Summary
Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione dei compartimenti cellulari dove antigeni esogeni vengono elaborati dal reticolo endoplasmatico-collegata di degradazione in cross-presentazione.
Abstract
Le cellule dendritiche (DCs) sono altamente capace di elaborare e presentare antigeni esogeni interiorizzati su classe di istocompatibilità (MHC) sono molecole conosciuto anche come cross-presentazione (CP). CP svolge un ruolo importante non solo nella stimolazione dell'ingenuo CD8+ T cellule e memoria CD8+ T cellule per infettive e immunità del tumore ma anche nell'inattivazione di self-acting le cellule T naive di anergia delle cellule T o l'eliminazione delle cellule T. Sebbene il meccanismo molecolare critico del CP rimane essere delucidato, raccogliendo la prova indica che antigeni esogeni vengono elaborati tramite associati al reticolo endoplasmatico degradazione (ERAD) dopo l'esportazione da Tronchetti endocitosi scomparti. Fino a poco tempo, caratterizzazioni di questi comparti endocitosi sono stati limitati perché non c'erano specifici marcatori molecolari diversi da antigeni esogeni. Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione di questi comparti endocitosi. Utilizzando questo microsoma purificato, abbiamo ricostituito il ERAD-come trasporto, ubiquitinazione e l'elaborazione del antigene esogeno in vitro, suggerendo che il sistema ubiquitina-proteasoma elaborato l'antigene esogeno dopo l'esportazione da questo compartimento cellulare. Questo protocollo possa essere applicato ad altri tipi di cella per chiarire il meccanismo molecolare di CP.
Introduction
Il MHC sono molecole sono espresse sulla superficie di tutte le cellule nucleate, con brevi peptidi antigenici derivati da antigeni endogeni, che vengono elaborati dal sistema ubiquitina-proteasoma nel cytosol1. Dopo l'elaborazione, peptidi antigenici sono trasportati nel lume del reticolo endoplasmatico (ER) del trasportatore di peptidi TAP. Nel lume dell'ER, una serie di specifiche chaperoni assistere il caricamento del peptide e il corretto ripiegamento del MHC I complessi. Questa serie di molecole è chiamato il complesso peptide-caricamento (PLC), che indica che l'ER è un vano centrale per peptide caricamento su MHC I2. Dopo peptide di caricamento, il MHC sono molecole vengono trasportati alla superficie delle cellule e svolgono un ruolo chiave nel sistema immunitario adattativo come auto-marcatori e consente il CD8+ linfociti T citotossici (CTL) per rilevare le cellule tumorali o agenti infettivi di antigenica peptidi da proteine non-sé3.
In cellule (APC) presentanti l'antigene, peptidi antigenici da antigeni esogeni sono anche presentata al MHC I4,5,6,7,8 tramite CP, che è trasportato principalmente fuori da DCs9,10,11. CP è essenziale sia per l'attivazione di ingenuo CD8+ T cellule e memoria CD8+ T cells in anti-infettivi e anti-tumorali CTLs12,13e nel mantenimento della tolleranza immunitaria inattivando di self-acting cellule T naive14,15. Il CP svolge molti ruoli importanti nel sistema immunitario adattativo, tuttavia i meccanismi molecolari della CP devono ancora essere descritti dettagliatamente. Gli studi precedenti di CP ha rivelato che antigeni esogeni sono stati localizzati in ER e l'endosoma e sono stati elaborati dal ERAD, suggerendo che antigeni esogeni sono trasportati dall'endosoma al pronto soccorso per ERAD-come elaborazione e peptide caricamento16 . Tuttavia, raccogliendo la prova indica che il caricamento del peptide di CP è effettuato non in ER, ma piuttosto in compartimenti endocitosi non classici, che hanno anche caratteristiche distintive del ER (Figura 1)17,18 ,19,20,21. Per evitare la degradazione dei precursori del peptide antigenico dall'alta attività di aminopeptidasi22 nel citosol, elaborazione e caricamento in CP peptide si verifica nella zona prossimale di questi comparti endocitosi non classici (Figura 1). Anche se le caratterizzazioni di questi comparti endocitosi sono controverse, non ci sono nessun esistenti specifiche molecole diverse da antigeni esogeni in questo comparto.
ERAD è una via cellulare, che in particolare rimuove le proteine misfolded dall'ER. Nella via ERAD, proteine misfolded vengono retrogradely trasportate attraverso la membrana ER al citoplasma ed elaborate dal sistema ubiquitina-proteasoma23,24,25. Quando le molecole di grandi dimensioni, quali le proteine, vengono trasportate attraverso il doppio strato lipidico, queste molecole passano attraverso un apparato molecolare chiamato complesso in un Traslocone, come il complesso di Sec61 e Derlin complesso l'ER26, e il complesso Tom e Tim il i mitocondri27. Quando esogenicamente aggiunto gli antigeni vengono trasportati attraverso la membrana dell'ER, essi devono penetrare bilayer del lipido in complesso con translocons, come il complesso di Sec61. Il metodo qui descritto purificato la vescicola mirata utilizzando queste molecole di membrana-penetrante come marcatori per i compartimenti endocitosi.
Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di purificazione di vescicola utilizzando il DC-come cella linea DC2.428 e biotinilati ovoalbumina (bOVA) come un antigene esogeno. I compartimenti endocitosi sono stati purificati da streptavidina (SA)-biglie magnetiche utilizzando il bOVA membrana-penetrante come un creatore. In questo microsoma purificato, alcuni esogenicamente aggiunto bOVA era ancora conservata nelle frazioni della membrana ma sono stato trasportato all'esterno del microsoma e poi ubiquitinate e trattato in vitro29. Questo microsoma purificata contenuta non solo proteine endocitiche vano, ma anche proteine ER-residente per ERAD e il peptide caricamento complesso; suggerendo che il compartimento cellulare è il vano endocitico prospettico per CP29. Questo protocollo non è dipenda dal tipo di antigeni esogeni e vale anche per altri sottoinsiemi di DC e altri tipi di cellule, quali i macrofagi, linfociti B e cellule endoteliali, per chiarire il meccanismo molecolare preciso di DCs per CP abile.
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Protocol
1. crescere cellule e aggiunta di antigeni esogeni
- preparare bOVA utilizzando un contrassegno di biotina-della proteina kit seguendo il produttore ' protocollo s.
Nota: Normalmente, bOVA contiene biotina di 2 M per 1 M OVA mediamente. - DC2.4 crescere le cellule in RPMI-1640 completate con 2 mM L-Glutammina, piruvato di sodio di 1 mM, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 100 U/mL penicillina-streptomicina, 55 mM 2-mercaptoetanolo, 10 mM HEPES (pH 7.5) e 10% siero fetale del vitello (d'ora in avanti RPMI) a 37 ° C in 5 % CO 2 in un incubatore (d'ora in avanti senza menzione, le cellule vengono incubate a questa condizione). È anche possibile utilizzare DMEM completati con 10% siero fetale di vitello, 3,7 g/L NaHCO 3 (d'ora in avanti DMEM) al posto di RPMI.
- Un giorno prima di purificazione, dividere le celle in RPMI a 1 x 10 5 cellule/mL in una piastra di coltura del tessuto. Evitare di mantenere le cellule in uno stato confluente. DC2.4 cellule possono altamente incorporare antigeni esogeni fino a uno stato semi-confluente, ma perdono rapidamente la capacità dopo aver raggiunto uno stato di sovra-confluenti.
- Prima the DC2.4 cellule sono semi-confluenti, aggiungere 250 µ g/mL di bOVA per 1 x 10 6 cellule/mL e incubare per 2-4 h.
Nota: Durante gli esperimenti a valle, tutti i buffer e i reagenti sono conservati a 4 ° C se non diversamente indicato.
2. Preparazione dei microsomi
- raccolto le cellule DC2.4 di pipettaggio delicato dalla piastra di tessuto in una nuova provetta conica 50 mL.
- Centrifugare a 1.000 x g per 5 min, 4 ° C e sfilare con cautela il mezzo con bOVA aspirazione.
- Lavare le cellule DC2.4 due volte con 40 mL di tampone PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min, 4 ° C e scartare il supernatante ogni volta dall'aspirazione.
- Risospendere il pellet in passaggio 2.3 in 1-2 mL (1/20-1/10 di volume di terreno di coltura) del mezzo di omogeneizzazione (0,25 M saccarosio, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) con volume di 1/1.000 di cocktail di inibitore di proteasi e trasferimento del sedimento DC2.4 di celle in un ghiacciata lisata omogeneizzatore.
- Frantumare le cellule DC2.4 sedimento delicatamente da 10-20 colpi con l'omogeneizzatore lisata ghiacciata.
Nota: Durante la fase di rottura, l'omogeneizzatore lisata è raffreddato su Ice. - Trasferire la sospensione cellulare-interrotto ad un nuovo tubo conico da 15 mL.
- Aggiungere 8-9 mL di terreno di omogeneizzazione a totale di 10 mL e centrifugare la provetta conica per 10 min a 2.000 x g e 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta conica 15 mL per rimuovere cellule ininterrotte e nuclei e centrifugare la provetta conica ancora per 10 min a 2.000 x g e 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in un nuovo ultracentrifugazione provetta e centrifugare per 45 min a 100.000 x g e 4 ° C.
- Aspirare il supernatante e risospendere il sedimento con attenzione in 1-2 mL di terreno di omogeneizzazione con volume di 1/1.000 di cocktail di inibitore di proteasi pipettando la soluzione su e giù più volte per rendere una frazione del microsoma per esperimenti a valle.
- Trasferire la frazione del microsoma in una provetta da 5 mL fondo tondo nuovo.
Nota: Dopo questo passaggio, è possibile arricchire i microsomi oggettive di centrifugazione in gradiente di densità iodixanol secondo il produttore ' protocollo s, rimuovere aspecifici microsomi. Le frazioni di picco per antigeni esogeni sono raccolti e poi sottoposto al passaggio successivo di purificazione (passaggio 3).
3. Purificazione dei microsomi con bOVA ERAD che subiscono
- volume aggiuntivo 1/100 di fresco SA-magnetico perline alla frazione del microsoma di passo 2.11 nei 5 mL fondo tubo tondo.
Nota: Prima di questo passaggio, è possibile pre-cancellare la frazione del microsoma di controllo magnetico perline per ridurre contaminazioni dei microsomi aspecifici. - Delicatamente mescolare bene e ruotare il tubo del fondo tondo lentamente per 30 min a 4 ° C.
- Aggiungere 2-3 mL di terreno di omogeneizzazione a 4 mL totale nella provetta fondo tondo e miscelare bene.
- Mettete il tubo fondo tondo su un supporto magnetico e incubare per 10 min a 4 ° C. Poiché le perline associate alle vescicole sono attratti dal magnete, microsfere marrone si accumulano gradualmente alla parete del tubo più vicina al magnete.
- Con il tubo attentamente restanti nello stand magnetico, scartare i surnatanti di aspirazione per rimuovere le vescicole non associate.
- Lavare i branelli magnetici vincolati alle vescicole due volte con 5 mL di medium di omogeneizzazione magnetico riposare per 10 min a 4 ° C e scartare il surnatante ogni volta accuratamente aspirando.
Nota: Senza il supporto magnetico, purificazione tramite le centrifugazioni a 2.000 x g per 10 min, 4 ° C è disponibile anche. - Risospendere i branelli magnetici associati alle vescicole attentamente nel medium di omogeneizzazione 100 µ l pipettando la soluzione su e giù più volte.
- Trasferire le vescicole sedimento in una microprovetta nuova come il microsoma purificato per esperimenti a valle.
Nota: In genere, 50 µ l del microsoma frazione contenente 5-20 µ g proteine da 1 x 10 7 cellule può essere isolato.
4. Analisi dei microsomi del purificato
perle- risospendere il magnetico associati alle vescicole da passo 3.8 da 100-200 µ l di tampone TNE (pH a 20 mM Tris-HCl 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) con volume di 1/1.000 di cocktail di inibitore della proteasi invece il mezzo di omogeneizzazione.
- Trasferire il lisato dal punto 4.1 una nuova microprovetta 1,5 mL.
- Determinare la concentrazione di proteina di fase 4.2 utilizzando un kit di test BCA per il produttore ' protocollo s.
Nota: In genere, 5-10 µ l lisato dalla fase 4.2 è sufficiente per determinare la concentrazione nella proteina. - Trasferire il lisato dalla fase 4.2 (2 µ g di proteina per la macchiatura d'argento e 10 µ g di proteina per macchiarsi occidentale) in nuove microprovette.
- Mettere le microprovette su un blocco di calore alle proteine 95 ° C e far bollire in 1x tampone di gel-caricamento SDS (100 mM Tris-HCl a pH 6.8, bromofenolo 200 mM dithiothreitol, 4% SDS, 0,2%, 20% glicerolo) per 5 min.
- Centrifugare le microprovette per 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. raccogliere i surnatanti in nuove microprovette per rimuovere le frazioni insolubili.
- Analizzare le proteine risolte nel passaggio 4.6 (2 µ g) di SD-pagina standard.
- Visualizzare le bande proteiche dall'argento che macchia usando la macchiatura d'argento kit in seguito il produttore ' protocollo s.
- Analizzare le proteine risolte nel passaggio 4.6 (10 µ g) di SD-pagina standard e il Western blotting. Utilizzare il reagente (SA-HRP) per il produttore ' s protocollo e visualizzare da fluorography.
5. In Vitro Ricostituzione di ERAD ubiquitinazione di bOVA usando purificato microsomi
- trasferimento purificato microsomi (5-10 µ g di proteine) dal passaggio 3.8 con un 50% del volume del reticulocyte lysato (RL), 1 x tampone di reazione (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl 2) e 12:02 ubiquitina etichetta a bandiera in una nuova microprovetta. Il volume finale di questo esperimento è 20-40 µ l.
- Incubare la provetta per 2 ore a 37 ° C.
Nota: Se la quantità di bOVA ubiquitinata nel passaggio 5.12 è troppo piccola per rilevare mediante Western blotting, aggiungere 10 µM di MG132 o 2 µM di lactacistina per inibire l'elaborazione di bOVA l'ubiquitinate da proteosomi. - Fermare la reazione inserendo nella microprovetta su ghiaccio.
- Risolvere i microsomi aggiungendo 500 µ l di tampone TNE con volume di 1/1.000 di cocktail di inibitore di proteasi.
- Centrifugare la provetta per 10 min a 21,500 x g e a 4 ° C. raccogliere i surnatanti in una nuova microprovetta per rimuovere le frazioni insolubili, che contengono ubiquitinate bOVA in DC2.4 prima del dosaggio di ubiquitinazione in vitro.
- Trasferire il surnatante ad una nuova microprovetta e aggiungere volume 1/100 di nuove perline SA-magnetico (solitamente 5 µ l per 500 µ l di surnatanti).
- Delicatamente mescolare bene e ruotarlo nella microprovetta lentamente per 30 min a 4 ° C.
- Centrifugare la provetta per 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. scartare il surnatante dall'aspirazione a recuperare la bOVA e bOVA ubiquitinate associato con i branelli magnetici SA.
- Lavare due volte i branelli magnetici SA raccolti con 1 mL di tampone TNE mediante centrifugazione per 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. scartare il supernatante ogni volta dall'aspirazione.
- Bollire i branelli magnetici SA in 1x tampone per 5 min a 95 ° C su un calore-blocco per risolvere le proteine purificate mediante i branelli magnetici SA di caricamento del gel di SDS.
- Centrifugare la provetta per 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. raccogliere i surnatanti in una nuova microprovetta per rimuovere le frazioni insolubili.
- Analizzare i branelli magnetici SA vincolati alle proteine standard SD-PAGE e Western blotting. L'uso di anticorpi (Anti-Flag, anti-multi-Ub e anti-mouse IgG-HRP) e il reagente (SA-HRP) è per il produttore ' protocollo s e visualizzate da fluorography.
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Representative Results
Per delucidare il meccanismo molecolare di CP, è necessario identificare i compartimenti cellulari, dove antigeni esogeni subiscono ERAD-come trasporto e la lavorazione. Mentre le osservazioni da microscopia di immunofluorescenza o da microscopia elettronica identificato il compartimento cellulare dove antigeni esogeni accumulato16,17,18,19, 30,31,32,33, i compartimenti cellulari per ERAD-come elaborazione di antigeni esogeni non sono chiaramente definiti. Recentemente è stato indicato che gli endosomi Tronchetti con molecole residente ER erano responsabili per CP34, ma questi compartimenti cellulari erano non purificati. La difficoltà di isolare e purificare i compartimenti cellulari può essere attribuita al fatto che gli antigeni esogeni sono localizzati sia nel endosoma ed ER-come compartimenti e che non vi è nessuna molecola identificazione per questi compartimenti endocitico altro di antigeni esogeni. Tuttavia, la condizione di antigeni esogeni in fase di trasporto ERAD-come è diversa dallo stato stazionario; il trasporto attraverso la membrana lipidica a bimolecolare, antigeni esogeni penetrano nella membrana tramite translocons, come Sec61 (Figura 2A). Quindi, quando si utilizza bOVA come un antigene esogeno, bOVA dovrebbe essere associata con Sec61. Poiché associata di membrana bOVA specificamente legato con SA, il microsoma preparato da DC2.4, che è stato pretrattato con bOVA, potrebbe essere isolato distintamente da SA-magnetico Perline (Figura 2A). Quindi gli importi equivalenti di proteine dai microsomi purificate con o senza pre-incubazione di bOVA sono stati risolti da SDS-PAGE seguita dalla macchiatura d'argento e Western blotting con SA-HRP (Figura 2B, 2C). Come mostrato in Figura 2e Figura 2B , microsomi del isolato conteneva diverse proteine uniche che sono state purificate dipendono esogenicamente aggiunto bOVA e biglie magnetiche-SA. Oltre a queste proteine uniche, microsomi isolati conteneva anche proteine non specifiche, che associato a SA-magnetico perline con o senza bOVA. Trattamento del microsoma con tripsina prima purificazione dal magnete ha impedito la purificazione dei microsomi (Figura 2D), che indica che i metodi di purificazione dipendeva dalla presenza di membrana-penetrante bOVA.
I microsomi purificate ha mostrato la capacità di ubiquitinate lo bOVA incorporato in vitro, in presenza di RLs (Figura 3A). Gli importi di bOVA e bOVA di poli-ubiquitinate sono stati aumentati in presenza di MG132 (Figura 3B), che indica che il bOVA incorporato è stato elaborato dal sistema ERAD e che nostra purificate microsomi contenevano proteine macchinari ERAD.
Figura 1: vie intracellulari per CP nella DCs. In DCs, antigeni esogeni vengono trasportati in compartimenti endocitosi non-classica, che contengono anche molecole ER-residente oltre alle molecole dell'endosoma tardo classica. In questo comparto, antigeni esogeni vengono esportati nel citosol attraverso translocons come Sec61. Nel citosol, antigeni esogeni sono trasformati dal sistema ubiquitina-proteasoma in peptidi antigenici come substrati ERAD. Peptidi antigenici sono trasportati in compartimenti endocitico Tronchetti stessi o adiacenti, o adiacente ER attraverso il trasportatore TAP e poi caricato su MHC I molecole da PLC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: purificazione dei microsomi con bOVA che subiscono ERAD. (A), A modello schematico di purificazione dei microsomi con bOVA che subiscono ERAD. bOVA è associato con la membrana attraverso il Traslocone Sec61 e mirati con perline SA-magnetiche. Microsomi (B) con (+) o senza (-) previa aggiunta di bOVA sono stati purificati con (+) o senza (-) SA-magnetico perline. Proteine (2 µ g) o i volumi corrispondenti delle proteine purificate sono state risolte il 7,5-15% SDS-PAGE, e macchiatura d'argento è stata usata per prevedere fasce della proteina. Triangoli a destra indicano non specifiche proteine leganti ai talloni SA-magnetico. Triangoli con asterischi indicano uniche proteine che si trovano solo in presenza di bOVA esogenicamente aggiunto e sfere SA-magnetiche. La freccia indica bOVA. Microsomi (C) con (+) o senza (-) previa aggiunta di bOVA sono stati purificati con (+) o senza (-) SA-magnetico perline. Proteine (10 µ g) o i volumi corrispondenti delle proteine purificate erano risolti su 7,5-15% SDS-PAGE e sottoposti a Western blotting con SA-HRP. P.N.: frazione post-nucleare. L'asterisco a destra fasce non specifiche con SA-HRP. Risultati equivalenti sono stati raggiunti da almeno tre saggi indipendenti. Microsomi (D) con previa aggiunta di bOVA sono stati purificati con perline SA-magnetiche. Microsomi sono stati trattati con (+) o senza (-) tripsina e TX-100 prima purificazione (due corsie a sinistra) o dopo la purificazione (destra due corsie). Proteine (2 µ g) o i volumi corrispondenti delle proteine purificate sono state risolte il 7,5-15% SDS-PAGE, e macchiatura d'argento è stata usata per prevedere fasce della proteina. Triangoli a destra indicano non specifiche proteine leganti ai talloni SA-magnetico. Triangoli con asterischi indicano uniche proteine che si trovano solo in presenza di bOVA esogenicamente aggiunto e sfere SA-magnetiche. Risultati equivalenti sono stati raggiunti da almeno tre saggi indipendenti. Ristampato con il permesso di riferimento28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: In Vitro la ricostituzione di elaborazione e ubiquitinazione utilizzando ovuli nei microsomi purificato. (A) depurata microsomi con (+) o senza (-) previa aggiunta di bOVA sono stati trattati con (+) o senza (-) RL e bandiera-Ub per 1 h ed erano solubilizzati utilizzando TNE. bOVA è stato purificato con perline SA-magnetiche e sottoposti a Western blotting con anticorpi indicati. L'asterisco a destra fasce non specifiche con SA-HRP. Risultati equivalenti sono stati raggiunti da almeno tre saggi indipendenti. (B) depurata microsomi sono stati trattati con (+) o senza (-) RL, bandiera-Ub e MG132 per 1 h e quindi erano solubilizzati utilizzando TNE. bOVA è stata purificata con perline SA-magnetiche e sottoposto a macchiarsi occidentale con SA-bandiera. L'asterisco a destra fasce non specifiche con SA-HRP. Risultati equivalenti sono stati raggiunti da almeno tre saggi indipendenti. Ristampato con utorizzazionin da riferimento28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Negli studi precedenti di CP, gli antigeni esogeni incorporati accumulato nell'area riservata del tardo endosoma o ER da microscopia immunofluorescente16,30,31,32. Si stima che ERAD-come trasporto e la lavorazione di antigeni esogeni sono effettuate in queste aree specialistiche dell'ER o endosoma tardivo, come il compartimento cellulare è stato identificato da saccarosio o centrifugazione su gradiente di densità iodixanol utilizzando ubiquitinate bOVA come marker di elaborazione ERAD-come. Dopo stimolando la loro immunità innata, efficienza di CP ha aumentato significativamente e la frazione di picco per bOVA insieme ubiquitinate bOVA migrati ad un' più alta frazione di densità (nostri dati non pubblicati). Gli obiettivi di questi esperimenti erano di identificare marcatori molecolari specifici per l'ER o endosoma tardivo, che migrarono insieme a bOVA o ubiquitinate bOVA. Ma nei risultati, sia molecole residente ER e tardi endosoma residente molecole migrarono insieme alla bOVA e ubiquitinate bOVA, che indica che questi esperimenti erano infruttuosi nell'accertare il compartimento cellulare per ERAD-come trasporto e l'elaborazione come la classica ER o endosoma tardivo. In questi esperimenti, non c'erano nessun specifiche molecole nei compartimenti endocitotico tranne bOVA o ubiquitinate bOVA. Tuttavia, mentre l'antigene esogeno ha subito ERAD-come trasporto, queste molecole hanno penetrato la membrana lipidica a doppio strato di ER attraverso translocons, come Sec61 complesso (Figura 1, Figura 2A). La membrana che attacca bOVA è stata selezionata come un indicatore dei compartimenti endocitosi e microsomi sono stati purificati dal SA-magnetico Perline (Figura 2A, 2B). In questi microsomi purificate, bOVA accumulato è imbattuto ERAD-come ubiquitinazione e trasformazione sotto la presenza di ATP e RL in vitro (Figura 3A, 3B). Poiché RL contiene tutti gli apparati molecolari citosolico, quali molecole correlate ubiquitinazione e proteosomi oltre a molecole per la traduzione e trascrizione, l'aggiunta di RL consente ubiquitinazione di bOVA nel microsoma purificato. Questi risultati indicano che purificati microsomi erano i compartimenti cellulari oggettivi per ERAD-come trasporto e la lavorazione di antigeni esogeni, entrambi contenenti endosoma specifiche molecole e molecole ER-residente allo stesso tempo; LAMP1 ha mostrato sia precursore e forme mature nel microsoma purificato.
Questo protocollo è dipende la quantità di antigeni esogeni membrana-penetrante; è importante integrare abbastanza degli antigeni esogeni alle cellule DC2.4, che mostra un'elevata capacità di incorporare antigeni esogeni nello stato semi-confluente. Allungando il tempo di incubazione di 6-12 h per DC2.4 con bOVA aumenta la quantità di bOVA incorporato. L'aggiunta di inibitori per proteosomi, MG132 o lactacistina, moderatamente aumenta la quantità di microsomi purificate. La preparazione del microsoma è una delle fasi più critiche per questo protocollo. Il bOVA gratuito, che non è incorporato nelle cellule DC2.4, dovrebbe essere rimosso lavando le cellule con PBS, per evitare che il legame non specifico della bOVA gratis alla frazione del microsoma. Per ridurre danni su compartimenti di membrana, le cellule sono attentamente interrotte dall'omogeneizzatore lisata in acqua con ghiaccio. Quindi i nuclei e ininterrotta delle cellule sono stati rimossi mediante centrifugazione come i microsomi sono stati preparati dalla frazione post-nucleare. Dopo la preparazione dei microsomi, One-Step purificazione dai branelli magnetici SA è effettuata. In questo passaggio, attento lavaggio del microsoma magnete legato è necessario rimuovere il legame non specifico di altri compartimenti cellulari e per non perdere il microsoma specificamente associato.
In questo metodo di purificazione di un passo, una percentuale significativa del microsoma di destinazione è necessaria. Se il rapporto tra il microsoma oggettivo è troppo piccolo, diminuisce la quantità di microsoma destinazione purificata dalla concorrenza con legame non specifico di altri compartimenti cellulari. Di conseguenza, in queste condizioni, arricchimenti del microsoma di destinazione e la clearance del microsoma aspecifici sarebbe stato necessario. È anche possibile introdurre ulteriori passaggi prima di purificazione dai branelli magnetici SA. Un tale passo è il saccarosio o iodixanol densità centrifugazione su gradiente del microsoma. Poiché i microsomi preparati contengono tutti i prodotti di membrana, potrebbe essere possibile arricchire il microsoma di destinazione prima di purificazione di perline SA-magnetico selezionando le frazioni ricche di antigene per la purificazione. Un altro passo possibile è la pre-clearance del microsoma di controllo magnetico perline senza SA, per ridurre le associazioni non specifica di fondo dei microsomi contro biglie magnetiche-SA. In questi esperimenti, entrambi i passaggi migliorata la purezza del microsoma destinazione in modo efficace, ma ha diminuito la quantità totale di prodotti purificati, che indica che questi passaggi aggiuntivi sono selezionati come mezzo per ulteriori esperimenti.
È ben noto che centrifugazione ad alta velocità è stato indicato per causare la fusione o la coagulazione delle vescicole intracellulari. Queste fusioni o clottings produrrà microsomi artificiali, che sono derivati dall'interazione tra diversi tipi di vescicole organello-derivato non specifici. Questi artificiali microsomi contengono statisticamente ogni molecola di membrana come la molecola residente mitocondriale, molecola residente apparato di Golgi, ecc. Questi microsomi purificate non hanno incluso la proteine residenti caveosome, apparato di Golgi proteine residenti o residenti endosoma proteine precoci, quali caveolin1, GM130 ed EEA1, che indica che i microsomi SA-purificato non sono prodotti artificiali deriva dalla fusione tra diversi tipi di vescicole. Senza la centrifugazione ad alta velocità, bOVA-attaccare le vescicole sono state isolate, ma gli esperimenti di controllo dalle vescicole senza bOVA ha mostrato una maggiore quantità di molecole non specifici. Ciò indica che questo metodo preliminare è insufficiente per esperimenti successivi e che il passo di centrifugazione ad alta velocità è necessario per questo protocollo di purificazione.
Il presente protocollo si applica ad altri tipi di cella, ad esempio diverse sottopopolazioni di DC o altri APCs. È anche possibile utilizzare i vari tipi di antigeni esogeni in condizioni diverse, come ad esempio proteine fluorescenti, complesso antigene-anticorpo, perline associati antigeni, ecc. Inoltre, noi possiamo purificare microsomi di destinazione utilizzando anticorpi specifici contro gli antigeni esogeni. Anche se parecchi passaggi aggiuntivi o modifiche potrebbero essere necessario per applicare questo protocollo ad altre cellule e antigeni, esso può delucidare i meccanismi molecolari del proteasoma-dipendente CP confrontando le molecole purificate tra diversi esperimenti. Così, il protocollo descritto ha camera per la modifica e miglioramento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da Takasaki Università di salute e del benessere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
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