Summary
여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.
Abstract
수지상 세포 (Dc)는 고도의 처리 및 중요 한 조직 적합성 클래스 (MHC)에 따라 내 면된 외 인 항 원 제시의 나 분자 라고 크로스-프레 젠 테이 션 (CP). CP는 중요 한 역할 뿐만 아니라 순진한 CD8 자극+ T 세포와 CD8 메모리+ T 세포에 대 한 감염 및 self-acting의 비활성화에 뿐만 아니라 종양 면역 naïve T 세포 T 세포 아 또는 T 셀 삭제. CP의 중요 한 분자 메커니즘 해명 될 남아, 비록 축적 증거가 나타냅니다 exogenous 항 저하를 통해 떠다니고 그물 관련 (ERAD) 비 클래식에서 수출 후 endocytic 처리 됩니다. 구획입니다. 최근까지, 외 인 항 원 이외의 아무 특정 분자 마커 있었기 때문에 이러한 endocytic 구획의 characterizations을 제한 했다. 여기에 설명 된 메서드는 이러한 endocytic 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다. 이 순화 microsome 사용 하 여, 우리 재구성 ERAD 같은 전송, ubiquitination, 및 처리는 외 인 항 원에 체 외에, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 수출이 후 외 인 항 원 처리 제안 세포질 구획입니다. 이 프로토콜은 CP의 분자 메커니즘을 명확 하 게 다른 세포 유형에 더 적용할 수 있습니다.
Introduction
MHC I 분자 cytosol1에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 처리 되는 내 인 성 항에서 파생 하는 짧은 항 원 펩 티 드와 모든 nucleated 세포의 표면에 표현 된다. 처리 후, 항 원 펩 티 드 펩 티 드 운송업 자 탭에 의해 바인딩과 그물 (응급실) 루멘으로 이송 됩니다. ER의 루멘에서 일련의 특정 보호자 펩 티 드 로드 하 고 올바른 접는 MHC의 나 복잡 한 지원 합니다. 분자의이 시리즈는 펩 티 드 로드 복잡 한 (PLC), 응급실 펩 티 드 나2MHC에 적재에 대 한 중앙 구획을 나타내는 이라고 합니다. 후에 펩 티 드, 로드는 MHC I 분자 세포 표면에 수송 하 고 핵심적인 역할을 담당할 적응 면역 시스템에 자기 마커, 그리고 수는 CD8+ 세포 독성 T 세포 (Ctl) 암 세포 또는 전염 성 요원을 항 원에 의해 3비 각자 단백질 펩 티 드.
항 원 제시 세포 (APC), 외 인 항에서 항 원 펩 티 드에서는 또한 내가4,5,6,,78 통해 CP, 주로 수행 MHC 시 제시 의해 Dc9,,1011. CP는 필수+ T 순진한 CD8의 활성화를 위한 둘 다 세포와 CD8 메모리+ T 세포의 비활성화에 의해 안티 전염 성 및 안티-종양 Ctl12,13, 그리고 면역 관용의 유지 보수에 자기 행동 naïve T 세포14,15. 그러나 CP CP의 분자 기계 장치는 아직 자세히 설명 될 적합 한 면역 계통에 많은 중요 한 역할을 재생 합니다. CP의 이전 연구 밝혔다 exogenous 항 모두 응급실에는 endosome 현지 했다 ERAD, ERAD 같은 처리 및 펩 티 드16 로드에 대 한 응급실에 외 인 항 원은 endosome에서 이송은 제안 처리 . 그러나, 축적 증거가 나타냅니다 응급실에서 아닙니다 그러나 오히려 응급실 (그림 1)17,18의 독특한 기능을가지고 아닌 클래식 endocytic 구획 밖으로 CP의 펩 티 드 로드 수행 ,19,,2021. Aminopeptidase의 높은 활동에 의해 항 원 펩 티 드 선구자의 저하를 방지 하려면22 cytosol, 처리 및 CP에서 로드 하는 펩 티 드에이 아닌 클래식 endocytic 구획 (그림 1)의 인접 지역에서 발생 합니다. 이러한 endocytic 구획의 characterizations 논란이 있지만, 이외에 외 인 항 원이이 구획에 없는 기존 특정 분자 있다.
ERAD는 세포질 통로, 특히 응급실에서 misfolded 단백질을 제거 하는. ERAD 경로에 misfolded 단백질 retrogradely ER 막 세포질을 통해 운반 되며 유비퀴틴-프로테아좀 시스템23,,2425처리. 큰 분자, 단백질, 등 지질 bilayer를 통해 수송 된다,이 분자를 통과에 복잡 한 복잡 한 Sec61 및 Derlin ER26, 그리고 복잡 한 톰에 복잡 한 팀 같은 translocon 라는 분자 장치는 미토 콘 드리 아27 것 추가 항 ER 막 통해 수송 된다, 그들은 translocons, Sec61 복합 등으로 복잡 한 지질 bilayer를 관통 하 게 해야 합니다. 여기 설명 하는 방법을 endocytic 구획에 대 한 표식으로이 막 관통 분자를 이용 하 여 타겟된 기를 정화.
여기에 설명 된 방법은 외 인 항 원으로는 DC 같은 셀 선 DC2.428 와 biotinylated ovalbumin (bOVA)를 사용 하 여 새로운 기 정화 프로토콜입니다. Endocytic 구획 streptavidin (SA)에 의해 순화 되었다-자석 구슬 메이커로 막 관통 bOVA를 사용 하 여. 이 순화 microsome 일부 것 추가 bOVA 여전히 막 분수에 보존 되었다 하지만 microsome, 및 다음 ubiquitinated의 외부에 이송 되었고 처리29 생체 외에서. 이 순화 microsome endocytic 구획 특정 단백질 뿐만 아니라 ER-상주 단백질 ERAD 및 펩 티 드 복잡 한; 로드 포함 세포질 구획 CP29에 대 한 예비 endocytic 구획 제안. 이 프로토콜은 exogenous 항 원의 종류에 따라 그리고 다른 DC 하위 집합 및 다른 세포 유형, 대 식 세포, B 세포, 내 피 세포, 등 실력 CP에 대 한 Dc의 정확한 분자 메커니즘을 명확 하 게 적용 됩니다.
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Protocol
1. 성장 세포와 외 인 항 원 추가
biotin 단백질 라벨을 사용 하 여- 준비 bOVA 키트 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜.
참고: 일반적으로, bOVA 포함 2 M biotin 1 M OVA 당 평균. - 성장 DC2.4 셀 RPMI-1640 2mm L-글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산, 100 U/mL 페니실린-스, 55 m m 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5), 및 5에서 37 ° C에서 10% 태아 종 아리 혈 청 (여기서 부터는 RPMI)와 보충 습도 인큐베이터에서 % CO 2 (이 언급 없이 세포는 인 큐베이 팅이 조건에서). 그것은 또한 DMEM 10% 태아 종 아리 혈 청 RPMI 대신 NaHCO 3 (여기서 부터는 DMEM) 3.7 g/L 보충을 사용 하 여.
- 주 정화, 전에 분할 RPMI의 셀 사용 하 여 조직 문화 접시에 1 x 10 5 셀/ml. Confluent 상태에서 세포를 유지 하지 마십시오. DC2.4 셀 매우 반 confluent 상태로까지 외 인 항 원을 통합할 수 있지만 빠르게 오버 합칠 상태에 도달 후 능력을 잃고.
- DC2.4 전에 세포는 반 confluent 1 x 10 6 셀/ml bOVA의 250 µ g/mL을 추가 하 고 2-4 헤에 대 한 품 어
참고: 다운스트림 실험 동안 모든 버퍼 및 시 약 보관 4 ° C에서 달리 명시 하지 않는 한.
2. Microsomes의 준비
- 새 50 mL 원뿔 관으로 조직 접시에서 부드러운 pipetting으로 DC2.4 세포를 수확.
- 5 분, 4 ° C 1000 x g에서 원심 분리기와 포부에 의해 bOVA와 매체를 조심 스럽게 제거.
- DC2.4 셀 1000 x g 5 분, 4 ° C에서 원심 분리 하 여 PBS 버퍼 (1.37 m m NaCl, 8.1 m 나 2 HPO 4, 2.68 m KCl, 1.47 m m KH 2 포 4 m m)의 40 mL로 두 번 세척 하 고 상쾌한 포부에 의해 때마다 삭제.
- Resuspend 단계 2.3에서 1-2에서에서 펠 릿 mL (문화 매체의 1/20-1/10 볼륨) 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 전송 resuspended DC2.4의 1/1000 양으로 균질 매체 (0.25 M 자당, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4])의 세포에 얼음 처럼 차가운 Dounce 균질 화기.
- 차가운 Dounce 균질 화기와 10-20 스트로크에 의해 resuspended DC2.4 세포를 부드럽게 중단.
참고: 중단 단계 동안 Dounce 균질 화기는 냉각 얼음에 - 새 15 mL 원뿔 튜브 셀 중단 중지 전송.
- 10 ml 총 8-9 mL 균질 매체를 추가 하 고 원뿔 튜브 2000 g x 4에서 10 분 원심 ° c.
- 새 15 mL 원뿔 튜브 손상 되지 않은 세포와 핵, 제거 하는 상쾌한 전송 및 2000 g x 4에서 10 분 동안 다시 원뿔 튜브 원심 ° c.
- 새로운 ultracentrifugation 튜브와 g x 100000 및 4에서 45 분 동안 원심 분리기에는 상쾌한 전송 ° c.
- 는 상쾌한 발음 하 고 다운스트림 실험 microsome 분수를 만들기 위해 여러 번 위아래 솔루션 pipetting으로 펠 릿 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 양으로 균질 매체의 1-2 mL에 신중 하 게 resuspend.
- 새 5 mL 둥근 바닥 관으로 microsome 분수 전송.
참고:이 단계 후에 그것은 제조 업체에 따르면 iodixanol 밀도 그라데이션 원심 분리에 의해 객관적인 microsomes을 풍부 하 게 ' s 프로토콜, 일반적인 microsomes를 제거 하려면. 외 인 항 원에 대 한 피크 분수 및 수집한 다음 정화 (3 단계)의 다음 단계로 들어서는.
3. BOVA와 Microsomes의 정화를 받고 ERAD
microsome 분수의 단계 2.11 5 mL- 신선한의 추가 1/100 볼륨 SA 자석 구슬 원형 하단 튜브.
참고:이 단계를 하기 전에 그것은 미리 microsome 분수를 줄이기 위해 일반적인 microsomes의 오염 제어 자석 구슬에 의해 취소. - 부드럽게 잘 혼합 하 고 4 시 30 분 동안 천천히 라운드 하단 튜브를 회전 ° c.
- 라운드 하단 튜브에 총 4 mL에 균질 매체의 2-3 mL를 추가 하 고 부드럽게 잘 섞어.
- 라운드 하단 튜브 마그네틱 스탠드에 놓고 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 이후는 소포에 바인딩된 구슬 자석에 끌리는, 갈색 마이크로 구슬 점차적으로 자석에 가장 가까운 튜브 벽에 축적 됩니다.
- 튜브와 함께 신중 하 게 언바운드 소포를 제거 하는 열망에 의해 여 supernatants를 버리고 마그네틱 스탠드에 남아.
- 자석 구슬 자석에 의해 균질 매체의 5 mL로 두 번 소포에 바인딩된 워시 4 ° C에서 10 분 서 하 고 신중 하 게 열망 하 여는 상쾌한 때마다 삭제.
참고: 마그네틱 스탠드, 10 분, 2000 x g에서 centrifugations에 의해 정화 없이 4 ° C는 또한 사용할 수. - 자석 구슬 몇 번 위아래로 솔루션 pipetting 100 µ L 균질 매체에 신중 하 게 소포를 준수할 resuspend.
- 다운스트림 실험에 대 한 정화 microsome로 새로운 microtube에 resuspended 소포 전송.
참고: 일반적으로, 1 x 10 7 셀에서 5-20 µ g 단백질을 포함 하는 50 µ L microsome 분수 고립 될 수 있다.
4. 순화 Microsomes의 분석
- Resuspend 자석 구슬에서 소포에 바인딩된 TNE 버퍼의 100-200 µ L 3.8 단계 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 150 m m NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 볼륨 균질 매체 대신.
- 는 lysate에서 전송 단계 4.1 새로운 1.5 mL microtube.
- 제조 업체 당 BCA 분석 결과 키트를 사용 하 여 단계 4.2의 단백질 농도 결정 ' s 프로토콜.
참고: 일반적으로 5-10 µ L 단계 4.2에서에서 lysate 단백질 농도 결정 하기 위해 충분 하다. - 는 lysate에서 전송할 단계 (실버 얼룩에 대 한 단백질의 2 µ g 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 위한 단백질의 10 µ g) 4.2 새로운 microtubes.
- SDS 겔-로딩 버퍼 x 1에서 95 ° C와 종 단백질에서 열 블록에 있는 microtubes를 넣어 (100 mM Tris HCl pH 6.8, 200 m m dithiothreitol, 4 %SDS, 0.2 %bromophenol 블루, 20% 글리세롤) 5 분에 대 한
- 21500 g x 4에서 10 분 동안 microtubes 원심 ° C. 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtubes에 있는 supernatants 수집.
- 단계 4.6 (2 µ g) 표준 SD-페이지에서 해결된 단백질 분석.
- 시각화 실버 얼룩은 얼룩을 사용 하 여 단백질 밴드 키트 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜.
- 표준 SD-페이지와 서 부 럽 4.6 (10 µ g) 단계에서 확인 된 단백질 분석. 시 약 (SA-HRP)를 사용 하 여 제조 업체 당 ' s 프로토콜 및 fluorography에 의해 시각화.
5. 생체 외에서 BOVA 사용 하 여 정화 Microsomes의 ERAD Ubiquitination의 재구성
단계 3.8 reticulocyte lysate (RL)의 50% 볼륨으로 반응 버퍼 (50 mM Tris pH 7.4, 3mm ATP, 0.5 m m MgCl x 1에서에서- 이전에 순화 microsomes (5-10 µ g 단백질) 2), 그리고 새로운 microtube에 플래그 태그 유비퀴틴 오후 0 시 2 분. 이 실험의 최종 볼륨은 20-40 µ L.
- 품 37에서 2 h microtube ° C.
참고: 단계 5 월 12 일에서에서 ubiquitinated bOVA 양의 서쪽 blotting에 의해 감지 너무 작으면, 추가 10 µ M의 MG132 또는 proteasomes에 의해 ubiquitinated bOVA의 처리를 억제 하는 lactacystin의 2 µ M. - 얼음에 microtube 배치 하 여 반응을 중지
- 는 microsomes 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 양으로 500 µ L TNE 버퍼를 추가 하 여 해결.
- 21,50에서 10 분 원심 분리기는 microtubeg와 4 x는 0 ° c.에 생체 외에서 ubiquitination 분석 결과 전에 DC2.4에서 ubiquitinated bOVA 포함 하는 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtube는 supernatants 수집.
- 는 상쾌한 새로운 microtube 전송과 새로운 SA 자석 구슬 (일반적으로 5 µ L supernatants의 500 µ L에 대 한)의 1/100 볼륨 추가.
- 부드럽게 잘 혼합 하 고 30 분 동안 천천히 microtube 4 회전 ° c.
- Microtube 21500 g x 4에서 10 분 원심 ° C. 삭제 bOVA 및 ubiquitinated bOVA 열망 하 여 상쾌한 바운드 SA 자석 구슬.
- TNE 버퍼의 1 mL와 함께 두 번 수집된 사 자석 구슬 21500 g x 4에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 세척 ° C. 삭제 상쾌한 포부에 의해 각 시간.
- SA 자성 구슬에 의해 순화 된 단백질을 해결 하기 위해 열 블록에 95 ° C에서 5 분에 대 한 버퍼를 로드 하는 SDS 젤 x 1에 SA 자석 구슬 종.
- Microtube 21500 g x 4에서 10 분 원심 ° C에 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtube는 supernatants 수집.
- 분석 표준 SD-페이지 및 서쪽 더 럽 히는 단백질에 준수할 SA 자석 구슬. (안티, 안티-멀티-Ub, 깃발과 반대로 마우스 IgG HRP) 항 체 및 시 약 (SA-HRP)의 사용은 제조 업체 당 ' s 프로토콜 및 fluorography에 의해 시각.
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Representative Results
CP의 분자 메커니즘을 명료 하 게 그것은 exogenous 항 ERAD와 같은 전송 및 처리를 받아야 세포질 구획을 식별 하는 데 필요한. Immunofluorescent 현미경 또는 전자 현미경 관찰 어디 외 인 항 원16,,1718,19, 축적 된 세포질 구획을 확인 하는 동안 30,31,,3233, exogenous 항의 ERAD 같은 처리에 대 한 세포질 구획 명확 하 게 정의 되지 않습니다. 최근에 그것은 응급실 상주 분자와 비 고전 endosomes CP34에 대 한 책임 했다 하지만 이러한 세포 구획 정화 되지 않은 표시 했다. 분리 하 고 정화 세포 구획에 있는 어려움은 exogenous 항 endosome ER 같은 구획에서 지역화 되 고 이러한 endocytic 구획에 대 한 아무 식별 분자 다른 사실에 기 인할 수 있다 외 인 항 원 보다. 그러나, 외 인 항 원 ERAD 같은 전송 진행 상태는 다른 정상 상태; 지질 분자 막에 걸쳐 전송에서 외 인 항 원 침투 translocons, Sec61 등을 통해 멤브레인 (그림 2A). 따라서, bOVA 외 인 항 원으로를 사용할 경우 bOVA Sec61와 연결 해야 합니다. 멤브레인 관련 bOVA 특히 SA와 구속, 이후는 되었다 청소용 bOVA와, DC2.4에서 준비 microsome SA 자석 구슬 (그림 2A)에 의해 개성 고립 될 수 있습니다. 다음 순화 microsomes bOVA의 사전 외피의 유무에 관계 없이에서 단백질의 상응 하는 금액 했다 SDS 페이지 실버 얼룩 및 SA-HRP (그림 2B, 2c)와 서 부 럽에 의해 해결 되었습니다. 그림 2B 와 2C 그림에서와 같이, 고립 된 microsomes 것 추가 bOVA 및 SA 자석 구슬 의존 순화 했다 몇 가지 독특한 단백질을 포함. 이러한 독특한 단백질 뿐만 아니라 고립 된 microsomes는 또한 bOVA 없이 SA 자성 구슬에 바인딩된 일반적인 단백질을 포함 합니다. 트립 신 정화는 자석에 의해 방해를 나타내는 microsomes (그림 2D)의 정화 정화 방법 전에 함께 microsome의 치료 bOVA 막 관통의 존재에 의존 합니다.
순화 microsomes ubiquitinate 수는 통합된 bOVA에서 보여주었다 생체 외에서증후군 (그림 3A)의 존재에서. MG132 존재 bOVA 및 폴 리 ubiquitinated bOVA의 양을 증강 했다 (그림 3B), 법인된 bOVA ERAD 시스템에 의해 처리 된 고 우리의 정화 microsomes ERAD 기계 단백질을 포함.
그림 1: Dc에서 CP에 대 한 세포내 경로. Dc, 외 인 항 원 비 고전 endocytic 구획, 또한 고전 늦은 endosome의 분자 뿐만 아니라 응급실 상주 분자를 포함 하는으로 이송 됩니다. 이 구획에 외 인 항 원 translocons Sec61 등을 통해 cytosol로 내보내집니다. cytosol에서 외 인 항 원 ERAD 기판으로 항 원 펩 티 드에 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 처리 됩니다. 항 원 펩 티 드 같은 또는 인접 한 비 고전 endocytic 구획, 또는 탭 전송기를 통해 인접 한 응급실에 이송 하 고에 로드는 MHC 나 PLC에 의해 분자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: bOVA와 Microsomes의 정화를 받고 ERAD. (A) A bOVA 겪고 ERAD와 microsomes의 정화의 도식 모델. bOVA는 Sec61 translocon 통해 막과 연결 되어 있으며 사 자석 구슬 대상. (+)와 (B) Microsomes 또는 (-) 없이 bOVA의 사전 추가 (+) 순화 했다 또는 (-) 사 자석 구슬 없이. 단백질 (2 µ g) 또는 순화 된 단백질의 해당 볼륨 7.5-15 %SDS-페이지에서 해결 하 고 단백질 밴드를 시각화 하는 데 사용 했다은 얼룩. 오른쪽에 삼각형 SA 자성 구슬에 바인딩 일반적인 단백질을 나타냅니다. 별표와 삼각형 독특한 단백질 발견 것 추가 bOVA 및 SA 자석 구슬의 존재만 나타냅니다. 화살표 bOVA 보여줍니다. (+)와 (C) Microsomes 또는 (-) 없이 bOVA의 사전 추가 (+) 순화 했다 또는 (-) 사 자석 구슬 없이. 단백질 (10 µ g) 또는 순화 된 단백질의 해당 볼륨 7.5-15 %SDS-페이지에서 해결 되었고 SA HRP와 더럽혀 서 대상이. P.N.: 포스트 핵 분수입니다. 오른쪽에 별표 SA HRP와 일반적인 밴드를 나타냅니다. 해당 결과 적어도 3 개의 독립적인 분석 실험에 의해 달성 되었다. BOVA의 사전 추가 (D) Microsomes SA 자석 구슬을 가진 정화 했다. Microsomes (+)로 치료 했다 또는 정화 (오른쪽 2 차선) 후 (-) trypsin TX-100 (왼쪽 2 차선) 정화 하기 전에 또는 없이. 단백질 (2 µ g) 또는 순화 된 단백질의 해당 볼륨 7.5-15 %SDS-페이지에서 해결 하 고 단백질 밴드를 시각화 하는 데 사용 했다은 얼룩. 오른쪽에 삼각형 SA 자성 구슬에 바인딩 일반적인 단백질을 나타냅니다. 별표와 삼각형 독특한 단백질 발견 것 추가 bOVA 및 SA 자석 구슬의 존재만 나타냅니다. 해당 결과 적어도 3 개의 독립적인 분석 실험에 의해 달성 되었다. 참조28에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 체 외에서 재구성의 처리 및 정화 Microsomes에 OVA를 사용 하 여 Ubiquitination. 죄를 (A) microsomes (+) 또는 (-) 없이 bOVA의 사전 추가 (+)로 치료 했다 또는 (-) 없이 RL 및 1 시간에 대 한 플래그 Ub TNE를 사용 하 여 solubilized 했다 하 고. bOVA SA 자석 구슬을 가진 정화 되었고 대상이 표시 된 항 체와 더럽혀 서. 오른쪽에 별표 SA HRP와 일반적인 밴드를 나타냅니다. 해당 결과 적어도 3 개의 독립적인 분석 실험에 의해 달성 되었다. (B) 정화 microsomes (+)로 치료 했다 또는 (-) 없이 RL, 플래그-Ub, 및 MG132 1 시간에 대 한 다음 사용 TNE solubilized 했다 고. bOVA SA 자석 구슬을 가진 정화 되었고 SA 플래그로 서 부 럽을 복종. 오른쪽에 별표 SA HRP와 일반적인 밴드를 나타냅니다. 해당 결과 적어도 3 개의 독립적인 분석 실험에 의해 달성 되었다. Permissio로 증 쇄참조28에서 n입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
CP의 이전 연구에서 통합된 외 인 항 원 immunofluorescent 현미경 검사 법16,30,,3132에 의해 늦은 endosome 또는 응급실의 제한 된 영역에서 축적 된. 세포질 구획은 자당 또는 iodixanol 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 식별 되는 ERAD와 같은 전송 및 외 인 항 원 처리 수행 됩니다 응급실 또는 늦은 endosome의 이러한 전문된 분야에서 추정 된다 ubiquitinated는 ERAD 같은 처리 마커로 bOVA. 그들의 타고 난 면역 자극 후 CP 효율은 크게 증가, 그리고 높은 밀도 분수 (게시 되지 않은 결과) ubiquitinated bOVA 함께 bOVA의 피크 분수 마이그레이션. 이러한 실험의 목표 응급실 또는 bOVA 또는 ubiquitinated bOVA 마이그레이션 늦은 endosome 특정 분자 마커를 확인 했다. 하지만 결과에서 응급실 상주 분자와 늦은 endosome 상주 분자 bOVA 및 ubiquitinated bOVA, 이러한 실험 ERAD와 같은 전송에 대 한 세포질 구획 확인에 성공 하지 못했습니다 나타내는 마이그레이션 그리고 클래식 응급실 또는 늦은 endosome 처리. 이 실험에서 bOVA 또는 ubiquitinated bOVA 제외 하 고 endocytotic 구획에 없는 특정 분자 있었습니다. 그러나, 외 인 항 원 ERAD 같은 전송 받았다, 그러나이 분자 translocons, 복잡 한 Sec61 같은 (그림 1, 그림 2A)를 통해 ER의 지질 bilayer 막 관통. 막 튀어나와 bOVA endocytic 구획의 표식으로 선정 되었습니다 그리고는 microsomes SA 자석 구슬 (그림 2A, 2B)에 의해 순화 되었다. 이 정화 microsomes 누적된 bOVA ERAD 같은 ubiquitination 및 RL 및 ATP에서 생체 외에서 (그림 3A, 3B)의 존재에서 처리 했다. RL 포함 되어 있는 ubiquitination 관련 분자 등 번역 및 녹음, 분자 이외에 proteasomes 모든 cytosolic 분자 apparati RL의 추가 순화 microsome에 bOVA의 ubiquitination 수 있습니다. 이 결과 나타냅니다 순화 microsomes 객관적인 세포질 구획 했다 ERAD와 같은 전송 및 외 인 항 원, 모두 포함 된 endosome 특정 분자 및 응급실 상주 분자 같은 시간; Lamp1 정화 microsome에서 선구자와 성숙한 형태를 보였다.
이 프로토콜은 막 관통 exogenous 항;의 양을 따라 달라 집니다. 그것은 충분히 반 confluent 상태로 exogenous 항을 통합 하는 높은 능력을 보여 주는 DC2.4 세포, 외 인 항 원 통합 하는 것이 중요. BOVA와 DC2.4에 대 한 6-12 h 배양 시간을 elongating 법인된 bOVA의 양을 증가 시킵니다. Proteasomes, MG132 또는 lactacystin, 억제제의 추가 적당히 순화 microsomes의 양을 증가 합니다. microsome의 준비는이 프로토콜에 대 한 가장 중요 한 단계 중 하나 이다. DC2.4 셀에 통합 되어, 무료 bOVA microsome 분수 무료 bOVA의 비 특정 바인딩 방지 하기 위해 PBS로 세포 세척 하 여 제거 한다. 막 구획에 따라 손해를 줄이기 위해, 세포는 신중 하 게 얼음 물에 Dounce 균질 화기에 의해 중단 됩니다. 다음은 microsomes 포스트 핵 분수에서 준비 했다 손상 되지 않은 세포와 핵 원심 분리에 의해 제거 되었다. 준비 후에 microsomes의, 단계 정화 SA 자성 구슬에 의해 수행 됩니다. 이 단계에서는 바인딩된 자석 microsome의 주의 세척은 다른 세포질 구획의 일반적인 바인딩을 제거 하 고 특히 바인딩된 microsome 잃지 필요 합니다.
이 한 단계 정화 방법에서 대상 microsome의 뜻깊은 백분율은 필요 합니다. 객관적인 microsome의 비율이 너무 작은 경우에, 다른 세포질 구획의 일반적인 바인딩 순화 대상 microsome의 금액은 경쟁에 의해 감소. 따라서, 그 조건 하에서 대상 microsome의 풍부 하 고 일반적인 microsome의 정리 것입니다 필요. 그것은 또한 SA 자성 구슬에 의해 정화 하기 전에 추가 단계를 소개 하입니다. 이러한 1 단계는 자당 또는 iodixanol 밀도 그라데이션 원심 분리는 microsome의입니다. 이후 준비 microsomes 모든 막 제품을 포함, 정화에 대 한 항 원 풍부한 분수를 선택 하 여 SA 자석 구슬 정화 하기 전에 대상 microsome 풍요롭게 수 수 있습니다. 또 다른 가능한 단계는 SA, SA 자성 구슬에 대 한 microsomes의 일반적인 배경 연결을 줄이기 위해 없이 제어 자성 구슬에 의해 microsome의 사전 허가 이다. 이 실험에서 두 단계 효과적으로, 대상 microsome의 순도 향상 다만 이러한 추가 단계가 추가 실험의 수단으로 선택 되어 나타내는 정제 제품의 총 금액.
그것은 잘 그 고속 원심 분리 융해 또는 응고 세포내 소포의 원인 표시 되었습니다 알려져 있습니다. 이 융해 또는 clottings 세포 기관이 파생 vesicles의 다른 종류 사이 일반적인 상호 작용에서 파생 되는 인공 microsomes를 생산할 예정 이다. 이러한 인공 microsomes는 통계적으로 미토 콘 드 리아 주민 분자, Golgi 기구 거주 분자, 등모든 막 분자를 포함 되어 있습니다. 이 정화 microsomes caveosome 주민 단백질, Golgi 기구 상주 단백질, 또는 초기 endosome 상주 단백질, caveolin1, GM130, EEA1, 같은 SA 정화 microsomes 인공 제품 않습니다 나타내는 포함 되지 않았다 소포의 다른 종류 사이에서 융해에서 파생. 고속 원심 분리 하지 않고 bOVA 튀어나와 소포 고립, 되었다 하지만 bOVA 없이 소포에서 제어 실험 일반적인 분자의 높은 양의. 이이 예비 방법은 연속 실험에 대 한 충분 하지 않습니다 고속 원심 분리 단계는이 정화 프로토콜에 필요한 것을 나타냅니다.
이 프로토콜은 다른 세포 유형, 예: 다른 DC 하위 집합, 또는 다른 APCs에 적용 됩니다. 그것은 또한 형광 단백질, 항 원-항 체 복합물, 구슬 바인딩된 항, 등등과 같은 서로 다른 조건에서 외 인 항 원의 다양 한 종류를 사용 하 여. 또한, 우리는 외 인 항 원에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 대상 microsomes 정화 수 있습니다. 몇 가지 단계를 추가 또는 수정 하려면 필요할 수 다른 세포와 항 원에이 프로토콜을 적용, 비록 프로테아좀 종속 CP의 분자 메커니즘을 명료 하 게 다른 실험 사이에서 순화 된 분자를 비교 하 여 수 있습니다. 따라서, 설명된 프로토콜 수정 및 개선을 위한 방이 있다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 다카사키 대학 건강과 복지에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
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