Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Rensning af membran til kabinen for endoplasmatiske Reticulum-associerede nedbrydning af eksogene antigener i Cross-præsentation

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

Summary

Metoden beskrevet her er en ny vesikel isolation protokol, som giver mulighed for rensning af de cellulære rum hvor eksogene antigener behandles af endoplasmatiske reticulum-associerede nedbrydning i cross-præsentation.

Abstract

Dendritiske celler (DCs) er meget i stand til at behandle og præsentere internaliseret eksogene antigener på store histocompatibility klasse (MHC) jeg molekyler også kendt som cross-præsentation (CP). CP spiller en vigtig rolle ikke kun i stimulation af naive CD8+ T celler og hukommelse CD8+ T celler smitsomme og tumor immunitet men også i inaktivering af selvvirkende naive T celler af T celle anergy eller T-celle sletning. Selvom den kritiske molekylære mekanisme af CP mangler at blive belyst, indikerer akkumulere beviser, at eksogene antigener behandles gennem endoplasmatiske reticulum-associerede nedbrydning (ERAD) efter eksport fra ikke-klassisk endocytic rum. Indtil for nylig, var beskrivelser af disse endocytic rum begrænsede, fordi der var ingen specifikke molekylære markører end eksogene antigener. Metoden beskrevet her er en ny vesikel isolation protokol, som giver mulighed for rensning af disse endocytic rum. Brug denne renset microsome, rekonstitueres vi ERAD-lignende transport, ubiquitination og forarbejdning af eksogene antigen i vitro, tyder på, at ordningen ubiquitin-proteasom behandlet eksogene antigenet efter eksport fra dette cellulære rum. Denne protokol kan yderligere anvendes til andre celletyper til at præcisere den molekylære mekanisme af CP.

Introduction

MHC jeg molekyler udtrykkes på overfladen af alle nucleated celler, med korte antigene peptider afledt af endogene antigener, som behandles af ubiquitin-proteasom system i cytosol1. Efter forarbejdning transporteres antigene peptider til det endoplasmatiske reticulum (ER) lumen af peptid transportør TAP. I lumen ER en række specifikke chaperoner hjælpe peptid lastning og den korrekte foldning af MHC jeg komplekse. Denne serie af molekyler kaldes peptid-loading komplekset (PLC), der angiver at Skadestuen er en centrale rum for peptid indlæsning på MHC2. Efter peptid lastning, MHC jeg molekyler transporteres til cellens overflade og spille en central rolle i det adaptive immunsystem som selvstændig markører, og gør CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) hen til opdager kræftceller eller infektiøse agenser af antigene peptider fra ikke-selv proteiner3.

I antigen præsentere celler (APC), antigene peptider fra eksogene antigener er også præsenteret på MHC jeg4,5,6,7,8 via CP, som hovedsagelig transporteres ud af DCs9,10,11. CP er vigtigt både for aktivering af naive CD8+ T celler og hukommelse CD8+ T celler ind i anti-infektiøs og anti-tumorsygdomme CTLs12,13, og i vedligeholdelsen af immuntolerance ved uvirksomme af selvvirkende naive T celler14,15. CP spiller mange vigtige roller i den adaptive immunsystem, men de molekylære mekanismer af CP har endnu at blive beskrevet i detaljer. Tidligere undersøgelser af CP afslørede at eksogene antigener er lokaliseret både i Skadestuen og endosome og blev behandlet af ERAD, tyder på, at eksogene antigener transporteres fra endosome til Skadestuen for ERAD-lignende behandling og peptid lastning16 . Akkumulere beviser tyder imidlertid på, at peptid lastning af CP er udføres ikke på Skadestuen, men snarere i ikke-klassisk endocytic rum, som også har særlige kendetegn ER (figur 1)17,18 ,19,20,21. For at undgå nedbrydning af antigene peptid prækursorer af den høje aktivitet af aminopeptidase opstår22 i cytosol, forarbejdning og peptid lastning i CP i den proksimale område af disse ikke-klassisk endocytic rum (figur 1). Selvom beskrivelser af disse endocytic rum er kontroversielle, er der ingen eksisterende specifikke molekyler end eksogene antigener i dette rum.

ERAD er et cellulært pathway, som specifikt fjerner fejlfoldede proteiner fra Skadestuen. I ERAD pathway, fejlfoldede proteiner retrogradely transporteres gennem ER membran til cytoplasma og behandles af ubiquitin-proteasom system23,24,25. Når store molekyler som proteiner, der transporteres gennem lipid tolagede, disse molekyler passere gennem en molekylær apparat kaldet en translocon, Sec61 complex og Derlin komplekse ER26, og Tom komplekse og Tim komplekse i den mitokondrier27. Når eksogent tilføjet antigener transporteres gennem ER membran, skal de trænge lipid tolagede i kompleks med translocons, som Sec61 kompleks. Metoden beskrevet her renset den målrettede vesikel ved at udnytte disse membran-gennemtrængende molekyler som markører for de endocytic rum.

Metoden beskrevet her er en ny vesikel rensning protokol bruger DC-lignende celle line DC2.428 og biotinylated ægalbumin (bOVA) som en udefrakommende antigen. De endocytic rum blev renset af streptavidin (SA)-magnetiske perler med membran-gennemtrængende bOVA som en maker. I denne renset microsome, nogle eksogent tilføjet bOVA blev bevaret i membranen fraktioner men blev transporteret til ydersiden af microsome, og derefter ubiquitinated og forarbejdet in vitro-29. Denne renset microsome indeholdt ikke kun endocytic rum-specifikke proteiner, men også ER hjemmehørende proteiner til ERAD og peptid lastning kompleks; tyder på at det cellulære rum er den potentielle endocytic rum til CP29. Denne protokol er ikke afhængig af slags eksogene antigener, og gælder også for andre DC delmængder og andre celletyper såsom makrofager, B-celler og endotelceller, at klarlægge det præcise molekylære mekanisme af DCs for dygtige CP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vokser cellerne og tilsætning af eksogene antigener

  1. Forbered bOVA ved hjælp af et biotin-protein mærkning kit efter fabrikanten ' s protokol.
    Bemærk: Normalt bOVA indeholder 2 M biotin pr. 1 M æg gennemsnitligt.
  2. Grow DC2.4 celler i RPMI-1640 suppleret med 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 0.1 mM uvæsentlige aminosyrer, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 55 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) og 10% føtalt kalveserum (herefter RPMI) ved 37 ° C i 5 % CO 2 i en fugtig inkubator (herefter uden omtale, cellerne inkuberes ved denne betingelse). Det er også muligt at bruge DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum, 3,7 g/L NaHCO 3 (herefter DMEM) i stedet for RPMI.
  3. En dag før rensning, Opdel celler i RPMI til 1 x 10 5 celler/mL i en vævskultur plade. Undgå at holde cellerne i en sammenflydende tilstand. DC2.4 celler kan meget inkorporere udefrakommende antigener indtil en semi-sammenflydende stat, men hurtigt miste evnen efter at have nået en overdreven sammenflydende tilstand.
  4. Før DC2.4 celler er semi-sammenflydende, tilsættes 250 µg/mL bOVA til 1 x 10 6 celler/mL og inkuberes i 2-4 h.
    Bemærk: Under downstream eksperimenter, alle buffere og reagenser opbevares ved 4 ° C medmindre andet er angivet.

2. Forberedelse af Microsomes

  1. høste DC2.4 cellerne af blid pipettering fra væv pladen ind i en ny 50 mL konisk rør.
  2. På 1.000 x g der centrifugeres i 5 min, 4 ° C og fjern forsigtigt medium med bOVA ved aspiration.
  3. DC2.4 cellerne vaskes to gange med 40 mL PBS buffer (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min, 4 ° C, og supernatanten hver gang ved aspiration.
  4. Resuspend pellet i trin 2.3 i 1-2 mL (1/20-1/10 bind af næringssubstratet) homogenisering medium (0,25 M saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7,4]) med 1/1.000 volumen af protease hæmmer cocktails og overføre den resuspenderede DC2.4 celler ind i en iskoldt Dounce homogeniseringsapparat.
  5. Forstyrrer de resuspenderede DC2.4 celler forsigtigt af 10-20 slag med den iskolde Dounce homogeniseringsapparat.
    Bemærk: Under trinnet forstyrrelser Dounce homogeniseringsapparat er afkølet på ice.
  6. Overføre den celle-forstyrret suspension til en ny 15 mL konisk tube.
  7. Tilsættes 8-9 mL homogenisering medium 10 mL samlede og centrifugeres den koniske rør i 10 min på 2.000 x g og 4 ° C.
  8. Overføre supernatanten til en ny 15 mL konisk slange at fjerne ubrudt celler og cellekerner og centrifugeres den koniske rør igen i 10 min på 2.000 x g og 4 ° C.
  9. Overføre supernatanten ind i en ny ultracentrifugering rør og centrifugeres i 45 min. ved 100.000 x g og 4 ° C.
  10. Opsug supernatanten og resuspenderes omhyggeligt i 1-2 mL af homogenisering medium med 1/1.000 volumen af protease hæmmer cocktails af pipettering løsning op og ned flere gange for at gøre en microsome fraktion til downstream eksperimenter.
  11. Overføre microsome fraktion i en ny 5-mL rund bund tube.
    Bemærk: Efter dette trin, er det muligt at berige objektive microsomes ved iodixanol tæthed gradient centrifugering ifølge producenten ' s protokol, at fjerne ikke-specifikke microsomes. Peak brøker for eksogene antigener er indsamlet og derefter udsat til det næste trin i rensning (trin 3).

3. Rensning af Microsomes med bOVA gennemgår ERAD

  1. Tilføj 1/100 volumen af friske SA-magnetiske perler til microsome del af trin 2.11 i 5 mL rund bund tube.
    Bemærk: Før dette trin, at det er muligt at pre klart microsome fraktion af kontrol-magnetiske perler at reducere forureninger af uspecifikke microsomes.
  2. Forsigtigt blandes godt og rotere rund bund røret langsomt i 30 min. ved 4 ° C.
  3. Tilføje 2-3 mL af homogenisering medium til 4 mL samlede ind i rund bund rør og forsigtigt blandes godt.
  4. Rund bund røret anbringes på en magnetisk stå og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C. Da perler er bundet til vesikler er tiltrukket af magneten, brun micro-beads vil gradvist ophobes på tube væggen tættest på magneten.
  5. Med rør tilbage i den magnetiske stå, omhyggeligt kassere analysere ved aspiration til at fjerne de ubundne vesikler.
  6. Vask de magnetiske perler bundet til vesikler to gange med 5 mL af homogenisering medium af den magnetiske stå i 10 min. ved 4 ° C, og supernatanten hver gang ved omhyggeligt aspiration.
    Bemærk: Uden den magnetiske fod, rensning af centrifugations på 2.000 x g i 10 min., 4 ° C er også tilgængelig.
  7. Resuspend de magnetiske perler bundet til vesikler omhyggeligt i 100 µL homogenisering medium af pipettering løsning op og ned flere gange.
  8. Overføre de resuspenderede vesikler i en ny microtube som de renset microsome for downstream eksperimenter.
    Bemærk: Typisk 50 µL microsome fraktion indeholdende 5-20 µg proteiner fra 1 x 10 7 celler kan være isoleret.

4. Analyse af den renset Microsomes

  1. Resuspend den magnetiske perler bundet til vesikler fra trin 3.8 for 100-200 µL af TNE buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) med 1/1.000 volumen af protease hæmmer cocktails i stedet for homogenisering medium.
  2. Overførsel af lysate fra trin 4.1 til en ny 1,5 mL microtube.
  3. Afgøre proteinkoncentration af trin 4.2 ved hjælp af en BCA assay kit per fabrikanten ' s protokol.
    Bemærk: Typisk 5-10 µL lysate fra trin 4.2 er nok til at bestemme proteinkoncentration.
  4. Overførsel af lysate fra trin 4.2 (2 µg protein for sølv farvning og 10 µg protein for Western blotting) ind i nye microtubes.
  5. Sætte microtubes på en varme blok på 95 ° C og kog proteiner i 1 x SDS gel-loading bufferen (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 200 mM dithiothreitol, 4% SDS, 0,2% bromophenol blå, 20% glycerol) i 5 min.
  6. Centrifugeres microtubes i 10 min på 21,500 x g og 4 ° C. indsamle analysere ind i nye microtubes at fjerne de uopløselige fraktioner.
  7. Analysere de løst proteiner i trin 4.6 (2 µg) af standard SD-SIDERS.
  8. Visualiser protein bands af sølvfarvning ved hjælp af sølv farvning kit efter fabrikanten ' s protokol.
  9. Analysere de løst proteiner i trin 4.6 (10 µg) af standard SD-PAGE og Western blotting. Bruge reagens (SA-HRP) pr. fabrikanten ' s protokol og visualisere ved fluorography.

5. In Vitro Rekonstituering af ERAD Ubiquitination af bOVA ved hjælp af renset Microsomes

  1. overførsel af renset microsomes (5-10 µg protein) fra trin 3.8 med en 50% volumen af reticulocyte lysate (RL), i 1 x reaktion buffer (50 mM Tris pH 7,4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl 2), og 0:2 pM Flag-tagged ubiquitin i en ny microtube. Den endelige mængden af dette eksperiment er 20-40 µL.
  2. Incubate microtube i 2 timer ved 37 ° C.
    Bemærk: Hvis ubiquitinated bOVA taktfast 5.12 er for lille til at påvise ved Western blotting, tilføje 10 µM af MG132 eller 2 µM af lactacystin at hæmme behandling af ubiquitinated bOVA ved proteasomes.
  3. Stop reaktion ved at placere microtube på ice.
  4. Løse microsomes ved at tilføje 500 µL TNE buffer med 1/1.000 volumen af protease hæmmer cocktails.
  5. Centrifugeres microtube i 10 min på 21,500 x g og 4 ° C. indsamle analysere ind i en ny microtube til at fjerne de uopløselige fraktioner, der indeholder ubiquitinated bOVA i DC2.4 før i in vitro ubiquitination analyse.
  6. Overføre supernatanten til en ny microtube og tilføje 1/100 bind af ny SA-magnetiske perler (normalt 5 µL til 500 µL af supernatanter).
  7. Forsigtigt blandes godt og rotere microtube langsomt i 30 min. ved 4 ° C.
  8. Centrifugeres microtube i 10 min på 21,500 x g og 4 ° C. Fjern supernatanten ved aspiration til at inddrive bOVA og ubiquitinated bOVA bundet med de SA-magnetiske perler.
  9. Vaskes to gange de indsamlede SA-magnetiske perler med 1 mL af TNE buffer ved centrifugering i 10 min. ved 21,500 x g og 4 ° C. Fjern supernatanten hver gang ved aspiration.
  10. Koge de SA-magnetiske perler i 1 x SDS gel loading bufferen for 5 min. ved 95 ° C på en varme-blok til at løse de rensede proteiner af SA-magnetiske perler.
  11. Centrifugeres microtube i 10 min på 21,500 x g og 4 ° C. indsamle analysere ind i en ny microtube til at fjerne de uopløselige fraktioner.
  12. Analysere de SA-magnetiske perler af standard SD-PAGE og Western blotting er bundet til proteiner. Brugen af antistoffer (anti-Flag, anti-multi-Ub og anti-mus IgG-HRP) og reagens (SA-HRP) er per fabrikanten ' s protokol og visualiseret ved fluorography.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at belyse de molekylære mekanisme af CP, er det nødvendigt at identificere de cellulære rum, hvor udefrakommende antigener gennemgå ERAD-lignende transport og forarbejdning. Mens betragtninger af immunfluorescent mikroskopi eller ved elektronmikroskopi identificeret den cellulære rum hvor eksogene antigener akkumuleret16,17,18,19, 30,31,32,33, de cellulære rum for ERAD-lignende behandling af eksogene antigener ikke er klart defineret. For nylig var det vist at ikke-klassisk endosomes med ER bosiddende molekyler var ansvarlig for CP34, men disse cellulære rum var urenset. Er vanskeligheden at isolere og rense de cellulære rum kan henføres til, at eksogene antigener er lokaliseret både i endosome og ER-lignende rum, og at der er ingen identificerende molekyle for disse endocytic rum andre end eksogene antigener. Tilstanden af eksogene antigener gennemgår ERAD-lignende transport er imidlertid forskellig fra steady state; i transport på tværs af lipid bimolecular membran eksogene antigener trænge membran via translocons, som Sec61 (figur 2A). Således, når du bruger bOVA som en udefrakommende antigen, bOVA bør være forbundet med Sec61. Da membran-associerede bOVA specifikt bundet med SA, kunne microsome fremstillet af DC2.4, som var forbehandlet med bOVA, være isoleret udpræget af SA-magnetiske perler (figur 2A). Derefter blev tilsvarende mængder af proteiner fra renset microsomes med eller uden præ-inkubation af bOVA løst af SDS-PAGE efterfulgt af sølv farvning og Western blotting med SA-HRP (figur 2B, 2 C). Som vist i figur 2B og fig. 2 c, indeholdt på isoleret microsomes flere unikke proteiner, der var renset afhængig eksogent tilføjet bOVA og SA-magnetiske perler. Ud over disse enestående proteiner indeholdt isolerede microsomes også uspecifik proteiner, som er bundet til SA-magnetiske perler med eller uden bOVA. Behandling af microsome med trypsin før rensning af magneten forhindret rensning af microsomes (figur 2D), hvilket indikerer, at rensning metoder afhængig af tilstedeværelsen af membran-gennemtrængende bOVA.

De renset microsomes viste evnen til at ubiquitinate indarbejdet bOVA i vitro, under tilstedeværelse af RLs (figur 3A). Mængder af bOVA og poly-ubiquitinated bOVA var augmented tilstedeværelse af MG132 (figur 3B), der angiver, at den indbyggede bOVA blev behandlet af ERAD system og at vores renset microsomes indeholdt ERAD maskiner proteiner.

Figure 1
Figur 1: intracellulære veje for CP i DCs. I DCs transporteres eksogene antigener i ikke-klassisk endocytic rum, som også indeholder ER resident molekyler foruden molekyler af den klassiske slutningen endosome. I dette rum eksporteres eksogene antigener i cytosol gennem translocons som Sec61. I cytosol, er eksogene antigener forarbejdet af ubiquitin-proteasom system til antigene peptider som ERAD substrater. Antigene peptider, der transporteres i samme eller tilstødende ikke-klassisk endocytic rum eller et tilstødende ER gennem HANEN transporter og derefter indlæses på MHC jeg molekyler af PLC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: rensning af Microsomes med bOVA gennemgår ERAD. (A) A skematisk model af rensning af microsomes med bOVA gennemgår ERAD. bOVA er forbundet med membran gennem Sec61 translocon og målrettet med SA-magnetiske perler. (B) Microsomes med (+) eller uden (-) forudgående tilsætning af bOVA blev renset med (+) eller uden (-) SA-magnetiske perler. Proteiner (2 µg) eller tilsvarende mængder af rensede proteiner var løst på 7,5-15% SDS-PAGE og sølv farvning blev brugt til at visualisere protein bands. Trekanter på højre side angiver uspecifik proteiner binding til de SA-magnetiske perler. Trekanter med stjerner angiver unikke proteiner, der findes kun ved tilstedeværelse af eksogent tilføjet bOVA og SA-magnetiske perler. Pilen viser bOVA. (C) Microsomes med (+) eller uden (-) forudgående tilsætning af bOVA blev renset med (+) eller uden (-) SA-magnetiske perler. Proteiner (10 µg) eller tilsvarende mængder af rensede proteiner var løst på 7,5-15% SDS-PAGE og underkastes Western blotting med SA-HRP. PN: post nukleare fraktion. Stjerner i højre angiver uspecifikke bands med SA-HRP. Tilsvarende resultater blev opnået ved mindst tre uafhængige assays. (D) Microsomes med forudgående tilsætning af bOVA blev renset med SA-magnetiske perler. Microsomes blev behandlet med (+) eller uden (-) trypsin og TX-100 før rensning (til venstre to kørebaner) eller efter rensning (lige to baner). Proteiner (2 µg) eller tilsvarende mængder af rensede proteiner var løst på 7,5-15% SDS-PAGE og sølv farvning blev brugt til at visualisere protein bands. Trekanter på højre side angiver uspecifik proteiner binding til de SA-magnetiske perler. Trekanter med stjerner angiver unikke proteiner, der findes kun ved tilstedeværelse af eksogent tilføjet bOVA og SA-magnetiske perler. Tilsvarende resultater blev opnået ved mindst tre uafhængige assays. Genoptrykt med tilladelse fra reference28. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: In Vitro rekonstituering af forarbejdning og Ubiquitination ved hjælp af æg i renset Microsomes. (A) renset microsomes med (+) eller uden (-) forudgående tilsætning af bOVA blev behandlet med (+) eller uden (-) RL og Flag-Ub for 1t og var oploeses ved hjælp af TNE. bOVA blev renset med SA-magnetiske perler og underkastes Western blotting med de angivne antistoffer. Stjerner i højre angiver uspecifikke bands med SA-HRP. Tilsvarende resultater blev opnået ved mindst tre uafhængige assays. (B) renset microsomes blev behandlet med (+) eller uden (-) RL, Flag-Ub og MG132 for 1 h og blev derefter oploeses ved hjælp af TNE. bOVA blev renset med SA-magnetiske perler og underkastes Western blotting med SA-Flag. Stjerner i højre angiver uspecifikke bands med SA-HRP. Tilsvarende resultater blev opnået ved mindst tre uafhængige assays. Genoptrykt med tilladelsen fra reference28. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I tidligere undersøgelser af CP akkumuleret indarbejdet eksogene antigener begrænset inden for de sene endosome eller ER af immunfluorescent mikroskopi16,30,31,32. Det anslås, at ERAD-lignende transport og forarbejdning af eksogene antigener foretages i disse specialiserede områder af ER eller sene endosome, da det cellulære rum blev identificeret af saccharose eller iodixanol tæthed gradient centrifugering ved hjælp ubiquitinated bOVA som en ERAD-lignende behandling markør. Efter stimulere deres medfødte immunitet, CP effektivitet steget betydeligt, og peak brøkdel for bOVA sammen med ubiquitinated bOVA overflyttet til en højere massefylde brøkdel (vores ikke-offentliggjorte resultater). Formålet med disse forsøg var at identificere specifikke molekylære markører for ER eller sene endosome, som overført sammen med bOVA eller ubiquitinated bOVA. Men i resultaterne, både ER bosiddende molekyler og sen endosome-resident molekyler overført sammen med bOVA og ubiquitinated bOVA, der angiver, at disse forsøg var forgæves i opklare den cellulære rum til ERAD-lignende transport og forarbejdning som klassisk ER eller sene endosome. I disse eksperimenter var der ingen specifikke molekyler i de endocytotic rum undtagen bOVA eller ubiquitinated bOVA. Men mens de eksogene antigen undergik ERAD-lignende transport, disse molekyler gennemtrænges lipid tolagede membranen af ER gennem translocons, som Sec61 complex (figur 1, figur 2A). Membranen stikning bOVA blev valgt som markør for de endocytic rum, og at microsomes blev renset af SA-magnetiske perler (figur 2A, 2B). I disse renset microsomes stødte akkumulerede bOVA ERAD-lignende ubiquitination og forarbejdning under tilstedeværelse af RL og ATP i vitro (figur 3A, 3B). Da RL indeholder alle cytosole molekylære apparati, såsom ubiquitination-relaterede molekyler og proteasomes ud over molekyler til oversættelse og transkription, muliggør tilsætning af RL ubiquitination af bOVA i renset microsome. Disse resultater viser, at renset microsomes var de objektive cellulære rum for ERAD-lignende transport og forarbejdning af eksogene antigener, begge indeholdende endosome-specifikke molekyler og ER hjemmehørende molekyler samtidig; Lamp1 viste både forløber og modne former i den renset microsome.

Denne protokol er afhængig af mængden af membran-gennemtrængende eksogene antigener; Det er vigtigt at indarbejde nok af de eksogene antigener til DC2.4 celler, der viser en høj evne til at inkorporere udefrakommende antigener i semi-sammenflydende tilstand. Forlængede 6-12 h inkubationstiden for DC2.4 med bOVA øger mængden af indarbejdet bOVA. Tilsætning af hæmmere for proteasomes, MG132 eller lactacystin, øger moderat mængden af renset microsomes. Forberedelse af microsome er et af de mest afgørende skridt for denne protokol. Den gratis bOVA, som ikke er indarbejdet i DC2.4 celler, bør fjernes ved at vaske cellerne med PBS, til at forhindre ikke-specifik binding af den gratis bOVA til microsome fraktion. For at reducere skader på membran rum, er celler omhyggeligt forstyrret af Dounce homogeniseringsapparat i isvand. Derefter blev ubrudt celler og cellekerner fjernet ved centrifugering som microsomes blev udarbejdet fra den post nukleare fraktion. Efter udarbejdelsen af microsomes, er der udført et-trins rensning af SA-magnetiske perler. I dette trin er omhyggelig med vask af magnet bundet microsome nødvendigt at fjerne ikke-specifik binding af andre cellulære rum og ikke miste de specifikt bundet microsome.

I denne ene skridt rensning metode kræves en betydelig procentdel af målet microsome. Hvis forholdet mellem det objektive microsome er for lille, nedsætter mængden af renset mål microsome ved konkurrencen med ikke-specifik binding af andre cellulære rum. Under disse betingelser, ville enrichments af mål microsome og clearance af uspecifikke microsome derfor være påkrævet. Det er også muligt at indføre yderligere trin før rensning af SA-magnetiske perler. Et sådant skridt er den saccharose eller iodixanol tæthed gradient centrifugering af microsome. Da de forberedte microsomes indeholder alle membran produkter, kan det være muligt at berige mål microsome før SA-magnetiske perler rensning ved at vælge antigen rige fraktioner til rensning. Et andet muligt skridt er microsome af kontrol-magnetiske perler uden SA, at reducere de uspecifikke baggrund sammenslutninger af microsomes mod SA-magnetiske perler før regnskabsafslutningen. I disse eksperimenter, begge trin forbedret renheden af target microsome effektivt, men mindskes det samlede beløb af renset produkter, med angivelse af disse yderligere trin er valgt som middel til yderligere forsøg.

Det er velkendt, at højhastigheds centrifugering har vist sig at forårsage fusion eller blodpropper af intracellulære vesikler. Disse fusioner eller clottings vil producere kunstige microsomes, som er afledt fra non-specifik interaktion mellem forskellige slags organelle-afledte vesikler. Disse kunstige microsomes indeholder statistisk hver membran molekyle som mitokondrielle bosiddende molekyle, Golgi apparatet bosiddende molekyle, osv. Disse renset microsomes omfatter ikke caveosome resident proteiner, Golgi apparatet bosiddende proteiner eller tidlige endosome-resident proteiner, såsom caveolin1, GM130 og EEA1, der angiver, at SA-renset microsomes ikke er kunstige produkter stammer fra fusion blandt forskellige typer af vesikler. Uden den high-speed centrifugering, bOVA-stikning vesikler blev isoleret, men kontrol eksperimenter fra vesikler uden bOVA viste større mængder af ikke-specifikke molekyler. Dette angiver, at denne foreløbige metode er utilstrækkelig for successive eksperimenter og at højhastigheds centrifugering skridt er nødvendige for denne rensning protokol.

Denne protokol gælder for andre celletyper, som forskellige DC delmængder eller andre PMV'er. Det er også muligt at bruge de forskellige typer af eksogene antigener i forskellige tilstande, såsom fluorescerende proteiner, antigen-antistof kompleks, perler bundet antigener. Derudover kan vi rense mål microsomes ved hjælp af specifikke antistoffer mod de eksogene antigener. Selv om flere supplerende trin eller ændringer kan være forpligtet til at anvende denne protokol til andre celler og antigener, kan det belyse de molekylære mekanismer for proteasom-afhængige CP ved at sammenligne de renset molekyler blandt forskellige eksperimenter. Således har beskrives protokollen plads til ændring og forbedring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde støttes af Takasaki Universitet for sundhed og velfærd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum Equitech bio SFB30
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine gibco by life technologies 25030-164
Penisicillin-Sreptomycin gibco by life technologies 15140-122
DMEM gibco by life technologies 12100-46
OVA SIGMA A5503
Biotin-protein labelling kit Thermo Fisher Scientific F6347
MG-132 Santa Cruz Biotechnology 201270
lactacystin SIGMA L6785
Dounce homogenizer IUCHI 131703
protease inhibitor cocktails SIGMA P8340
iodixanol Cosmo bio 1114542
SA-magnetic beads New England Biolabs 201270
control magnetic beads Chemagen M-PVA012
magnetic stand BD Biosciences 552311
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23225
silver staining kits Cosmo bio 423413
Reticulocyte Lysate Promega 1730714
Flag-tagged ubiquitin SIGMA U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse) Antibody Shop HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse) MBL D058−3
anti-Flag (mouse) SIGMA F3165
trypsin SIGMA 85450C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
  4. Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
  5. Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
  6. Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
  7. Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
  8. Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
  9. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  10. Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
  11. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  12. Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
  13. Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
  14. Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
  15. Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
  16. Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
  17. Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
  18. Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
  19. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
  20. Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
  21. Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
  22. Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
  23. Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
  24. Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
  25. Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
  26. Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
  27. Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
  28. Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
  29. Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
  30. Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
  31. Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
  32. Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
  33. Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
  34. Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).

Tags

Immunologi sag 126 dendritiske celler endoplasmatiske reticulum-associerede nedbrydning cross-præsentation store histocompatibility klasse I translocon ubiquitin
Rensning af membran til kabinen for endoplasmatiske Reticulum-associerede nedbrydning af eksogene antigener i Cross-præsentation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imai, J., Otani, M., Sakai, T.,… More

Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation. J. Vis. Exp. (126), e55949, doi:10.3791/55949 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter