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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Purification du compartiment membranaire pour dégradation associés au réticulum endoplasmique des antigènes exogènes dans présentation croisée

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

Summary

La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification des compartiments cellulaires où les antigènes exogènes sont traitées par dégradation associés au réticulum endoplasmique dans présentation croisée.

Abstract

Les cellules dendritiques (CD) sont très capables de traiter et de présenter des antigènes exogènes intériorisées lors de classe majeur d’histocompatibilité (MHC) j’ai également connu sous le nom de Croix-présentation des molécules (CP). CP joue un rôle important non seulement dans la stimulation de la naïve CD8+ T cellules et mémoire CD8+ T cells pour infectieuses et immunitaires de la tumeur mais aussi dans l’inactivation d’auto-protection cellules naïves T par l’anergie des lymphocytes T ou de la suppression de cellules T. Bien que le mécanisme moléculaire critique du CP reste à élucider, accumulant indiquent que les antigènes exogènes sont traitées par associés au réticulum endoplasmique dégradation (ERAD) après exportation de non-classique endocytose compartiments. Jusqu'à une date récente, la caractérisation de ces compartiments endocytose était limitée car il n’y a aucun marqueurs moléculaires spécifiques autres que les antigènes exogènes. La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification de ces compartiments endocytose. Utilisant cette microsome purifiée, nous avons reconstitué ERAD-comme transport, ubiquitination et traitement de l’antigène exogène in vitro, suggérant que le système ubiquitine-protéasome traitées l’antigène exogène après l’exportation de cette compartiment cellulaire. Ce protocole peut être appliqué également à d’autres types de cellules de clarifier le mécanisme moléculaire de CP.

Introduction

Le MHC I molécules sont exprimées à la surface de toutes les cellules nucléées, avec petits peptides antigéniques provenant des antigènes endogènes, qui sont traitées par le système ubiquitine-protéasome dans le cytosol1. Après le traitement, les peptides antigéniques sont transportés dans la lumière du réticulum endoplasmique (re) par le transporteur de peptide TAP. Dans la lumière de l’ER, une série de chaperons spécifiques aident le chargement de peptide et le repliement correct de MHC I complexe. Cette série de molécules s’appelle le complexe de peptide-chargement (PLC), indiquant que l’ER est un compartiment central pour le peptide chargement sur MHC I2. Après le peptide de chargement, le MHC I molécules sont transportés à la surface des cellules et jouent un rôle clé dans le système immunitaire adaptatif comme marqueurs autonome et active le CD8+ des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) pour détecter les cellules cancéreuses ou agents infectieux par antigénique peptides de protéines de non-soi3.

En antigène présentant des cellules (APC), des peptides antigéniques des antigènes exogènes sont également présentés à MHC I4,5,6,7,8 par CP, qui est principalement porté par DCs9,10,11. CP est essentiel tant pour l’activation de naïve CD8+ T des cellules et la mémoire CD8+ T cells dans anti-infectieuses et anti-tumorale CTL12,13et dans le maintien de la tolérance immunitaire par l’inactivation du autonomes naïf T cells14,15. Le CP joue plusieurs rôles importants dans le système immunitaire adaptatif, mais n’ont pas encore être décrit en détail les mécanismes moléculaires du CP. Des études antérieures du CP a révélé que les antigènes exogènes ont été localisées dans la salle d’urgence et l’endosome et ont été traitées par ERAD, suggérant que les antigènes exogènes sont transportées de l’endosome à l’urgence pour le traitement de ERAD-like et peptide chargement16 . Toutefois, les preuves s’accumulent indiquent que le chargement de peptide de CP s’effectue pas dans la salle d’urgence, mais plutôt dans des compartiments endocytose non classiques, qui ont aussi des traits distinctifs de l’ER (Figure 1)17,18 ,19,20,21. Pour éviter une dégradation des précurseurs peptide antigénique par la forte activité d’aminopeptidase22 dans le cytosol, le traitement et le peptide dans le CP de chargement se produit dans la zone proximale de ces compartiments endocytose non classique (Figure 1). Bien que la caractérisation de ces compartiments endocytose est controversée, il n’y a aucun existant des molécules spécifiques autres que les antigènes exogènes dans ce compartiment.

ERAD est une voie cellulaire, qui spécifiquement élimine les protéines mal repliées de l’ER. Dans la voie ERAD, les protéines mal repliées sont marqués transportés à travers la membrane du re vers le cytoplasme et traités par l’ubiquitine-protéasome système23,24,25. Lorsque les grosses molécules, comme les protéines, sont transportés à travers la bicouche lipidique, ces molécules traversent un dispositif moléculaire appelé un translocon, tels que le complexe Sec61 et Derlin complexe dans l’ER26et le complexe de Tom et Tim complexe dans la 27de mitochondries. Lorsque les antigènes exogènes ajoutés sont transportés à travers la membrane du re, ils doivent pénétrer la bicouche lipidique complexe avec translocons, tels que le complexe Sec61. La méthode décrite ici a purifié la vésicule ciblée en utilisant ces molécules pénétrantes membrane comme marqueurs pour les compartiments de l’endocytose.

La méthode décrite ici est un nouveau protocole de purification de vésicule à l’aide de la cellule DC ligne DC2.428 et biotinylés ovalbumine (bOVA) comme un antigène exogène. L’endocytose compartiments ont été purifiés par la Streptavidine (SA)-des billes magnétiques utilisant le bOVA pénétrantes membrane comme un fabricant. Dans cette microsome purifiée, certains ajoutée exogène bOVA était encore conservé dans les fractions membranaires mais ont été transporté à l’extérieur des microsomes et puis ubiquitinées et traitée en vitro29. Cette microsome purifiée contenait non seulement les protéines intervenant dans l’endocytose de compartiment spécifiques, mais aussi les protéines ER-résident pour ERAD et le peptide de chargement complexe ; ce qui laisse supposer que le compartiment cellulaire est le compartiment endocytose prospectif pour CP29. Ce protocole n’est pas tributaire de la nature des antigènes exogènes et s’applique également pour les autres sous-ensembles de DC et autres types de cellules, telles que les macrophages, les cellules B et les cellules endothéliales, de clarifier le mécanisme moléculaire précis de DCs pour CP compétent.

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Protocol

1. cellules de plus en plus et ajout d’antigènes exogènes

  1. Prepare bOVA utilisant un étiquetage de biotine-protéine kit suivant le fabricant ' protocole de s.
    Remarque : Normalement, bOVA contient biotine 2 M par 1 M OVA enmoyenne.
  2. Cellules DC2.4 croître en milieu RPMI-1640 additionné de 2 mM de L-glutamine, pyruvate de sodium 1 mM, acides aminés non essentiels de 0,1 mM, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 55 mM 2-mercaptoéthanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) et sérum de veau foetal de 10 % (ci-après RPMI) à 37 ° C en 5 % De CO 2 dans un incubateur humidifié (ci-après sans mention, les cellules sont incubées à cette condition). Il est également possible d’utiliser DMEM additionné de sérum de veau foetal de 10 %, 3,7 g/L NaHCO 3 (ci-après DMEM) à la place de RPMI.
  3. Une journée avant la purification, diviser les cellules en RPMI à 1 x 10 5 cellules/mL dans une plaque de culture de tissus. Éviter de garder les cellules à un État anastomosé. DC2.4 cellules peuvent incorporer très antigènes exogènes jusqu'à un état semi confluent, mais perdent rapidement la capacité après avoir atteint un État anastomosé excessive.
  4. Avant la DC2.4 cellules sont semi-confluentes, ajouter 250 µg/mL de bOVA pour 1 x 10 6 cellules/mL et incuber pendant 2 à 4 h.
    Remarque : Au cours d’expériences en aval, tous les tampons et les réactifs sont conservés à 4 ° C sauf indication contraire.

2. Préparation des Microsomes

  1. récolter les cellules DC2.4 de pipetage doux de la plaque de tissu dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  2. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min, 4 ° C et retirer soigneusement le support avec bOVA par aspiration.
  3. Laver les cellules DC2.4 deux fois avec 40 mL de tampon PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min, 4 ° C et éliminer le surnageant de chaque fois par aspiration.
  4. Remettre le culot à l’étape 2.3 dans 1-2 mL (1/20-1/10 volume de milieu de culture) du milieu d’homogénéisation (0,25 M de sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7,4]) avec volume de 1/1 000 de cocktails inhibiteur de protéase et transfert le DC2.4 remises en suspension des cellules dans une glacee Dounce homogénéisateur.
  5. Perturber les cellules DC2.4 resuspendues doucement en 10 à 20 coups avec l’homogénéisateur Dounce glacee.
    Remarque : Lors de l’étape de la perturbation, l’homogénéisateur Dounce est refroidi sur glace
  6. Transférer la suspension cellulaire-perturbé dans un nouveau tube conique de 15 mL.
  7. Ajouter 8-9 mL de milieu de l’homogénéisation au total 10 mL et centrifuger le tube conique pendant 10 min à 2 000 x g et 4 ° C.
  8. Transférer le surnageant dans un nouveau tube conique 15 mL pour enlever les noyaux et des cellules ininterrompues et centrifuger le tube conique à nouveau pendant 10 min à 2 000 x g et 4 ° C.
  9. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de l’ultracentrifugation et centrifuger pendant 45 min à 100 000 x g et 4 ° C.
  10. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot avec soin dans 1 à 2 mL de milieu d’homogénéisation avec volume de 1/1 000 de cocktails inhibiteur de protéase en pipettant également, la solution de monter et descendre plusieurs fois de faire une fraction microsome pour expériences en aval.
  11. Transférer la fraction microsome dans un nouveau tube fond rond 5 mL.
    NOTE : Après cette étape, il est possible d’enrichir les microsomes objectives par centrifugation en gradient de densité iodixanol selon le fabricant ' protocole de s, pour enlever les microsomes non spécifiques. Les fractions de pic pour les antigènes exogènes sont collectées et ensuite soumises à la prochaine étape de la purification (étape 3).

3. Purification des Microsomes avec bOVA subissant ERAD

perles magnétiques SA
  1. Add 1/100 volume de produits frais à la fraction microsome d’étape 2.11 dans les 5 mL rond tube inférieur.
    Remarque : Avant cette étape, il est possible d’avance la fraction microsome par des billes magnétiques contrôle afin de réduire les contaminations de microsomes non-spécifiques.
  2. Doucement, bien mélanger et faire pivoter le tube fond rond lentement pendant 30 min à 4 ° C.
  3. Ajouter 2-3 mL de milieu de l’homogénéisation au total 4 mL dans le tube à fond rond et mélanger délicatement bien.
  4. Le tube fond rond sur un support magnétique et incuber pendant 10 min à 4 ° C. Puisque les perles liés aux vésicules sont attirés par l’aimant, micro-billes bruns s’accumuleront progressivement à la paroi du tube le plus proche de l’aimant.
  5. Avec le tube restant dans le support magnétique, jeter avec précaution les surnageants par aspiration pour enlever les vésicules indépendants.
  6. Laver les billes magnétiques liés aux vésicules deux fois avec 5 mL de milieu d’homogénéisation par la magnétique reposer pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant de chaque fois par aspiration soigneusement.
    Remarque : Sans le support magnétique, purification par centrifugations à 2 000 x g pendant 10 min, 4 ° C est également disponible.
  7. Remettre les billes magnétiques liés aux vésicules soigneusement dans 100 µL de milieu homogénéisation en pipettant également, la solution de monter et descendre plusieurs fois.
  8. Transférer les vésicules remises en suspension dans un microtube de nouveau comme le microsome purifiée pour expériences en aval.
    Remarque : En règle générale, 50 µL de fraction microsome contenant de 5 à 20 µg protéines de 1 x 10 7 cellules peut être isolées.

4. Analyse des Microsomes purifiée

  1. remettre le magnétique perles liés aux vésicules d’étape 3,8 par 100-200 µL de tampon TNE (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, EDTA de 0,5 M, 1 % Nonidet P-40) avec volume de 1/1 000 de cocktails inhibiteur de protéase au lieu de la moyenne de l’homogénéisation.
  2. Transférer le lysat d’étape 4.1 vers un nouveau microtubes de 1,5 mL.
  3. Déterminer la concentration de la protéine de l’étape 4.2 en utilisant un kit de dosage BCA par le fabricant ' protocole de s.
    Remarque : En général, 5 à 10 µL de lysat d’étape 4.2 est suffisant pour déterminer la concentration de protéine.
  4. Transférer le lysat de l’étape 4.2 (2 µg de protéines pour la coloration à l’argent et 10 µg de protéines pour éponger occidental) dans nouveau microtubes.
  5. Mettre les microtubes sur un bloc chauffant à protéines 95 ° C et faire bouillir dans 1 x tampon de gel-charge de SDS (100 millimètres Tris-HCl pH 6,8, bleu de bromophénol 200 mM dithiothréitol, SDS de 4 %, 0,2 % et 20 % de glycérol) pendant 5 min.
  6. Centrifuger les microtubes pendant 10 min à 21 500 x g et 4 ° C. recueillir les surnageants dans des microtubes de nouveau pour enlever les fractions insolubles.
  7. Analyser les protéines résolus à l’étape 4.6 (2 µg) par SD-PAGE standard.
  8. Visualiser les bandes de protéines par la coloration à l’aide de coloration à l’argent à l’argent kit après le fabricant ' protocole de s.
  9. Analyser les protéines résolus à l’étape 4.6 (10 µg) par SD-PAGE standard et Western-Blot. Utiliser le réactif (SA-HRP) par le fabricant ' s le protocole et le visualiser par fluorographie.

5. In Vitro Reconstitution de l’Ubiquitination ERAD bOVA Microsomes de purifiée à l’aide de

  1. transfert purifié microsomes (5-10 µg de protéines) de l’étape 3.8 avec un volume de 50 % de lysat de réticulocytes (RL), 1 x tampon de réaction (50 mM Tris pH 7,4, ATP, 0,5 mM MgCl 3 mM (2) et 12:02-tag drapeau ubiquitine dans un microtube de nouveau. Le volume final de cette expérience est de 20-40 µL.
  2. Incuber le microtube pendant 2 h à 37 ° C.
    Remarque : Si le montant de bOVA ubiquitinées dans étape 5.12 est trop petit pour détecter les Western Blot, ajouter 10 µM de MG132 ou 2 µM de lactacystin d’inhiber la transformation de la bOVA ubiquitinée par protéasomes.
  3. Arrêter la réaction en plaçant le microtube sur glace.
  4. Résoudre les microsomes en ajoutant 500 µL de tampon de TNE avec volume de 1/1 000 de cocktails d’inhibiteur de la protéase.
  5. Centrifugeuse microtube pendant 10 min à 21,500 x g et 4 ° C. recueillir le surnageant dans un microtube de nouveau pour enlever les fractions insolubles, qui contiennent ubiquitinées bOVA dans DC2.4 avant l’essai in vitro ubiquitination avec.
  6. Transférer le surnageant dans un microtube de nouveau et ajouter 1/100 volume de nouvelles perles magnétiques SA (habituellement 5 µL pour 500 µL de surnageants).
  7. Doucement, bien mélanger et faire pivoter le microtube lentement pendant 30 min à 4 ° C.
  8. Centrifuger le microtube pendant 10 min à 21 500 x g et 4 ° C. jeter le surnageant par aspiration à recouvrer les bOVA ubiquitinées bOVA lié avec les perles magnétiques SA.
  9. Laver deux fois les perles magnétiques SA collectées avec 1 mL de tampon TNE par centrifugation pendant 10 min à 21 500 x g et 4 ° C. jeter le surnageant de chaque fois par aspiration.
  10. Faire bouillir les perles magnétiques SA dans 1 x gel SDS chargement tampon pendant 5 min à 95 ° C sur un bloc chauffant pour résoudre les protéines purifiées par les perles magnétiques SA.
  11. Centrifuger le microtube pendant 10 min à 21 500 x g et 4 ° C. recueillir le surnageant dans un microtube de nouveau pour enlever les fractions insolubles.
  12. Analyser les perles magnétiques SA liées aux protéines par SD-PAGE standard et Western-Blot. L’utilisation d’anticorps (anti-multi-Ub, Anti-Flag et anti-souris IgG-HRP) et le réactif (SA-HRP) est par le fabricant ' protocole s et visualisée par fluorographie.

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Representative Results

Afin d’élucider les mécanismes moléculaires du CP, il est nécessaire d’identifier les compartiments cellulaires, où les antigènes exogènes subissent un transport ERAD-like et le traitement. Alors que les observations en microscopie par immunofluorescence ou par microscopie électronique identifié le compartiment cellulaire où les antigènes exogènes accumulent16,17,18,19, 30,31,32,33, les compartiments cellulaires pour le traitement de ERAD-comme des antigènes exogènes ne sont pas clairement définis. Récemment, il a été démontré que des endosomes non classique avec des molécules résidents ER étaient responsables de CP34, mais ces compartiments cellulaires non-purifiés. La difficulté à isoler et purifier les compartiments cellulaires peut être attribuée au fait que les antigènes exogènes sont localisées dans l’endosome et ER-comme compartiments et qu’il n’existe aucune molécule d’identification pour ces compartiments endocytose autres que des antigènes exogènes. Toutefois, la condition d’antigènes exogènes transport ERAD-comme l’objet est différente de l’état d’équilibre ; dans le transport à travers la membrane bimoléculaire de lipides, antigènes exogènes pénètrent la membrane par l’intermédiaire de translocons, tels que Sec61 (Figure 2 a). Ainsi, lorsque vous utilisez bOVA comme antigène exogène, bOVA devrait être associé à Sec61. Car bOVA associées aux membranes spécifiquement lié avec SA, les microsomes préparés à partir de DC2.4, qui a été prétraités avec bOVA, pouvait être isolé distinctement par des billes magnétiques SA (Figure 2 a). Puis des quantités équivalentes de protéines à partir des microsomes purifiés avec ou sans pré-incubation de bOVA ont été résolues par SDS-PAGE, suivie de la coloration à l’argent et Western Blot avec SA-HRP (Figure 2 b, 2C). Comme illustré à la Figure 2 b et la Figure 2, les microsomes isolés contenaient plusieurs protéines uniques qui ont été purifiées dépendant de bOVA exogène et SA – magnétiques. En plus de ces protéines uniques, microsomes isolés contient également des protéines non spécifiques, qui est liée à SA magnétique perles avec ou sans bOVA. Traitement de la microsome avec la trypsine avant la purification par l’aimant a empêché la purification des microsomes (Figure 2D), ce qui indique que les méthodes de purification dépend de la présence de bOVA pénétrantes membrane.

Les microsomes purifiées a montré la capacité de deubiquitinase le bOVA incorporé in vitro, en présence du SJSR (Figure 3 a). Les montants de bOVA et poly-ubiquitinées bOVA sont augmentées en présence de MG132 (Figure 3 b), indiquant que le bOVA incorporé a été traitée par le système ERAD et que notre microsomes purifiées contenaient des protéines machines ERAD.

Figure 1
Figure 1 : voies intracellulaires de CP dans les PED. Dans les PED, antigènes exogènes sont transportés dans des compartiments endocytose non classique, qui contiennent aussi des molécules ER-résident en plus de molécules de l’endosome tardif classique. Dans ce compartiment, antigènes exogènes sont exportés dans cytosol par translocons comme Sec61. Dans le cytosol, antigènes exogènes sont traitées par le système ubiquitine-protéasome en peptides antigéniques comme substrats ERAD. Les peptides antigéniques sont transportés dans des compartiments endocytose non-classique mêmes ou à proximité, ou adjacent ER par transporteur TAP et puis chargement sur le MHC I molécules par PLC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Purification des Microsomes avec bOVA subissant ERAD. (A) A le modèle schématique de la purification des microsomes avec bOVA subissant ERAD. bOVA est associée à la membrane par le translocon Sec61 et ciblés avec SA – magnétiques. Les Microsomes (B) avec le (+) ou sans (-) addition préalable de bOVA sont purifiées avec (+) ou sans billes magnétiques SA (-). Protéines (2 µg) ou les volumes correspondants de protéines purifiées ont été résolus sur 7,5-15 % SDS-PAGE et coloration à l’argent a été utilisée pour visualiser les bandes protéiques. Triangles sur le côté droit indiquent des protéines non spécifiques liant aux talons SA-magnétique. Triangles avec astérisques indiquent des protéines uniques trouvés seulement en présence de bOVA exogène et billes magnétiques-SA. La flèche montre bOVA. Les Microsomes (C) avec le (+) ou sans (-) addition préalable de bOVA sont purifiées avec (+) ou sans billes magnétiques SA (-). Protéines (10 µg) ou les volumes correspondants de protéines purifiées sont résolus sur 7,5-15 % SDS-PAGE et soumises à Western blotting avec SA-HRP. P.N. : fraction post-nucléaire. Astérisques dans le droit indiquent les bandes non spécifique avec SA-HRP. Des résultats équivalents ont été atteint par au moins trois tests indépendants. Les Microsomes (D) avec addition préalable de bOVA sont purifiées avec SA – magnétiques. Les microsomes ont été traités avec le (+) ou sans (-) la trypsine et TX-100 avant la purification (deux voies de gauche) ou après purification (juste deux voies). Protéines (2 µg) ou les volumes correspondants de protéines purifiées ont été résolus sur 7,5-15 % SDS-PAGE et coloration à l’argent a été utilisée pour visualiser les bandes protéiques. Triangles sur le côté droit indiquent des protéines non spécifiques liant aux talons SA-magnétique. Triangles avec astérisques indiquent des protéines uniques trouvés seulement en présence de bOVA exogène et billes magnétiques-SA. Des résultats équivalents ont été atteint par au moins trois tests indépendants. Réimprimé avec la permission de référence28. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : In Vitro Reconstitution de traitement et à l’aide d’ovules dans les Microsomes purifié l’Ubiquitination. (A) purifiée microsomes avec (+) ou sans (-) addition préalable de bOVA ont été traitées avec le (+) ou sans (-) RL et drapeau-Ub pendant 1 h et sont solubilisées en utilisant TNE. bOVA était purifié avec SA – magnétiques et soumise à Western blotting avec les anticorps indiquées. Astérisques dans le droit indiquent les bandes non spécifique avec SA-HRP. Des résultats équivalents ont été atteint par au moins trois tests indépendants. (B) les microsomes purifiée ont été traités avec le (+) ou sans (-) RL, drapeau-Ub et MG132 pendant 1 h et sont solubilisées puis à l’aide de TNE. bOVA était purifié avec SA – magnétiques et soumise à éponger occidental avec SA-drapeau. Astérisques dans le droit indiquent les bandes non spécifique avec SA-HRP. Des résultats équivalents ont été atteint par au moins trois tests indépendants. Réimprimé avec permission de référence28. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans les études précédentes du CP, les antigènes exogènes incorporés accumulent dans la zone réglementée de l’endosome tardif ou ER par microscopie par immunofluorescence16,30,31,32. On estime que ERAD-comme transport et le traitement des antigènes exogènes sont effectués dans ces domaines spécialisés de l’ER ou retard endosome, le compartiment cellulaire a été identifié par le saccharose ou à l’aide la centrifugation en gradient de densité iodixanol ubiquitinées bOVA comme un marqueur de traitement ERAD-like. Après stimulation de l’immunité innée, CP efficacité significativement augmentée, et la fraction de pic pour bOVA avec ubiquitinées bOVA migré vers une fraction de densité plus élevée (nos résultats non publiés). Les objectifs de ces expériences étaient d’identifier des marqueurs moléculaires spécifiques pour la salle d’urgence ou retard endosome, qui a immigré avec bOVA ou ubiquitinées bOVA. Mais dans les résultats, les molécules résidents ER et retard endosome-résident molécules migrent avec la bOVA et ubiquitinées bOVA, indiquant que ces expériences n’étaient pas réussis à déterminer le compartiment cellulaire ERAD-comme transport et traitement de l’ER classique ou un endosome tardif. Dans ces expériences, il n’y a aucune des molécules spécifiques dans les compartiments d’endocytose sauf bOVA ou ubiquitinées bOVA. Cependant, tandis que l’antigène exogène a subi ERAD-comme transport, ces molécules pénètrent la membrane lipidique bi-couche de ER par le biais de translocons, tels que Sec61 complexes ( Figure 2 adela Figure 1, ). La membrane coller bOVA a été choisie comme marqueur des compartiments endocytose et les microsomes ont été purifiées par des billes magnétiques SA (Figure 2 a, 2 b). Dans ces microsomes purifiées, bOVA accumulé a rencontré ERAD-comme l’ubiquitination et transformation sous la présence de RL et ATP in vitro (Figure 3 a, 3 b). Étant donné que RL contient tous les appareils moléculaire cytosolique, tels que des molécules liées à l’ubiquitination et protéasomes en plus de molécules de traduction et de transcription, l’ajout de RL permet l’ubiquitination de bOVA en microsome purifiée. Ces résultats indiquent que les microsomes purifiées étaient les compartiments cellulaires objectives ERAD-comme transport et le traitement des antigènes exogènes, tous deux contenant endosome spécifique des molécules et les molécules de l’ER-résident dans le même temps ; Lamp1 a montré les précurseurs et les formes matures dans les microsomes purifiée.

Ce protocole est dépendant de la quantité d’antigènes exogènes pénétration membranaire ; Il est important d’incorporer assez des antigènes exogènes aux cellules DC2.4, qui montre une grande capacité à intégrer des antigènes exogènes dans l’état semi confluente. Allongeant la période d’incubation de 6 à 12 h pour DC2.4 avec bOVA augmente la quantité de bOVA incorporé. L’addition d’inhibiteurs des protéasomes, MG132 ou lactacystin, augmente modérément les montants des microsomes purifiées. La préparation de la TPO est une des étapes plus critiques pour ce protocole. Le bOVA gratuit, ce qui n’est pas incorporée dans les cellules DC2.4, doit être retiré par laver les cellules avec du PBS, afin d’éviter les liaisons non spécifiques de la bOVA gratuit la fraction microsome. Pour réduire les dommages sur les compartiments membranaires, les cellules sont soigneusement perturbés par l’homogénéisateur Dounce dans l’eau glacée. Puis les noyaux et ininterrompu de cellules ont été retirés par centrifugation les microsomes étaient disposée de la fraction post-nucléaire. Après préparation des microsomes, purification en une seule étape par SA – magnétiques est effectuée. Dans cette étape, un lavage soigneux de l’aimant lié microsome est nécessaire pour supprimer la liaison non spécifique d’autres compartiments cellulaires et à ne pas perdre le microsome spécifiquement lié.

Dans cette méthode de purification d’une étape, un pourcentage significatif de la microsome cible est nécessaire. Si le rapport entre le microsome objective est trop petit, la quantité de microsome purifiée cible diminue par la concurrence avec d’autres compartiments cellulaires non-spécifiques. En conséquence, dans ces conditions, les enrichissements de microsomes de la cible et le déminage de la microsome non spécifique serait nécessaires. Il est également possible d’introduire des mesures supplémentaires avant la purification par les billes magnétiques-SA. Une telle démarche est le saccharose ou iodixanol densité centrifugation en gradient de la TPO. Étant donné que les microsomes préparés contiennent tous les produits de la membrane, il peut être possible d’enrichir le microsome cible avant la purification de perles magnétiques SA en sélectionnant les fractions riches d’antigène pour la purification. Une autre étape possible est l’approbation préalable de la microsome par des billes magnétiques contrôle sans SA, afin de réduire les associations de fond non spécifique des microsomes contre SA – magnétiques. Dans ces expériences, les deux étapes amélioré la pureté de la microsome cible efficacement, mais a diminué le montant total des produits purifiés, indiquant que les étapes supplémentaires suivantes sont sélectionnées comme moyen d’autres expériences.

Il est bien connu que centrifugation à grande vitesse s’est avérée provoquer la fusion ou la coagulation des vésicules intracellulaires. Ces fusions ou clottings produira des microsomes artificielles, dont sont issus les interactions non spécifiques entre différents types de vésicules provenant organite. Ces microsomes artificiels contiennent statistiquement chaque molécule membranaire mitochondriale résident molécule, molécule résident de l’appareil de Golgi, etc.. Ces microsomes purifiées ne comprennent pas le caveosome résident protéines, protéines résidentes de l’appareil de Golgi ou début endosome-résident protéines, tels que caveolin1, GM130 et EEA1, indiquant que les microsomes purifié SA ne sont pas des produits artificiels dérivé de la fusion entre différents types de vésicules. Sans la centrifugation à grande vitesse, bOVA-collage de vésicules ont été isolés, mais les expériences de contrôle des vésicules sans bOVA ont montré des quantités plus élevées de molécules non spécifiques. Cela indique que cette méthode préliminaire ne suffit pas pour des expériences successives et que l’étape de centrifugation à haute vitesse est nécessaire pour que ce protocole de purification.

Le présent Protocole s’applique aux autres types de cellules, telles que différents sous-ensembles de DC ou autres TTB. Il est également possible d’utiliser les différents types d’antigènes exogènes dans des conditions différentes, telles que des protéines fluorescentes, complexe antigène-anticorps, antigènes de perles liés, etc.. En outre, nous pouvons purifier les microsomes de cible en utilisant des anticorps spécifiques contre les antigènes exogènes. Bien que plusieurs étapes supplémentaires ou des modifications peuvent être nécessaires pour appliquer le présent protocole aux autres cellules et les antigènes, il peut élucider les mécanismes moléculaires de la CP du protéasome dépendante en comparant les molécules purifiées parmi différentes expériences. Ainsi, le protocole décrit a salle de modification et d’amélioration.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par la Takasaki Université de la santé et le bien-être.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum Equitech bio SFB30
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine gibco by life technologies 25030-164
Penisicillin-Sreptomycin gibco by life technologies 15140-122
DMEM gibco by life technologies 12100-46
OVA SIGMA A5503
Biotin-protein labelling kit Thermo Fisher Scientific F6347
MG-132 Santa Cruz Biotechnology 201270
lactacystin SIGMA L6785
Dounce homogenizer IUCHI 131703
protease inhibitor cocktails SIGMA P8340
iodixanol Cosmo bio 1114542
SA-magnetic beads New England Biolabs 201270
control magnetic beads Chemagen M-PVA012
magnetic stand BD Biosciences 552311
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23225
silver staining kits Cosmo bio 423413
Reticulocyte Lysate Promega 1730714
Flag-tagged ubiquitin SIGMA U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse) Antibody Shop HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse) MBL D058−3
anti-Flag (mouse) SIGMA F3165
trypsin SIGMA 85450C

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References

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Immunologie numéro 126 cellules dendritiques dégradation associés au réticulum endoplasmique présentation croisée majeur d’histocompatibilité de classe I translocon ubiquitine
Purification du compartiment membranaire pour dégradation associés au réticulum endoplasmique des antigènes exogènes dans présentation croisée
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Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation. J. Vis. Exp. (126), e55949, doi:10.3791/55949 (2017).

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