Summary
De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel isolatie-protocol, waarmee voor de zuivering van de cellulaire compartimenten waarin exogene antigenen worden verwerkt door endoplasmatisch reticulum-geassocieerde afbraak in cross-presentatie.
Abstract
Dendritische cellen (DC's) zijn zeer geschikt voor het verwerken en presenteren van verinnerlijkte exogene antigenen op grote comptabiliteit klasse (MHC) ik moleculen ook bekend als cross-presentatie (CP). CP speelt een belangrijke rol niet alleen in het stimuleren van de naïeve CD8+ T cellen en geheugen CD8+ T cellen voor besmettelijke en tumor immuniteit maar ook in de inactivering van self-acting naïef T cellen door T cel anergie of verwijdering van de T cel. Hoewel de kritische moleculair mechanisme van CP moet nog worden opgehelderd, accumuleren gegevens wijzen erop dat exogene antigenen worden verwerkt door endoplasmatisch reticulum-geassocieerde afbraak (ERAD) na uitvoer van niet-klassieke endocytotische compartimenten. Tot voor kort waren karakterisaties voor deze endocytotische compartimenten beperkt omdat er geen specifieke moleculaire markers dan exogene antigenen. De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel isolatie-protocol, waarmee voor de zuivering van deze endocytotische compartimenten. Met behulp van deze gezuiverde microsome, we gereconstitueerd de ERAD-achtige vervoer ubiquitination en de verwerking van de exogene antigeen in vitro, suggereren dat het systeem van de ubiquitin-proteasoom de exogene antigeen na uitvoer uit dit verwerkt cellulaire compartiment. Dit protocol kan verder worden toegepast op andere celtypes te verduidelijken van het moleculaire mechanisme van CP.
Introduction
De MHC ik moleculen worden uitgedrukt op het oppervlak van alle genucleëerde cellen, met korte antigene peptiden afgeleid van endogene antigenen, die worden verwerkt door het systeem van de ubiquitin-proteasoom in het cytosol1. Na verwerking, worden antigene peptides vervoerd in het lumen van het endoplasmatisch reticulum (ER) door de peptide vervoerder TAP. In de ER lumen, een aantal specifieke chaperones helpen het peptide laden en de juiste vouwen van de MHC ik complexe. Deze serie van moleculen heet het peptide-laden complex (PLC), waarmee wordt aangegeven dat ER een centrale compartiment voor peptide laden op MHC ik2. Na peptide laden, het MHC ik moleculen naar het celoppervlak worden vervoerd en een sleutelrol spelen in het adaptieve immuunsysteem als zelfstandige markeringen, en stelt de CD8+ cytotoxische T-lymfocyten (CTL's) kankercellen of infectieuze agentia op te sporen door antigene peptiden van niet-zelf eiwitten3.
Antigeen presentatie van cellen (APC), antigene peptiden van exogene antigenen ook in zijn gepresenteerd op MHC ik4,5,6,7,8 via CP, die voornamelijk wordt uitgevoerd door DCs9,10,11. CP is essentieel zowel voor de activering van naïeve CD8+ T cellen en geheugen CD8+ T cellen in anti-infectieuze en anti-tumoral CTL's12,13, en in het onderhoud van immuun tolerantie door het inactiveren van zelf waarnemend naïef T cellen14,15. De CP speelt veel belangrijke rollen in het adaptieve immuunsysteem, maar de moleculaire mechanismen van CP nog moeten in detail worden beschreven. Eerdere studies van CP bleek dat exogene antigenen waren gelokaliseerd, zowel in de ER en de endosome en werden verwerkt door ERAD, suggereren dat exogene antigenen van de endosome worden vervoerd naar de ER voor ERAD-achtige verwerking en peptide laden16 . Accumuleren bewijsmateriaal blijkt evenwel dat het laden van de peptide van CP wordt uitgevoerd niet in het ER maar in niet-klassieke endocytotische compartimenten, die ook kenmerken van de ER (Figuur 1)17,18 hebben ,19,20,21. Voorkom aantasting van de voorlopers van de antigene peptide door de hoge activiteit van aminopeptidase22 in het cytosol, de verwerking en de peptide laden in CP treedt op in het proximale gebied voor deze niet-klassieke endocytotische compartimenten (Figuur 1). Hoewel de karakteristieken van deze endocytotische compartimenten controversieel zijn, zijn er geen bestaande specifieke moleculen dan exogene antigenen in dit compartiment.
ERAD is een cellulaire traject, waarbij specifiek misfolded eiwitten uit de ER wordt verwijderd. In het traject ERAD zijn misfolded eiwitten retrogradely via het membraan ER naar het cytoplasma getransporteerd en verwerkt door de ubiquitin-proteasoom systeem23,24,25. Wanneer grote moleculen, zoals eiwitten, worden vervoerd via de lipide dubbelgelaagde, deze moleculen passeren aan een moleculaire apparaat genaamd een translocon, zoals het Sec61 complex, Derlin complex in de ER26, en de complexe Tom en Tim complex in de mitochondriën27. Wanneer exogenously toegevoegde antigenen via het ER membraan worden getransporteerd, moeten zij de lipide dubbelgelaagde in complex met translocons, zoals het Sec61-complex doordringen. De hier beschreven methode gezuiverd de gerichte blaasje door gebruik te maken van deze membraan-penetrating moleculen als markers voor de endocytotische compartimenten.
De hier beschreven methode is een nieuwe vesikel zuivering protocol met behulp van de DC-achtige cel lijn DC2.428 en biotinyleerd ovoalbumine (bOVA) als een exogene antigeen. De endocytotische compartimenten werden gezuiverd door daar (SA)-magnetische kralen met behulp van de membraan-penetrating bOVA als een maker. In deze gezuiverde microsome, enkele exogenously toegevoegd bOVA was nog steeds bewaard in het membraan breuken maar werden vervoerd naar de buitenkant van de microsome, en dan ubiquitinated en verwerkt in vitro29. Deze gezuiverde microsome gegevens opgenomen, niet alleen de endocytotische compartiment-specifieke eiwitten, maar ook ER-ingezeten eiwitten voor ERAD en de peptide laden complex; suggereert dat het cellulaire compartiment het potentiële endocytotische compartiment voor CP29 is. Dit protocol is niet afhankelijk van het soort exogene antigenen, en geldt ook voor andere deelverzamelingen van DC en andere celtypen, zoals macrofagen, B-cellen en endotheliale cellen, ter verduidelijking van de precieze moleculair mechanisme van DCs voor bedreven CP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. groeiende cellen en toevoeging van exogene antigenen
- voorbereiden bOVA met behulp van een Biotine-eiwit labeling kit na de fabrikant ' s-protocol.
Opmerking: Normaal, bOVA bevat 2 M Biotine per 1 M eicellen gemiddeld. - Groeien DC2.4 cellen in RPMI-1640 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvaat 0.1 mM niet-essentiële aminozuren, 100 U/mL penicilline-streptomycine, 55 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) en 10% foetaal kalfsserum (hierna RPMI) bij 37 ° C in 5 % CO, 2 in een bevochtigde incubator (hierna zonder vermelding, cellen worden geïncubeerd op deze voorwaarde). Het is ook mogelijk om te gebruiken DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 3,7 g/L NaHCO 3 (hierna DMEM) in plaats van RPMI.
- Een dag voordat de zuivering, wordt de cellen splitsen in RPMI tot 1 x 10 5 cellen/mL in een weefselkweek plaat. Vermijd de cellen bij een confluente staat te houden. DC2.4 cellen kunnen zeer exogene antigenen te nemen tot een semi-confluente staat, maar snel de mogelijkheid kunt verliezen na het bereiken van een overmatige heuvels staat.
- Voor de DC2.4 cellen zijn semi-confluente, voeg toe 250 µg/mL bOVA voor 1 x 10 6 cellen/mL en incubeer gedurende 2-4 h.
Opmerking: Tijdens de stroomafwaartse experimenten, alle buffers en reagentia worden bewaard bij 4 ° C tenzij anders aangegeven.
2. Voorbereiding van Microsomes
- de DC2.4 cellen te oogsten door zachte pipetteren van de plaat weefsel in een nieuwe conische tube van 50 mL.
- Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min, 4 ° C en verwijder voorzichtig het medium met bOVA door aspiratie.
- De DC2.4 cellen tweemaal met 40 mL PBS buffer (1.37 mM NaCl, 8.1 mM nb 2 HPO 4, 2.68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) door middel van centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min, 4 ° C wassen en verwijder het supernatant telkens door aspiratie.
- Resuspendeer de pellet in stap 2.3 in 1-2 mL (1/20-1/10 deel van kweekmedium) van homogenisering medium (0,25 M sacharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) met 1/1000 volume van protease inhibitor cocktails en overdracht van de geresuspendeerde DC2.4 cellen in een ijskoude Dounce homogenizer.
- Verstoren de geresuspendeerde DC2.4 cellen zachtjes door 10-20 slagen met de ijskoude Dounce-homogenizer.
Opmerking: Tijdens de verstoring van de stap, de Dounce homogenizer wordt gekoeld op ice. - De cel-verstoord schorsing overbrengen in een nieuwe conische tube van 15 mL.
- 8-9 mL homogenisering middellange tot 10 mL totaal toevoegen en centrifugeer de conische buis voor 10 min op 2.000 x g- en 4 ° C.
- Het supernatant overbrengen naar een nieuwe 15 mL conische buis ongebroken cellen en kernen te verwijderen, en centrifugeer de conische buis opnieuw gedurende 10 minuten op 2.000 x g en 4 ° C.
- Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe ultracentrifugatie buis en centrifuge voor 45 min op 100.000 x g- en 4 ° C.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet zorgvuldig in 1-2 mL van homogenisering medium met 1/1000 volume protease inhibitor cocktails door de oplossing op en neer meerdere malen te maken van een microsome breuk voor downstream experimenten pipetteren.
- De microsome-fractie overbrengen naar een nieuwe 5-mL ronde onderkant buis.
Opmerking: Na deze stap, is het mogelijk om te verrijken van objectieve microsomes door iodixanol dichtheid kleurovergang centrifugeren volgens de fabrikant ' s protocol, bij het verwijderen van niet-specifieke microsomes. De piek breuken voor exogene antigenen worden verzameld en vervolgens onderworpen aan de volgende stap van zuivering (stap 3).
3. Zuivering van Microsomes met bOVA ondergaan ERAD
- toevoegen 1/100 volume van vers SA-magnetische kralen de microsome Fractie van stap 2.11 in de 5 mL ronde onderkant buis.
Opmerking: Voordat u deze stap, is het mogelijk om vooraf duidelijk de microsome fractie door controle-magnetische kralen om vormen van verontreiniging van niet-specifieke microsomes. - Voorzichtig meng goed en de ronde onderkant-buis langzaam gedurende 30 minuten draaien bij 4 ° C.
- 2-3 mL van homogenisering medium tot 4 mL totaal toevoegen in de ronde onderkant-buis en meng voorzichtig goed.
- De ronde onderkant-buis te plaatsen op een magnetische standaard en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C. Aangezien de kralen gebonden aan de blaasjes worden aangetrokken door de magneet, bruin micro-beads geleidelijk zal accumuleren naar de dichtst bij de magneet buiswand.
- Met de buis in de magnetische stand blijft zorgvuldig negeren het supernatant door aspiratie te verwijderen de niet-afhankelijke blaasjes.
- Wassen de magnetische kralen aan de blaasjes tweemaal met 5 mL van homogenisering medium door de magnetische gebonden staan gedurende 10 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant telkens door zorgvuldig aspiratie.
Opmerking: Zonder de magnetische standaard, zuivering door centrifugations bij 2.000 x g gedurende 10 min, 4 ° C is ook beschikbaar. - Resuspendeer de magnetische kralen gebonden aan de blaasjes zorgvuldig in 100 µL homogenisering medium de oplossing op en neer meermaals pipetteren.
- Breng de geresuspendeerde blaasjes in een nieuwe microtube als de gezuiverde microsome voor downstream experimenten.
Opmerking: Doorgaans 50 µL microsome breuk met 5-20 µg eiwitten uit 1 x 10 7 cellen kan worden geïsoleerd.
4. Analyse van het gezuiverd Microsomes
- resuspendeer de magnetische kralen gebonden aan de blaasjes uit stap 3.8 voor 100-200 µL van TNE buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) met 1/1000 volume protease inhibitor cocktails in plaats van het medium homogenisering.
- Van stap 4.1 de lysate overbrengen naar een nieuwe 1.5-mL microtube.
- Bepalen de eiwitconcentratie van stap 4.2 met behulp van een BCA assay kit per de fabrikant ' s-protocol.
Opmerking: 5-10 µL lysate uit stap 4.2 is meestal genoeg om het bepalen van de eiwitconcentratie. - Van stap 4.2 (2 µg van eiwitten voor de zilveren kleuring en 10 µg van eiwitten voor het westelijke bevlekken) de lysate overboeken naar nieuwe slangen.
- Zet de slangen op een blok van de warmte op 95 ° C en kook eiwitten in 1 x SDS gel-laden buffer (100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM dithiothreitol, 4% SDS, 0,2% bromophenol blauw, 20% glycerol) voor 5 min.
- Centrifugeren van de slangen voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. het supernatant in nieuwe slangen te verwijderen van de onoplosbare breuken verzamelen.
- Analyseren de opgelost eiwitten in stap 4.6 (2 µg) door SD-standaardpagina.
- Visualiseren de bands eiwit door de silver kleuring met behulp van zilveren kleuring na de fabrikant Kit ' s-protocol.
- Analyseren de opgelost eiwitten in stap 4.6 (10 µg) door de standaard SD-pagina's en westelijke bevlekken. Gebruik het reagens (SA-HRP) per de fabrikant ' s protocol en visualiseren door fluorography.
5. In Vitro Reconstructie van ERAD Ubiquitination van bOVA met behulp van gezuiverd Microsomes
- overdracht de gezuiverde microsomes (5-10 µg van eiwitten) uit stap 3.8 met een 50% volume van Retikulocyt lysate (RL), in 1 x reactie buffer (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM, ATP, 0.5 mM MgCl 2), en 0 uur twee vlag-gelabeld ubiquitin in een nieuwe microtube. Het uiteindelijke volume van dit experiment is 20-40 µL.
- Incubate de microtube gedurende 2 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Als de hoeveelheid ubiquitinated bOVA in stap 5.12 te klein om op te sporen is door het westelijke bevlekken, 10 µM van MG132 of toevoegen 2 µM van lactacystin voor de remming van de verwerking van de ubiquitinated-bOVA door Proteasomen. - Stop de reactie door het plaatsen van de microtube op ice.
- Het microsomes oplossen door toevoeging van 500 µL TNE buffer met 1/1000 volume protease inhibitor cocktails.
- De microtube centrifuge voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. het supernatant in een nieuwe microtube te verwijderen van de onoplosbare fracties, waarin ubiquitinated bOVA in DC2.4 voordat de ubiquitination in vitro assay verzamelen.
- Het supernatant overbrengen in een nieuwe microtube en voeg 1/100 volume van nieuwe SA-magnetische kralen (meestal 5 µL voor 500 µL van supernatant).
- Voorzichtig meng goed en draaien de microtube langzaam gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Centrifugeren van de microtube voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. Discard het supernatant door aspiratie om te herstellen van de bOVA en ubiquitinated bOVA gebonden met de SA-magnetische kralen.
- Wassen van tweemaal de verzamelde SA-magnetische kralen met 1 mL TNE buffer door centrifugeren voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. Discard het supernatant telkens door aspiratie.
- Kook de SA-magnetische kralen in 1 x SDS gel laden van de buffer voor 5 min bij 95 ° C op een warmte-blok op te lossen de gezuiverde eiwitten door de SA-magnetische kralen.
- Centrifugeren van de microtube voor 10 min op 21,500 x g- en 4 ° C. het supernatant in een nieuwe microtube te verwijderen van de onoplosbare breuken verzamelen.
- Analyseren de SA-magnetische kralen gebonden aan de eiwitten door standaard SD-pagina en het westelijke bevlekken. Het gebruik van antilichamen (Anti-Flag, anti-multi-Ub en anti-muis IgG-HRP) en het reagens (SA-HRP) is per de fabrikant ' s-protocol en gevisualiseerd door fluorography.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te verhelderen van het moleculaire mechanisme van CP, is het nodig vast te stellen van de cellulaire compartimenten, waar exogene antigenen ondergaan ERAD-achtige vervoer en verwerking. Terwijl waarnemingen door immunefluorescentie microscopie of door elektronenmicroscopie geïdentificeerd de cellulaire compartiment waar exogene antigenen16,17,18,19geaccumuleerde, 30,31,32,33, de cellulaire compartimenten voor ERAD-achtige verwerking van exogene antigenen niet duidelijk zijn gedefinieerd. Onlangs werd aangetoond dat niet-klassieke Endosomen met ER ingezeten moleculen verantwoordelijk voor CP34 waren, maar deze cellulaire compartimenten ongezuiverde waren. De moeilijkheid in het isoleren en zuiveren van de cellulaire compartimenten kan worden toegeschreven aan het feit dat exogene antigenen zijn gelokaliseerd, zowel in de endosome en de ER-achtige compartimenten en dat er geen identificerende molecuul voor deze endocytotische compartimenten andere dan exogene antigenen. De voorwaarde van exogene antigenen ondergaan ERAD-achtige vervoer is echter anders dan de steady-state; in het vervoer over lipide bimolecular membraan, exogene antigenen doordringen het membraan via translocons, zoals Sec61 (figuur 2A). Dus, wanneer u bOVA als een exogene antigeen, bOVA moet gepaard gaan met Sec61. Membraan-geassocieerde bOVA specifiek gebonden met SA, kon de microsome bereid uit DC2.4, die was voorbehandeld met bOVA, kentekens worden geïsoleerd door SA-magnetische kralen (figuur 2A). Dan werden gelijkwaardige hoeveelheid eiwitten uit gezuiverde microsomes met of zonder pre-incubatie van bOVA opgelost door SDS-pagina gevolgd door zilveren kleuring en het westelijke bevlekken met SA-HRP (figuur 2B, 2 C). Zoals blijkt uit figuur 2B en figuur 2C, bevatte de geïsoleerde microsomes verschillende unieke eiwitten die werden gezuiverd afhankelijk van exogenously toegevoegde bOVA en SA-magnetische kralen. Naast deze unieke proteïnen bevatten geïsoleerde microsomes ook niet-specifieke proteïnen, die aan SA-magnetische kralen met of zonder bOVA gebonden. Behandeling van de microsome met trypsine voordat zuivering door de magneet de zuivering van microsomes (figuur 2D) voorkomen, waaruit blijkt dat de methoden van de zuivering, is afhankelijk van de aanwezigheid van membraan-penetrating bOVA.
Het gezuiverde microsomes toonde de mogelijkheid om te ubiquitinate de opgenomen bOVA in vitro, onder de aanwezigheid van RLs (figuur 3A). De hoeveelheid bOVA en poly-ubiquitinated bOVA werden opgedreven in aanwezigheid van MG132 (figuur 3B), die aangeeft dat de opgenomen bOVA werd verwerkt door het systeem van ERAD en dat onze gezuiverde microsomes ERAD machines eiwitten bevatte.
Figuur 1: intracellulair trajecten voor CP in DCs. DCs, worden exogene antigenen vervoerd in niet-klassieke endocytotische compartimenten, waarin ook ER-ingezeten moleculen naast moleculen van de klassieke laat endosome. In dit compartiment, worden exogene antigenen geëxporteerd in cytosol via translocons zoals Sec61. Het cytosol, worden exogene antigenen verwerkt door het systeem van de ubiquitin-proteasoom in antigene peptiden als ERAD substraten. Antigene peptiden in dezelfde of aangrenzende niet-klassieke endocytotische compartimenten of aangrenzende ER via TAP vervoerder zijn vervoerd en vervolgens geladen op de MHC ik moleculen door PLC. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: zuivering van Microsomes met bOVA ondergaan ERAD. (A) A Schematisch model van zuivering van microsomes met bOVA ERAD ondergaan. bOVA is gekoppeld aan het membraan via de Sec61 translocon en gericht met SA-magnetische kralen. (B) Microsomes met (+) of zonder (-) voorafgaande toevoeging van bOVA werden gezuiverd met (+) of zonder (-) SA-magnetische kralen. Eiwitten (2 µg) of de overeenkomstige volumes van gezuiverde eiwitten werden opgelost op 7.5-15% SDS-pagina, en zilveren kleuring werd gebruikt om te visualiseren van eiwitten bands. Driehoeken aan de rechterkant geven aan niet-specifieke proteïnen binden aan de SA-magnetische kralen. Driehoeken met sterretjes geven unieke eiwitten gevonden alleen in aanwezigheid van exogenously toegevoegde bOVA en SA-magnetische kralen. De pijl geeft aan bOVA. (C) Microsomes met (+) of zonder (-) voorafgaande toevoeging van bOVA werden gezuiverd met (+) of zonder (-) SA-magnetische kralen. Eiwitten (10 µg) of de overeenkomstige volumes van gezuiverde eiwitten werden opgelost op 7.5-15% SDS-pagina, en onderworpen aan het westelijke bevlekken met SA-HRP. P.N.: post nucleaire breuk. Sterretjes in het recht geven aan niet-specifieke banden met SA-HRP. Gelijkwaardige resultaten werden bereikt door ten minste drie onafhankelijke testen. (D) Microsomes met voorafgaande toevoeging van bOVA werden gezuiverd met SA-magnetische kralen. Microsomes werden behandeld met (+) of zonder (-) trypsine en TX-100 voor zuivering (links twee rijstroken) of na zuivering (rechts twee rijstroken). Eiwitten (2 µg) of de overeenkomstige volumes van gezuiverde eiwitten werden opgelost op 7.5-15% SDS-pagina, en zilveren kleuring werd gebruikt om te visualiseren van eiwitten bands. Driehoeken aan de rechterkant geven aan niet-specifieke proteïnen binden aan de SA-magnetische kralen. Driehoeken met sterretjes geven unieke eiwitten gevonden alleen in aanwezigheid van exogenously toegevoegde bOVA en SA-magnetische kralen. Gelijkwaardige resultaten werden bereikt door ten minste drie onafhankelijke testen. Overgenomen met toestemming van referentie28. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: In Vitro reconstitutie van verwerking en Ubiquitination eicellen met gezuiverd Microsomes. (A) Purified microsomes met (+) of zonder (-) voorafgaande toevoeging van bOVA werden behandeld met (+) of zonder (-) RL en vlag-Ub voor 1 h en werden ontbindend TNE gebruiken. bOVA werd gezuiverd met SA-magnetische kralen en onderworpen aan het westelijke bevlekken met de aangegeven antilichamen. Sterretjes in het recht geven aan niet-specifieke banden met SA-HRP. Gelijkwaardige resultaten werden bereikt door ten minste drie onafhankelijke testen. (B) Purified microsomes werden behandeld met (+) of zonder (-) RL, vlag-Ub en MG132 voor 1 h en werden vervolgens ontbindend worden met behulp van TNE. bOVA werd gezuiverd met SA-magnetische kralen en onderworpen aan het westelijke bevlekken met SA-vlag. Sterretjes in het recht geven aan niet-specifieke banden met SA-HRP. Gelijkwaardige resultaten werden bereikt door ten minste drie onafhankelijke testen. Herdrukt met permission verwijzing €28. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In eerdere studies van CP, de opgenomen exogene antigenen opgebouwd in de beperkte ruimte van de late endosome of ER door immunefluorescentie microscopie16,30,31,32. Geschat wordt dat ERAD-achtige vervoer en verwerking van exogene antigenen worden uitgevoerd in deze gespecialiseerde vakgebieden zoals de ER of late endosome, zoals de cellulaire compartiment werd ontdekt door sacharose of het gebruik van iodixanol dichtheid kleurovergang centrifugeren ubiquitinated bOVA als een ERAD-achtige verwerking marker. Na het stimuleren van hun aangeboren immuniteit, CP-efficiëntie aanzienlijk verhoogd, en de Fractie van de piek voor bOVA samen met ubiquitinated bOVA gemigreerd naar een hogere dichtheid breuk (onze niet-gepubliceerde resultaten). De doelstellingen van deze experimenten waren ter aanduiding van de specifieke moleculaire markers voor de ER of late endosome, die samen met bOVA of ubiquitinated bOVA gemigreerd. Maar in de resultaten, zowel ER ingezeten moleculen en laat endosome-ingezeten moleculen gemigreerd samen met de bOVA en ubiquitinated bOVA, die aangeeft dat deze experimenten niet succesvol waren in het nagaan van de cellulaire compartiment voor ERAD-achtige vervoer en de verwerking als de klassieke ER of late endosome. In deze experimenten waren er geen specifieke moleculen in de endocytotic vakken behalve bOVA of ubiquitinated bOVA. Echter, terwijl de exogene antigeen onderging ERAD-achtige vervoer, deze moleculen doorgedrongen is tot het lipide dubbelgelaagde membraan van ER door middel van translocons, zoals Sec61 complex (Figuur 1, figuur 2A). Het membraan steken bOVA werd geselecteerd als een marker van de endocytotische compartimenten, en de microsomes werden gezuiverd door SA-magnetische kralen (figuur 2A, 2B). In deze gezuiverde microsomes kwam de geaccumuleerde bOVA ERAD-achtige ubiquitination en behandeling onder de aanwezigheid van RL en ATP in vitro (figuur 3A, 3B). Omdat RL alle cytosolische moleculaire apparaten, zoals ubiquitination-gerelateerde moleculen en Proteasomen naast moleculen voor vertaling en transcriptie bevat, kan de toevoeging van RL ubiquitination van bOVA in gezuiverde microsome. Deze resultaten wijzen erop dat gezuiverde microsomes de objectieve cellulaire compartimenten waren ERAD-achtige vervoer en verwerking van exogene antigenen, zowel die bevatten endosome-specifieke moleculen en ER-ingezeten moleculen op hetzelfde moment; Lamp1 toonde voorloper zowel volwassen vormen in de gezuiverde microsome.
Dit protocol is afhankelijk van de hoeveelheid membraan-penetrating exogene antigenen; het is belangrijk om op te nemen genoeg van de exogene antigenen naar DC2.4 cellen, die een hoog vermogen te nemen van exogene antigenen in de semi-confluente Braziliaanse toont. De incubatietijd van 6-12 h voor DC2.4 met bOVA grondvlak verhoogt de hoeveelheid opgenomen bOVA. De toevoeging van remmers voor Proteasomen, MG132 of lactacystin, verhoogt matig de hoeveelheid gezuiverde microsomes. De voorbereiding van de microsome is een van de belangrijkste stappen voor dit protocol. De gratis bOVA, die niet in de cellen van de DC2.4 is opgenomen, moet worden verwijderd door het wassen van de cellen met PBS, om te voorkomen dat niet-specifieke binding van de gratis bOVA de microsome-Fractie. Verklein schade op membraan compartimenten en zijn zorgvuldig cellen verstoord door de Dounce homogenizer in ijswater. Ongebroken cellen en kernen werden vervolgens verwijderd door centrifugeren zoals de microsomes uit de post nucleaire afvalfractie werden voorbereid. Na de voorbereiding van de microsomes, wordt one-step zuivering door SA-magnetische kralen uitgevoerd. In deze stap is zorgvuldig wassen van de magneet gebonden microsome noodzakelijk om de niet-specifieke binding van andere cellulaire compartimenten en de specifiek gebonden microsome niet te verliezen.
Bij deze methode een stap zuivering is een aanzienlijk percentage van de target microsome vereist. Als de verhouding van de objectieve microsome te klein is, vermindert de hoeveelheid gezuiverde doel microsome door concurrentie met niet-specifieke binding van andere cellulaire compartimenten. Bijgevolg, onder deze omstandigheden, de verrijking van de target microsome en de goedkeuring van de niet-specifieke microsome nodig zou zijn. Het is ook mogelijk om extra stappen voor zuivering door de SA-magnetische kralen. Een dergelijke stap wordt de sacharose of iodixanol dichtheid kleurovergang centrifugeren van de microsome. Aangezien de bereide microsomes alle membraan producten bevat, is het wellicht mogelijk te verrijken van de target microsome voor SA-magnetische kralen zuivering door het selecteren van de rijke breuken van antigeen voor de zuivering. Een andere mogelijke stap is de voorafgaande goedkeuring van de microsome door controle-magnetische kralen zonder SA, om de niet-specifieke achtergrond verenigingen van microsomes tegen SA-magnetische kralen. In deze experimenten, beide stappen verbeterd de zuiverheid van de target microsome effectief, maar minder van de totale hoeveelheid zuivere producten, die aangeeft dat deze extra stappen zijn geselecteerd als middel van verdere experimenten.
Het is bekend dat snelle centrifugeren is aangetoond dat het veroorzaken van de fusie of de bloedstolling van intracellulaire vesikels. Deze fusies of clottings zal produceren kunstmatige microsomes, die zijn afgeleid van de niet-specifieke interactie tussen verschillende soorten organel afkomstige blaasjes. Deze kunstmatige microsomes bevatten statistisch elke molecuul membraan zoals de mitochondriale resident molecuul, Golgi-apparaat resident molecuul, enz. Deze gezuiverde microsomes bevatte niet de caveosome resident eiwitten, Golgi-apparaat resident eiwitten of vroege endosome-ingezeten eiwitten, zoals caveolin1, GM130 en EEA1, die aangeeft dat de microsomes van SA-gezuiverd niet kunstmatige producten zijn afgeleid van de fusie tussen verschillende soorten blaasjes. Zonder de snelle centrifugeren, bOVA-steken blaasjes werden geïsoleerd, maar de controle-experimenten van blaasjes zonder bOVA toonde hogere hoeveelheden niet-specifieke moleculen. Dit betekent dat deze voorlopige methode onvoldoende voor opeenvolgende experimenten is en dat de snelle centrifugeren stap voor dit protocol reiniging noodzakelijk is.
Dit protocol is van toepassing op andere celtypen, zoals verschillende subgroepen van de DC of andere APCs. Het is ook mogelijk om het gebruik van de verschillende soorten exogene antigenen in verschillende omstandigheden, zoals TL eiwitten, antigeen-antilichaam complex, antigenen van de kralen gebonden, enz. Bovendien kunnen wij zuiveren doel microsomes met behulp van specifieke antilichamen tegen de exogene antigenen. Hoewel verschillende aanvullende stappen of wijzigingen kunnen worden verplicht dit protocol toepassen op andere cellen en antigenen, kan het de moleculaire mechanismen van het proteasoom-afhankelijke CP verhelderen door het vergelijken van de gezuiverde moleculen onder verschillende experimenten. Het beschreven protocol heeft dus ruimte voor aanpassing en verbetering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het Takasaki Universiteit van gezondheid en welzijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S.
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A.
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
