の NaCl、0.5 M の EDTA、1% ノニデット P-40) プロテアーゼ阻害剤カクテルの 1/1,000 ボリュームと均質媒体の代わりにします 。
- ライセート手順 4.1 から新しい 1.5 mL のマイクロ チューブに転送します 。
- は、メーカーごとの BCA アッセイ キットを使用してステップ 4.2 のタンパク質濃度を測定 ' s プロトコル
。 注: 通常、5-10 μ L ステップ 4.2 から溶解液は、タンパク質の濃度を測定するのに十分です 。
- ステップ 4.2 (銀製の汚損のための蛋白質の 2 μ g と西部にしみが付くことのための蛋白質の 10 μ g) から新しいチューブにライセートを転送します 。
- X SDS ゲル読み込みバッファー 1 で 95 ° C そして沸騰のタンパク質で熱ブロック、チューブを入れて (100 mM トリス塩酸 pH 6.8, 200 mM 4 %sds ジチオトレイトール 0.2% ブロモフェノールの青、20% グリセロール) 5 分
- G x 21,500 と 4 で 10 分間のチューブを遠心分離機 ° C は、不溶性画分を削除する新しいマイクロ チューブに培養上清を収集します 。
- 4.6 (2 μ g) 標準的な SD ページの手順で解決の蛋白質を分析します 。
- 可視化銀の銀染色などによる汚損でタンパク質のバンドが次のメーカー キット ' s プロトコル 。
- は、標準的な SD のページおよび西部のしみが付くことによって 4.6 (10 μ g) の手順で解決の蛋白質を分析します。メーカーごとに試薬 (SA-HRP) を使用 ' s プロトコルし、透視によって視覚化 。
5。体外ボーヴァを使用して精製したミクロソームの ERAD ユビキチン化の再構成
- 転送、精製ミクロゾーム (5-10 μ g のタンパク質) ステップ 3.8 網状赤血球ライセート (RL) の 50% のボリュームの反応バッファー (50 mM トリス pH 7.4 では、ATP、3 mM 0.5 mM MgCl x 12) と新しいチューブ 12:02 フラグ タグ ユビキチン。この実験の最終巻は 20-40 μ L.
- 加温 37 で 2 時間チューブ ° C
注: ウェスタンブロッテイングにより検出する手順 5.12 でユビキチン bOVA の量が小さすぎる場合は MG132 の 10 μ M またはプロテアソーム、ユビキチン bOVA の処理を抑制するラクタシスチンの 2 μ M 追加します 。
- 氷にチューブを配置することによって反応を停止
- プロテアーゼ阻害剤カクテルの 1/1,000 ボリュームを 500 μ L の TNE バッファーを追加して、ミクロソームを解決します 。
- 21,50 で 10 分間遠心したマイクロ チューブg と 4 x 0 ° C は 体外 ユビキチン化アッセイ前に、DC2.4 でユビキチン ボーヴァを含む不溶性画分を削除する新しいチューブに培養上清を収集します 。
- 上清を新しいチューブに転送し、新しい SA 磁気ビーズ (通常 500 μ L の培養上清を 5 μ L) の 1/100 ボリュームを追加します 。
- 優しく混ぜるし、4 で 30 分間ゆっくりとチューブを回転 ° C
- 21,500 g x と 4 で 10 分間のチューブを遠心分離機 ° c. 破棄ボーヴァとユビキチン ボーヴァを回復する吸引による SA 磁気ビーズのバインドします 。
- 21,500 g x と 4 で 10 分間遠心分離によって収集 SA-磁性体ビーズ TNE バッファーの 1 mL を 2 回を洗う ° c. 破棄清吸引するたびにします 。
- SA 磁気ビーズによって浄化された蛋白質を解決する熱ブロック 95 ° C で 5 分間 SDS ゲル x 1 の SA 磁気ビーズを沸騰します 。
- G x 21,500 と 4 で 10 分間のチューブを遠心分離機 ° C は、不溶性画分を削除する新しいチューブに培養上清を収集します 。
- は、標準的な SD のページおよび西部のしみが付くことによって、タンパク質に結合 SA 磁気ビーズを分析します。抗体 (抗フラグ、アンチ-マルチ-Ub と抗マウス IgG HRP) および試薬 (SA-HRP) の使用は、メーカーごと、' s プロトコル透視により可視化されたと 。
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Representative Results
CP の分子機構を解明するには、外因性の抗原が ERAD のようなトランスポートと処理を受ける細胞のコンパートメントを識別するために必要です。蛍光顕微鏡や電子顕微鏡による観察は、外因性の抗原は累積1918,16,17、、、細胞内コンパートメントを識別中 30,31,32,33ERAD のような処理のための外因性の抗原の細胞コンパートメントが明確に定義されていません。最近 ER レジデント分子と非古典的エンドソーム CP34に責任があったが、これらの細胞コンパートメントいた精製が示されました。分離し、細胞コンパートメントを浄化の難しさは、エンドソーム小胞体のようなコンパートメントの両方に、外因性の抗原がローカライズされているとがないことこれらのエンドサイトーシスの区画の識別分子他の事実に帰することができます。外因性の抗原。しかし、ERAD のようなトランスポートを受けている外因性の抗原の状態は定常状態とは異なる脂質二分子膜輸送、外因性の抗原 translocons Sec61 などを介して膜に浸透 (図 2 a)。したがって、外因性抗原としてボーヴァを使用する場合 bOVA は Sec61 に関連付けられてする必要があります。BOVA の膜準特に SA とバインドされているので DC2.4 bOVA の前処理は、これから調製した微粒体は SA 磁気ビーズ (図 2 a) によって独特分離された可能性があります。精製ミクロソーム bOVA の前培養の有無からタンパク質の量が同じは SDS-PAGE 続いて銀染色と SA HRP (図 2 b, 2 C) を用いてウェスタンブロッティングによって解決されました。図 2 b 図 2のように、分離されたミクロソームに外因追加ボーヴァと SA 磁気ビーズに依存して精製したいくつかのユニークなタンパク質が含まれています。これらのユニークな蛋白質に加えて分離されたミクロソームは SA 磁気ビーズ bOVA の有無にバインドされている非特異的タンパク質も含まれています。トリプシン磁石による浄化防いだことを示すミクロソーム (図 2 D) の浄化浄化方法前に微粒体の治療は膜貫通 bOVA の存在に依存していた。
精製ミクロソーム法人 bOVA、体外RLs (図 3 a) の存在下で ubiquitinate する能力を示した。ボーヴァとポリ ユビキチン bOVA の量 MG132 の存在下で拡張された (図 3 b) 法人ボーヴァが ERAD システムによって処理されたことと私たちの浄化されたミクロソームに ERAD 機械タンパク質が含まれていることを示します。
図 1: Dc の CP の細胞内経路。DCs では、外因性の抗原は古典後期エンドソームの分子だけでなく小胞体分子を含んだ非古典的エンドサイトーシス コンパートメントに運ばれます。この区画は、外因性の抗原が Sec61 など translocons を介してエクスポートされます。細胞質で外因性の抗原は、ERAD 基質として、抗原ペプチドにユビキチン-プロテアソーム システムによって処理されます。抗原ペプチド同一または隣接する非古典的エンドサイトーシス コンパートメント、またはタップ トランスポーターを介して隣接する小胞体に運ばれる、それからロード MHC 私 PLC による分子。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ボーヴァとミクロソームの浄化を受けて ERAD 。(A) A bOVA ERAD を受けるとミクロソームの浄化の概念図。ボーヴァは、Sec61 トランスロコンによる膜に関連付けられてし、SA 磁気ビーズの対象とします。(+) と (B) ミクロソーム (+) と (-) なし bOVA の事前加算を精製した、または (-) SA 磁気ビーズの有無。タンパク質 (2 μ g) または浄化された蛋白質の対応するボリュームは 7.5 15 %sds のページに解決され、蛋白質バンドの視覚化に使用された銀製の汚損します。右側にある三角形は、SA 磁気ビーズに結合する無指定蛋白質を示します。アスタリスクの付いた三角形を示すユニークな蛋白質は外因追加ボーヴァと SA 磁気ビーズの存在下でのみ見つけた。矢印は、ボーヴァを示しています。(C) ミクロソーム (+) と (+) と (-) なし bOVA の事前加算を精製した、または (-) SA 磁気ビーズの有無。タンパク質 (10 μ g) または浄化された蛋白質の対応するボリュームは 7.5 15 %sds のページで解決、SA HRP とウエスタンブロットを受けます。P.N.: ポスト核の割合です。右にあるアスタリスクは、SA HRP に無指定バンドを示します。少なくとも 3 つの独立した試金で同等の結果が得られた.ボーヴァの事前追加 (D) ミクロソームを SA マグネティック ビーズを用いて精製しました。ミクロソームを施した (+) または (-) トリプシンとテキサス州-100 (2 つの車線を左) 浄化前に、または後浄化 (右 2 車線) なし。タンパク質 (2 μ g) または浄化された蛋白質の対応するボリュームは 7.5 15 %sds のページに解決され、蛋白質バンドの視覚化に使用された銀製の汚損します。右側にある三角形は、SA 磁気ビーズに結合する無指定蛋白質を示します。アスタリスクの付いた三角形を示すユニークな蛋白質は外因追加ボーヴァと SA 磁気ビーズの存在下でのみ見つけた。少なくとも 3 つの独立した試金で同等の結果が得られた.参照28から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: In Vitro再構成の処理と精製ミクロソームにおける卵子を使用してユビキチン化。(+) と (A) 精製されたミクロソーム (+) と (-) なし bOVA の事前追加が扱われたかまたは (-) なし RL と 1 h のフラグ Ub TNE を使用して可溶化したと。ボーヴァは SA マグネティック ビーズを用いて精製され、示された抗体を用いたウエスタンブロットを受けます。右にあるアスタリスクは、SA HRP に無指定バンドを示します。少なくとも 3 つの独立した試金で同等の結果が得られた.(B) 精製されたミクロソームを施した (+) または (-) なし RL、フラグの Ub と 1 h の MG132 TNE を使用した可溶化と。ボーヴァは SA マグネティック ビーズを用いて精製され、SA フラグを用いてウェスタンブロッティングを受けます。右にあるアスタリスクは、SA HRP に無指定バンドを示します。少なくとも 3 つの独立した試金で同等の結果が得られた.Permissio 転載参照28から n。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
CP の以前の研究で法人の外因性の抗原は蛍光顕微鏡観察16,30,31,32後期エンドソーム小胞体の制限区域に蓄積。ERAD のようなトランスポートおよび外因性抗原の処理は ER または後期エンドソームのこれらの専門分野の運ばれている推定されて細胞内コンパートメントは蔗糖あるいは iodixanol 密度勾配遠心法を使用してによって識別されるようユビキチン bOVA ERAD のような処理のマーカーとして。自分の免疫を刺激後 CP 効率が大幅に増加、ユビキチン bOVA と共に bOVA のピーク率高い密度の割合 (未発表結果) に移行します。これらの実験の目的は、小胞体または bOVA またはユビキチン bOVA と共に移行後期エンドソームの特定の分子マーカーを識別するあった。結果で、ER レジデント分子と後期エンドソーム住民分子がボーヴァとこれらの実験成功 ERAD のような輸送のための細胞内コンパートメントを究明したを示すユビキチン bOVA 移行古典的な ER または後期エンドソームとして処理します。これらの実験で bOVA やユビキチン bOVA 除くエンドサイトーシスのコンパートメントで特定の分子はなかった。しかし、外因性の抗原は、ERAD のようなトランスポートを施行、一方これらの分子は translocons、Sec61 複合など (図 1, 図 2 a) によって小胞体の脂質二重膜を貫通しました。ボーヴァの付着膜はエンドサイトーシスのコンパートメントのマーカーとして選ばれ、ミクロゾーム SA 磁気ビーズ (図 2 a、2 b) で精製しました。これらの精製されたミクロソームで蓄積されたボーヴァは ERAD のようなユビキチン化と RL と ATPの in vitro (図 3 a, 3 b) の存在下で処理に出くわした。RL はユビキチン関連分子や転写、翻訳の分子に加えプロテアソームなどすべてのゾル性細胞質分子 apparati を含んでいるので、RL の追加は精製ミクロゾームで bOVA のユビキチン化を利用できます。これらの結果を示す目的の細胞コンパートメントを精製ミクロソームにいた ERAD のようなトランスポートおよび外因性抗原の処理は、同時にエンドソーム特異的分子と小胞体分子を含む両方Lamp1 は、精製の微粒体の前駆体と成熟したフォームの両方を示した。
このプロトコルは外因性抗原の膜貫通; の量に依存しています十分に半コンフルエントの状態における外因性抗原を組み込むに高い能力を発揮する DC2.4 細胞外因性の抗原を組み込むことが重要です。ボーヴァと DC2.4 の 6-12 h インキュベーション時間を伸長法人 bOVA の量が増えます。ラクタシスチン、MG132、プロテアソーム阻害剤添加適度精製ミクロソームの量が増加します。微粒体の準備は、このプロトコルの最も重要な手順の 1 つです。DC2.4 細胞に組み込まれていない、無料のボーヴァは微粒体の一部分の無料 bOVA の非特異的結合を防ぐため、pbs セルを洗浄することにより除去されるべき。膜コンパートメントに損害を減らすためには、細胞は慎重に氷の水で Dounce ホモジナイザーによって中断されます。その後、ミクロソームいたポスト核分画と切れ目のない細胞や核して遠心分離によって削除されました。ミクロゾームの準備の後 SA 磁気ビーズによるワンステップ精製が行われます。この手順でバインド マグネット微粒体の注意洗濯は他の細胞コンパートメントの非特異的結合を削除して具体的にはバインドされた微粒体を失うことに必要です。
この 1 つのステップ浄化方法でターゲットの微粒体のかなりの割合が必要です。客観的の微粒体の比率が小さすぎると、浄化されたターゲットの微粒体の量が他の細胞コンパートメントの非特異的結合と競争によって減少します。したがって、これらの条件下でターゲットの微粒体の濃縮および非固有の微粒体のクリアランス必要になります。また、SA 磁気ビーズによる浄化する前に追加の手順を導入することが可能です。1 つのようなステップは、iodixanol またはショ糖密度勾配遠心法、微粒体の。準備されたミクロソームには膜のすべての製品が含まれて、ので精製抗原豊かな分数を選択することにより SA 磁気ビーズ浄化する前にターゲットの微粒体を豊かにすることが可能ででしょう。別の可能なステップは、SA SA 磁気ビーズに対してミクロソーム協会非固有バック グラウンドを低減することがなく制御磁気ビーズによる微粒体の前のクリアランスです。これらの実験で両方の手順ターゲット微粒体の純度を効果的に改善、精製物のさらなる実験の手段として選択する追加の手順を示す合計量を減少します。
その高速遠心分離融合や細胞内小胞の血液凝固を引き起こすことが示されているをよく知られています。これらの融合または clottings 人工ミクロゾームでは, 細胞小器官由来の小胞の種類間の非特異的相互作用に由来するが生成されます。これらの人工ミクロソームには統計的にミトコンドリア常駐分子、ゴルジ装置常駐分子などすべての膜の分子が含まれます。これらの精製されたミクロソーム caveosome 居住者蛋白質、ゴルジ装置固有の蛋白質、または初期エンドソーム居住者蛋白質、caveolin1、商品番号:gm130、EEA1 など SA 精製ミクロソームは人工物ではないことを示す含まれていません。さまざまな種類の小胞の融合から派生します。高速遠心分離せず bOVA こだわり小胞の分離ですが bOVA なし小胞から制御実験を示した非特異的分子の高い金額。これはこの予備メソッドが連続実験のために十分ではないことと、高速遠心分離のステップがこの浄化のプロトコルに必要なことを示します。
このプロトコルは、さまざまな DC サブセット、または他の Apc などの他の細胞型に適用されます。また、蛍光タンパク質、抗原抗体複合体、ビーズ抗原など、さまざまな条件で外因性の抗原のさまざまな種類を使用することが可能です。さらに、外因性の抗原に対して特定の抗体を使用してターゲット ミクロソームを浄化できます。いくつかの追加の手順や変更は、他の細胞や抗原をこのプロトコルを適用する必要がある、さまざまな実験の中で浄化された分子を比較することによってプロテアソーム依存 CP の分子機構を解明することができます。したがって、記載されているプロトコルには、変更および改善のための部屋があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、高崎保健福祉大学のによってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
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