Summary
O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação dos compartimentos celulares onde os antígenos exógenos são processados pelo retículo endoplasmático associado a degradação em cruz-apresentação.
Abstract
Células dendríticas (DCs) são altamente capazes de processar e apresentar antígenos exógenos interiorizados a classe principal de histocompatibilidade (MHC) moléculas também conhecido como Cruz-apresentação (CP). CP desempenha um papel importante não só na estimulação de ingênuo CD8+ T memória CD8 e células+ T células para infecciosas e imunidade de tumor, mas também na inativação de auto-agente ingênuo T células por células T anergy ou supressão de células T. Embora o mecanismo molecular crítico da CP continua a ser elucidado, acumula evidências indicam que antígenos exógenos são processados através de retículo endoplasmático associado degradação (ERAD) após a exportação do não-clássica endocítica compartimentos. Até recentemente, caracterizações desses compartimentos endocítica limitavam-se porque não havia nenhum marcadores moleculares específicos além de antígenos exógenos. O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação desses compartimentos endocítica. Usando esta purificada do microsome, nós reconstituído a ERAD, como transporte, ubiquitination e processamento do antígeno exógeno em vitro, sugerindo que o sistema ubiquitina-Proteassoma processado o antígeno exógeno após exportação deste compartimento celular. Este protocolo pode ser mais aplicado a outros tipos de células para esclarecer o mecanismo molecular da CP.
Introduction
O MHC moléculas são expressas na superfície de todas as células nucleadas, com curtos peptídeos antigênicos derivados de antígenos endógenos, que são processados pelo sistema ubiquitina-Proteassoma no citosol1. Após o processamento, peptídeos antigênicos são transportados para o lúmen do retículo endoplasmático (ER) pelo transportador peptídeo TAP. No lúmen do ER, uma série de acompanhantes específicos auxiliar o carregamento do peptide e o dobramento correto do MHC complexo eu. Esta série de moléculas é chamado o complexo peptídeo-carregamento (PLC), indicando que o ER é um compartimento central para peptídeo carregando em cima do MHC eu2. Depois de peptídeo de carregamento, o MHC moléculas são transportadas à superfície da célula e desempenhar um papel fundamental no sistema imune adaptativo como marcadores auto e habilita o CD8+ linfócitos T citotóxicos (CTLs) para detectar células cancerosas ou agentes infecciosos por antigênica peptídeos de proteínas não-auto3.
Em células apresentadoras de (APC), peptídeos antigênicos de antígenos exógenos são também apresentados em MHC eu4,5,6,7,8 através do CP, que é realizada principalmente por DCs9,10,11. CP é essencial tanto para a ativação do ingênuo CD8+ T memória CD8 e células+ T células em anti-infecciosos e anti-tumoral CTLs12,13e na manutenção da tolerância imunológica pela inactivar de auto interino ingênuo T células14,15. O CP desempenha muitos papéis importantes no sistema imune adaptativo, porém os mecanismos moleculares de CP tem ainda que ser descrita em pormenor. Estudos anteriores de CP revelaram que antígenos exógenos foram localizados no pronto-socorro e o endossomo e foram processados por ERAD, sugerindo que antígenos exógenos são transportados desde o endossomo ao pronto-socorro para a ERAD, como processamento e peptídeo carregando16 . No entanto, acumula evidências indicam que o carregamento do peptide do CP é realizado, não no PS, mas sim em compartimentos endocítica não-clássica, que também têm características distintivas do ER (Figura 1)17,18 ,19,20,21. Para evitar a degradação dos precursores de peptídeo antigênico pela alta atividade de aminopeptidase22 no citosol, processamento e peptídeo carregando no CP ocorre na região proximal desses compartimentos endocítica não-clássica (Figura 1). Embora as caracterizações desses compartimentos endocítica são controversas, não há nenhuma molécula de específica existente além de antígenos exógenos neste compartimento.
ERAD é uma via celular, que especificamente remove proteínas misfolded da emergência. Na via da ERAD, misfolded proteínas retrogradely são transportadas através da membrana de ER para o citoplasma e processadas pelo sistema da ubiquitina-Proteassoma23,24,25. Quando as grandes moléculas, tais como proteínas, são transportadas através da bicamada lipídica, essas moléculas passam por um aparato molecular chamado um translocon, tais como o complexo de Sec61 e Derlin complexo em ER26e o complexo de Tom e Tim complexo na mitocôndrias,27. Quando adicionado exogenamente antígenos são transportados através da membrana de ER, eles devem penetrar a bicamada lipídica em complexo com translocons, tais como o complexo de Sec61. O método descrito aqui purificado da vesícula alvo utilizando estas moléculas de membrana-penetrante como marcadores para os compartimentos endocítica.
O método descrito aqui é um novo protocolo de purificação de vesículas usando o DC, como célula linha DC2.428 e biotinilado ovalbumina (bOVA) como um antígeno exógeno. Os compartimentos endocítica foram purificados por streptavidin (SA)-grânulos magnéticos usando o bOVA penetrar a membrana como um criador. Neste do microsome purificado, alguns adicionados exogenamente bOVA ainda foi preservado em frações de membrana, mas foram transportado para a parte externa do microsome e então ubiquitinated e processada em vitro29. Este microsome purificado contidos não só endocítica compartimento específico proteínas, mas também proteínas ER-residente para ERAD e o peptídeo carregamento complexo; sugerindo que o compartimento celular é o compartimento endocítica prospectivo para CP29. Este protocolo não é dependente do tipo de antígenos exógenos e também é aplicável para outros subconjuntos de DC e outros tipos de células, como macrófagos, células B e células endoteliais, para esclarecer o mecanismo molecular preciso de DCs para CP proficiente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultivo de células e adição de antígenos exógenos
- preparar bOVA usando uma rotulagem de biotina-proteína kit seguindo o fabricante ' protocolo s.
Nota: Normalmente, bOVA contém biotina 2 M por 1 M de óvulos em média. - DC2.4 crescer células em RPMI-1640 suplementado com 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais de 0,1 mM, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 55 mM 2-Mercaptoetanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) e soro fetal bezerro de 10% (doravante RPMI) a 37 ° C em 5 % CO 2 em uma incubadora umidificada (doravante sem menção, as células são incubadas a essa condição). Também é possível usar DMEM suplementado com 10% de soro fetal bezerro, 3,7 g/L NaHCO 3 (doravante DMEM) no lugar de RPMI.
- Um dia antes da purificação, dividir as células em RPMI a 1 x 10 5 células/mL em uma placa de cultura de tecido. Evite manter as células em um estado confluente. DC2.4 células podem altamente incorporar antígenos exógenos até um estado semi confluente, mas rapidamente perdem a capacidade depois de atingir um estado de excesso confluente.
- Antes do DC2.4 células são semi confluentes, adicionar 250 µ g/mL de bOVA para 1 x 10 6 células/mL e incubar durante 2-4 h.
Nota: Durante a jusante experimentos, todos os buffers e os reagentes são mantidos a 4 ° C a menos que indicado de outra forma.
2. Preparação de Microsomes
- colher as DC2.4 células pipetando suave da placa de tecido em um novo tubo cónico de 50 mL.
- Centrifugar 1.000 x g por 5 min, 4 ° C e remova cuidadosamente o meio com bOVA por aspiração.
- Lavar as células DC2.4 duas vezes com 40 mL de tampão PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) por centrifugação a 1.000 x g, durante 5 min, 4 ° C e descartar o sobrenadante de cada vez por aspiração.
- Ressuspender o pellet em passo 2.3 em 1-2 mL (1/20-1/10 volume de meio de cultura) do meio de homogeneização (0,25 M de sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7,4]) com volume de 1/1.000 de coquetéis de inibidor de protease e transferência a ressuspensão DC2.4 células em um gelada homogenizacao homogenizador.
- Interromper as células DC2.4 ressuspensa suavemente por 10-20 pancadas com o gelado homogenizacao homogenizador.
Nota: Durante a etapa de perturbação, a homogenizacao homogeneizador é refrigerado no gelo - Transferir a suspensão celular-interrompido para um novo tubo cônico de 15 mL.
- Adicionar 8-9 mL de meio de homogeneização total 10 mL e centrifugar o tubo cônico durante 10 minutos a 2.000 x g e 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo cônico de 15 mL para remover células ininterrupta e núcleos e centrifugar o tubo cônico novamente por 10 min a 2.000 x g e 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrifugação e centrifugar por 45 min em 100.000 x g e 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o cuidadosamente em 1-2 mL de meio de homogeneização com volume de 1/1.000 de cocktails de inibidor de protease pipetando a solução acima e para baixo várias vezes para fazer uma fração do microsome para jusante experiências.
- Transferir a fração do microsome para um novo tubo de fundo redondo de 5 mL.
Nota: Após esta etapa, é possível enriquecer microssomas objetivas por iodixanol centrifugação gradiente de densidade de acordo com o fabricante ' protocolo de s, remover microssomas específico. As frações de pico para antígenos exógenos são recolhidas e em seguida, submetidas à etapa seguinte de purificação (etapa 3).
3. Purificação de Microsomes com bOVA ERAD passando por
- volume de adicionar 1/100 de fresco grânulos SA-magnético para a fração do microsome da etapa 2.11 no 5 mL tubo de fundo redondo.
Nota: Antes desta etapa, é possível pre-limpar a fração do microsome por grânulos controle magnético para reduzir contaminações de específico microsomes. - Delicadamente, misture bem e gire o tubo de fundo redondo, lentamente por 30 min a 4 ° C.
- Adicionar 2-3 mL de meio de homogeneização total 4 ml para o tubo de fundo redondo e misture suavemente bem.
- Colocar o tubo de fundo redondo num suporte magnético e incubar durante 10 minutos a 4 ° C. Desde que os grânulos ligados para as vesículas são atraídos para o ímã, microgrânulos marrons gradualmente acumularão na parede do tubo mais próximo ao ímã.
- Com o tubo restante no suporte magnético, cuidadosamente descartar os sobrenadantes por aspiração para remover as vesículas desacopladas.
- Lavagem os grânulos magnéticos vinculados as vesículas duas vezes com 5 mL de meio de homogeneização, a magnética defende a 10 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante cada vez por cuidadosamente aspiração.
Nota: Sem o suporte magnético, purificação por centrifugações a 2.000 x g por 10 min, 4 ° C também está disponível. - Ressuspender os grânulos magnéticos vinculados as vesículas cuidadosamente em meio de homogeneização 100 µ l a pipetagem a solução acima e para baixo várias vezes.
- Transferir as ressuspensa vesículas em um microtubo de novo como do microsome purificado para jusante experiências.
Nota: Normalmente, fração do microsome 50 µ l contendo 5-20 µ g proteínas de 1 x 10 7 células pode ser isolados.
4. Análise do Microsomes purificado
grânulos- Ressuspender o magnético ligados para as vesículas de passo 3.8 a 100-200 µ l de tampão TNE (pH de 20 mM Tris-HCl 7.4, 150 mM de NaCl, EDTA 0,5 M, 1% Nonidet P-40) com volume de 1/1.000 de cocktails de inibidor de protease em vez de meio de homogeneização.
- Transferir o lisado de passo 4.1 para um novo microtubo de 1,5 mL.
- Determinar a concentração de proteína da etapa 4.2 usando um kit de ensaio do BCA pelo fabricante ' protocolo de s.
Nota: Normalmente, 5-10 µ l lisado da etapa 4.2 é suficiente para determinar a concentração de proteína. - Transferir o lisado de passo 4.2 (2 µ g de proteína para coloração de prata e 10 µ g de proteína para a mancha ocidental) em microtubos novos.
- Colocar os microtubos em um bloco de calor em proteínas de 95 ° C e ferver em tampão de carregamento de gel de SDS 1x (pH 100 mM Tris-HCl 6,8, azul de bromofenol 200mm ditiotreitol, SDS de 4%, 0,2%, 20% de glicerol) 5 min.
- Centrifugar os microtubos para 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. coletar os sobrenadantes em microtubos novos para remover as frações insolúveis.
- Analisar as proteínas resolvidas na etapa 4.6 (2 µ g) por padrão SD-PAGE.
- Visualize as bandas de proteína pela prata coloração usando coloração prata kit após o fabricante ' protocolo de s.
- Analisar as proteínas resolvidas na etapa 4.6 (10 µ g) por padrão SD-PAGE e Western Bloting. Use o reagente (SA-HRP) pelo fabricante ' s de protocolo e Visualizar por fluorography.
5. In Vitro Reconstituição da ERAD de bOVA usando purificado Microsomes
- transferência o purificado microssomas (5-10 µ g de proteína) da etapa 3.8 com um volume de 50% de reticulócitos lisado (RL), em tampão de reação (50 mM Tris pH 7,4, 3mm ATP, 0.5 mM MgCl 1x 2) e 12:02 bandeira-tag ubiquitin em um microtubo de novo. O volume final deste experimento é 20-40 µ l.
- Incubar o microtubo para 2 h a 37 ° C.
Nota: Se a quantidade de ubiquitinated bOVA na etapa 5.12 é muito pequena para detectar pela mancha ocidental, adicionar 10 µ m de MG132 ou 2 µM de lactacystin para inibir o processamento do bOVA ubiquitinated por proteasomes. - Parar a reação, colocando o microtubo na Ice.
- Resolver as microssomas adicionando buffer de TNE 500 µ l com volume de 1/1.000 de cocktails de inibidor de protease.
- o microtubo de centrifugação durante 10 minutos a 21,500 x g e 4 ° C. recolher os sobrenadantes para um microtubo novo para remover as frações insolúveis, que contêm ubiquitinated bOVA em DC2.4 antes do ensaio em vitro ubiquitination.
- Transferir o sobrenadante para um microtubo de novo e adicionar o volume de 1/100 de novas contas SA-magnético (geralmente 5 µ l para 500 µ l de sobrenadantes).
- Delicadamente, misture bem e girar o microtubo lentamente por 30 min a 4 ° C.
- Centrifugar o microtubo para 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. descartar o sobrenadante por aspiração para recuperar o bOVA e ubiquitinated bOVA vinculado com os grânulos SA-magnético.
- Lavar duas vezes os grânulos SA-magnética coletados com 1 mL de tampão TNE por centrifugação durante 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. descartar o sobrenadante de cada vez por aspiração.
- Ferver os grânulos SA-magnético em 1x do gel de SDS carregando buffer para min 5 a 95 ° C, em um bloco de calor para resolver as proteínas purified pelos grânulos magnético-SA.
- Centrifugar o microtubo para 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. recolher os sobrenadantes para um microtubo novo para remover as frações insolúveis.
- Analisar as contas SA-magnéticos ligadas às proteínas por padrão SD-PAGE e Western Bloting. O uso de anticorpos (anti-Flag, anti-multi-Ub e anti-mouse IgG HRP) e o reagente (SA-HRP) é pelo fabricante ' protocolo s e visualizado por fluorography.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para elucidar o mecanismo molecular da CP, é necessário identificar os compartimentos celulares, onde se submeter a antígenos exógenos ERAD, como transporte e processamento. Enquanto observações por microscopia de imunofluorescência ou microscopia eletrônica identificaram o compartimento celular onde antígenos exógenos acumularam16,17,18,19, 30,31,32,33, os compartimentos celulares para ERAD, como processamento de antígenos exógenos não estão claramente definidos. Recentemente foi demonstrado que não-clássica endossomos com moléculas residentes ER foram responsáveis por CP34, mas esses compartimentos celulares eram impuro. A dificuldade em isolar e purificar os compartimentos celulares pode ser atribuída ao fato de que antígenos exógenos são localizados no endossomo e ER-como compartimentos e que não há nenhuma molécula de identificação para esses compartimentos endocítica outros do que antígenos exógenos. No entanto, a condição de antígenos exógenos, passando por transporte ERAD-como é diferente de estado estacionário; o transporte através de membrana bimolecular de lipídios, antígenos exógenos penetram a membrana através de translocons, como Sec61 (Figura 2A). Assim, ao usar o bOVA como um antígeno exógeno, bOVA deve ser associado com Sec61. Desde que a membrana-associado bOVA especificamente vinculado com SA, o microsome preparado a partir de DC2.4, que era pré-tratados com bOVA, poderia ser isolado distintamente, grânulos SA-magnético (Figura 2A). Em seguida, quantidades equivalentes de proteínas de microssomas purificadas com ou sem pré-incubação de bOVA foram resolvidas por SDS-PAGE seguido de coloração prata e mancha ocidental com SA-HRP (Figura 2B, 2C). Como mostrado na Figura 2B e a Figura 2, as isolado microssomas continham várias proteínas únicas que foram purificadas dependente bOVA exogenamente adicionado e grânulos SA-magnético. Além destas proteínas exclusivas, isoladas microssomas também continham proteínas inespecíficas, que limite a grânulos SA-magnético, com ou sem bOVA. Tratamento do do microsome com tripsina antes de purificação pelo ímã impediu a purificação de microssomas (Figura 2D), indicando que os métodos de purificação dependia da presença de membrana-penetrante bOVA.
As microssomas purificadas mostraram a capacidade de ubiquitinate o bOVA incorporado em vitro, sob a presença de síndrome das pernas inquietas (Figura 3A). As quantidades de bOVA e poli-ubiquitinated bOVA foram aumentadas na presença de MG132 (Figura 3B), indicando que o bOVA incorporado foi processado pelo sistema ERAD e que nosso microssomas purificadas continham proteínas de maquinaria ERAD.
Figura 1: vias intracelulares para CP em DCs. Em DCs, antígenos exógenos são transportados em compartimentos endocítica não-clássica, que também contêm moléculas de ER-residente além de moléculas do clássico atrasado endosome. Neste compartimento, antígenos exógenos são exportados para o citosol através de translocons como Sec61. No citosol, antígenos exógenos são processados pelo sistema ubiquitina-Proteassoma em peptídeos antigênicos como substratos ERAD. Peptídeos antigênicos são transportados em compartimentos adjacentes ou mesmos não-clássica de endocítica, ou ER adjacente através de transportador de torneira e em seguida carregado no MHC moléculas de PLC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: purificação de Microsomes com bOVA passando por ERAD. (A), A modelo esquemático de purificação de microsomes com bOVA passando por ERAD. bOVA está associada à membrana através da Sec61 translocon e voltado com grânulos SA-magnético. Microssomas (B) com (+) ou sem (-) adição prévia de bOVA foram purificados com (+) ou sem grânulos SA-magnético (-). Proteínas (2 µ g) ou volumes correspondentes de proteínas purified foram resolvidos em 7,5-15% SDS-PAGE, e coloração prata foi usado para visualizar bandas de proteínas. Triângulos no lado direito indicam inespecífica vinculação aos talões SA-magnético. Triângulos com asteriscos indicam únicos encontrados apenas na presença de bOVA exogenamente adicionado e grânulos SA-magnético. A seta mostra bOVA. (C) microssomas com (+) ou sem (-) adição prévia de bOVA foram purificados com (+) ou sem grânulos SA-magnético (-). Proteínas (10 µ g) ou volumes correspondentes de proteínas purified foram resolvidos em 7,5-15% SDS-PAGE e submetidos a mancha com SA-HRP ocidental. Parque Nacional: fração pós-nuclear. Asteriscos na direita indicam faixas não específicas com SA-HRP. Resultados equivalentes foram alcançados pelo menos três ensaios independentes. Microssomas (D) com adição prévia de bOVA foram purificadas com grânulos SA-magnético. Microssomas foram tratadas com (+) ou sem (-) tripsina e TX-100 antes da purificação (duas faixas da esquerda) ou após a purificação (bem duas pistas). Proteínas (2 µ g) ou volumes correspondentes de proteínas purified foram resolvidos em 7,5-15% SDS-PAGE, e coloração prata foi usado para visualizar bandas de proteínas. Triângulos no lado direito indicam inespecífica vinculação aos talões SA-magnético. Triângulos com asteriscos indicam únicos encontrados apenas na presença de bOVA exogenamente adicionado e grânulos SA-magnético. Resultados equivalentes foram alcançados pelo menos três ensaios independentes. Reproduzido com permissão da referência28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: In Vitro reconstituição de processamento e Ubiquitination usando óvulos em microssomas purificado. Microssomas Purified do (A) com (+) ou sem (-) adição prévia de bOVA foram tratados com (+) ou sem (-) RL e bandeira-Ub por 1h e foram solubilizado usando TNE. bOVA foi purificado com grânulos SA-magnético e submetido a mancha com os anticorpos indicados ocidental. Asteriscos na direita indicam faixas não específicas com SA-HRP. Resultados equivalentes foram alcançados pelo menos três ensaios independentes. (B) microssomas Purified foram tratadas com (+) ou sem (-) RL, bandeira-Ub e MG132 por 1h e depois foram solubilizado usando TNE. bOVA foi purificado com grânulos SA-magnético e submetido a mancha ocidental com SA-bandeira. Asteriscos na direita indicam faixas não específicas com SA-HRP. Resultados equivalentes foram alcançados pelo menos três ensaios independentes. Reimpresso com permission de referência28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Em estudos anteriores de CP, os antígenos exógenos incorporados acumularam na área restrita do atrasado endosome ou ER por microscopia de imunofluorescência16,30,31,32. Estima-se que ERAD, como transporte e processamento de antígenos exógenos são realizados nestas áreas especializadas da ER ou endossomo atrasado, como o compartimento celular foi identificado pela sacarose ou iodixanol usando de centrifugação gradiente de densidade ubiquitinated bOVA como um marcador de processamento como ERAD. Depois de estimular sua imunidade inata, aumentou significativamente a eficiência do CP, e a fração de pico para bOVA juntamente com ubiquitinated bOVA migrou para uma fração de densidade mais elevada (nossos resultados não publicados). Os objectivos destes experimentos eram identificar marcadores moleculares específicos para o ER ou endossomo atrasado, que migraram junto com bOVA ou ubiquitinated bOVA. Mas os resultados, tanto moléculas residentes ER e atrasadas endosome-residente moléculas migraram juntamente com o bOVA e ubiquitinated bOVA, indicando que esses experimentos fracassaram em apurar o compartimento celular para transporte ERAD-como e processamento, como o clássico ER ou atrasado endosome. Nesses experimentos, não havia nenhuma molécula específica nos compartimentos endocytotic exceto bOVA ou ubiquitinated bOVA. No entanto, enquanto o antígeno exógeno foi submetido a ERAD, como transporte, estas moléculas penetraram a membrana de bicamada lipídica de ER através de translocons, como Sec61 complexo (Figura 1, Figura 2A). A membrana degola bOVA foi seleccionada como um marcador dos compartimentos endocítica e as microssomas foram purificadas por grânulos SA-magnético (Figura 2A, 2B). Nestes microssomas purificadas, bOVA acumulada deparou-se com como ERAD ubiquitination e transformação sob a presença de RL e ATP em vitro (Figura 3A, 3B). Desde que o RL contém todas citosólica apparati molecular, tais como moléculas relacionadas com ubiquitination e proteasomes além de moléculas para tradução e transcrição, a adição de RL permite ubiquitination de bOVA em purificado do microsome. Estes resultados indicam que microssomas purificadas foram os compartimentos celulares objetivos para ERAD, como transporte e processamento de antígenos exógenos, ambos contendo moléculas específicas do endossomo e moléculas ER-residente ao mesmo tempo; Lamp1 mostrou tanto precursor e formas maduras no purificado do microsome.
Este protocolo é dependente da quantidade de membrana-penetrante antígenos exógenos; é importante incorporar suficiente dos antígenos exógenos às células DC2.4, que mostra uma alta capacidade de incorporar antígenos exógenos no estado semi confluente. Alongar o tempo de incubação de 6-12 h para DC2.4 com bOVA aumenta a quantidade de bOVA incorporado. A adição de inibidores de proteasomes, MG132 ou lactacystin, moderadamente aumenta as quantidades de microssomas purificadas. A preparação do do microsome é um dos passos mais importantes para este protocolo. O bOVA livre, que não é incorporado em células DC2.4, deve ser removido lavando as células com PBS, para evitar inespecificas do bOVA gratuito para a fração do microsome. Para reduzir os danos em compartimentos de membrana, as células são cuidadosamente interrompidas pelo homogenizador homogenizacao em água gelada. Em seguida, núcleos e células ininterrupta foram removidos por centrifugação como as microssomas foram preparadas a partir da fração pós-nuclear. Após a preparação dos microsomes, purificação de uma etapa por grânulos SA-magnética é realizada. Nesta etapa, lavagem cuidadosa do ímã ligado do microsome é necessária remover a ligação não específica de outros compartimentos celulares e para não perder o limite especificamente do microsome.
Neste método de purificação de um passo, uma percentagem significativa do do microsome alvo é necessária. Se a relação entre o objetivo do microsome é muito pequena, a quantidade do microsome alvo purificada diminui por competição com inespecificas de outros compartimentos celulares. Por conseguinte, nessas condições, os avanços do do microsome alvo e apuramento do específico do microsome seria necessários. Também é possível introduzir etapas adicionais antes da purificação pelos grânulos SA-magnético. Um tal passo é a gradiente centrifugação densidade sacarose ou iodixanol do do microsome. Desde que o microssomas preparadas contêm todos os produtos de membrana, seria possível enriquecer antes da purificação de grânulos SA-magnético, do microsome o alvo, selecionando as frações ricas do antígeno para a purificação. Mais um passo possível é a liberação prévia do do microsome por grânulos controle magnético sem SA, para reduzir as associações de fundo específico de microsomes contra grânulos SA-magnético. Nesses experimentos, os pasos melhoraram a pureza do do microsome alvo eficazmente, mas diminuíram a quantidade total de produtos purificadas, indicando que estas etapas adicionais são selecionadas como meio de novas experiências.
É sabido que centrifugação de alta velocidade foi mostrada para causar a fusão ou coagulação das vesículas intracelulares. Estas fusões ou clottings produzirá microssomas artificiais, que são derivadas da interação entre diferentes tipos de vesículas organela-derivado específico. Estes microssomas artificiais estatisticamente contêm todas as moléculas da membrana como a molécula residente mitocondrial, molécula residente de Golgi, etc. Estes microssomas purificadas não incluiu o caveosome residente proteínas, proteínas residentes de Golgi ou cedo endossomo-residente proteínas, tais como caveolin1, GM130 e EEA1, indicando que o SA-purificado microssomas não são produtos artificiais derivado da fusão entre os diferentes tipos de vesículas. Sem a centrifugação de alta velocidade, vesículas bOVA-colagem foram isoladas, mas as experiências de controle de vesículas sem bOVA mostrou maior quantidade de moléculas não-específica. Isso indica que esse método preliminar é insuficiente para experiências sucessivas, e que a etapa de centrifugação de alta velocidade é necessária para este protocolo de purificação.
O presente protocolo aplica-se a outros tipos de células, tais como diferentes subconjuntos de DC, ou outras APCs. Também é possível usar os vários tipos de antígenos exógenos em diferentes condições, tais como proteínas fluorescentes, complexo antígeno-anticorpo, antígenos de grânulos ligados, etc. Além disso, nós podemos purificar microssomas de destino usando anticorpos específicos contra os antígenos exógenos. Embora várias etapas adicionais ou modificações podem ser necessário aplicar este protocolo para outras células e antígenos, ele pode elucidar os mecanismos moleculares da CP proteossomo dependente, comparando as moléculas purificadas entre diferentes experiências. Assim, o protocolo descrito tem espaço para modificação e melhoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Universidade de Takasaki da saúde e bem-estar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S.
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A.
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
