Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Rensing av membran kupé for endoplasmatiske retikulum-assosiert nedbrytning av eksogene antigener i Cross-presentasjon

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55949
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

Summary

Metoden beskrevet her er en ny vesicle isolasjon protokoll, som gjør det mulig for rensing av mobilnettet seksjonene der eksogene antigener behandles av endoplasmatiske retikulum-assosiert degradering av kryss-presentasjon.

Abstract

Dendrittiske celler (DCs) er svært kan presentere internalisert eksogene antigener ved store histocompatibility klasse (MHC) jeg molekyler også kjent som cross-presentasjon (CP). CP spiller en viktig rolle ikke bare i stimulering av naiv CD8+ T celler og minne CD8+ T celler smittsomme og svulst immunitet men også i inaktivering av selvstendig fungerende naiv T celler av T celle anergy eller T celle sletting. Selv om kritiske molekylær mekanisme CP gjenstår å bli belyst, indikerer samler bevis at eksogene antigener behandles gjennom endoplasmatiske retikulum-assosiert degradering (ERAD) etter eksport fra ikke-klassiske endocytic rom. Inntil nylig var characterizations av endocytic seksjonene begrenset fordi det var ingen spesifikke molekylære markører enn eksogene antigener. Metoden beskrevet her er en ny vesicle isolasjon protokoll, som gjør det mulig for rensing av endocytic seksjonene. Bruker denne renset microsome, rekonstituert vi ERAD som transport, ubiquitination, og behandlingen av ytre antigen i vitro, antyder at ubiquitin-proteasome systemet behandlet eksogene antigen etter eksport fra dette mobilnettet rommet. Denne protokollen kan brukes videre til andre celletyper å avklare molekylær mekanisme CP.

Introduction

MHC jeg molekyler er uttrykt på overflaten av alle kjerne celler, med kort antigen peptider fra endogene antigener, som behandles av ubiquitin-proteasome systemet i stoffer1. Etter prosessering transporteres antigen peptider i det endoplasmatiske retikulum (ER)-lumen med den peptid transporter trykk. I ER lumen, en rekke spesifikke chaperones hjelper peptid lasting og riktig folding av MHC jeg komplekse. Denne serien av molekyler kalles peptid-lasting komplekset (PLC), indikerer at ER en sentral avlukke for peptid lasting på MHC jeg2. Etter peptid lasting, MHC jeg molekyler transporteres til celleoverflaten og spiller en viktig rolle i det adaptive immunsystemet som selv markører og aktiverer CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) å oppdage kreftceller eller smittsomme stoffer av antigen peptider fra ikke-selv proteiner3.

I antigen presentere celler (APC), antigen peptider fra eksogene antigener er også presentert på MHC jeg4,5,6,7,8 via CP, som gjennomføres hovedsakelig ut av DCs9,10,11. CP er viktig både for aktivering av naiv CD8+ T celler og minne CD8+ T celler til anti-smittsomme og anti-tumoral CTLer12,13, og i vedlikehold av immun toleranse av inaktivere av selv fungerende naiv T celler14,15. CP spiller mange viktige roller i det adaptive immunsystemet, men de molekylære mekanismene av CP har ennå å bli beskrevet i detalj. Tidligere studier av CP avslørte at eksogene antigener ble lokalisert både ER og endosome og ble behandlet av ERAD, antyder at eksogene antigener transporteres fra endosome til ER for ERAD-lignende behandling og peptid lasting16 . Imidlertid indikerer samler bevis at peptid lasting av CP utføres ikke i ER men i ikke-klassiske endocytic avdelinger, som også har karakteristiske trekk ved de ER (figur 1)17,18 ,19,20,21. For å unngå nedbrytning av antigen peptid forløpere av den høye aktiviteten til aminopeptidase oppstår22 i stoffer, behandling og peptid lasting i CP i det proksimale området av ikke-klassiske endocytic seksjonene (figur 1). Karakteristikkene av endocytic seksjonene er kontroversielle, finnes det ingen eksisterende bestemt molekyler enn eksogene antigener i dette rommet.

ERAD er en mobilnettet sti, som spesielt fjerner misfolded proteiner fra ER. I ERAD veien, misfolded proteiner retrogradely transportert gjennom ER membran til cytoplasma og behandles av ubiquitin-proteasome systemet23,24,25. Når store molekyler, som proteiner, transporteres gjennom lipid bilayer, disse molekylene passere en molekylær apparater kalt en translocon, som Sec61 kompleks og Derlin i ER26, og Tom komplekse og Tim kompleks i den mitokondrier27. Når exogenously-lagt antigener transporteres gjennom ER membran, må de trenge lipid bilayer i kompleks med translocons, som Sec61 komplekset. Metoden beskrevet her renset målrettet vesicle ved å benytte disse membran-gjennomtrengende molekyler som markører for endocytic seksjonene.

Metoden beskrevet her er en ny vesicle rensing protokollen bruker i DC-like cellen linje DC2.428 og biotinylated ovalbumin (bOVA) som et eksogene antigen. Endocytic seksjonene ble renset ved streptavidin (SA)-magnetiske perler med membran-gjennomtrengende bOVA som en maker. I denne renset microsome, noen exogenously lagt bOVA ble bevart i membranen fraksjoner, men ble transportert til utsiden av microsome, og deretter ubiquitinated og behandlet i vitro29. Denne renset microsome inneholdt ikke bare endocytic rom-spesifikke proteiner, men også ER-resident proteiner ERAD og peptid lasting sammensatt; antyder at mobilnettet rommet er potensielle endocytic batterirommet CP29. Denne protokollen er ikke avhengig av hva slags eksogene antigener, og gjelder også for andre DC delsett og andre celletyper, som makrofager, B-celler og endotelceller, å avklare presise molekylære mekanismen av DCs for dyktige CP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voksende celler og tillegg av eksogene antigener

  1. forberede bOVA bruker en biotin protein merking kit etter produsenten ' s protokollen.
    Merk: Vanligvis bOVA inneholder 2 M biotin per 1 M OVA gjennomsnittlig.
  2. Vokser DC2.4 celler i RPMI-1640 supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvate, 0,1 mM unødvendige aminosyrer, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 55 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) og 10% fosterets kalv serum (senere RPMI) på 37 ° C i 5 % CO 2 i en fuktet inkubator (heretter uten nevne, celler er ruges ved denne tilstanden). Det er også mulig å bruke DMEM med 10% fosterets kalv serum, 3,7 finans NaHCO 3 (senere DMEM) i stedet for RPMI.
  3. En dag før rensing, dele cellene i RPMI til 1 x 10 5 celler/mL i en vev kultur plate. Unngå å holde cellene i en confluent tilstand. Dc2.4 celler kan svært innlemme eksogene antigener før en semi confluent staten, men raskt miste muligheten til etter å ha nådd en over confluent stat.
  4. Før DC2.4 cellene semi confluent, legge til 250 µg/mL bOVA for 1 x 10 6 celler/mL og ruge for 2-4 h.
    Merk: Under nedstrøms eksperimenter, alle buffere og reagenser holdes på 4 ° C med mindre annet er angitt.

2. Utarbeidelse av Microsomes

  1. høste DC2.4 cellene av mild pipettering fra vev platen i en ny 50 mL konisk tube.
  2. Sentrifuge 1000 x g for 5 min, 4 ° C og fjern forsiktig mediet med bOVA av aspirasjon.
  3. Vask DC2.4 cellene to ganger med 40 mL PBS buffer (1.37 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) med sentrifugering 1000 x g i 5 min, 4 ° C og forkaste nedbryting hver gang av aspirasjon.
  4. Resuspend pellets i trinn 2.3 i 1-2 mL (1/20-1/10 volum av kultur medium) homogenisering medium (0,25 M sukrose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) med 1/1000 volumet av protease hemmer cocktailer og overføring av resuspended DC2.4 celler i en iskald Dounce homogenizer.
  5. Forstyrre resuspended DC2.4 cellene forsiktig av 10-20 slag med det iskalde Dounce-homogenizer.
    Merk: Under avbrudd trinn, Dounce homogenizer er avkjølt på ice.
  6. Overføre celle-forstyrret suspensjon til en ny 15 mL konisk tube.
  7. Legge til 8-9 mL homogenisering medium 10 mL totalt og sentrifuge konisk røret i 10 min 2000 x g og 4 ° C.
  8. Overføre nedbryting til en ny 15-mL konisk tube fjerne ubrutt celler og kjerner og sentrifuge konisk røret for 10 min 2000 x g og 4 ° C.
  9. Overføre nedbryting til en ny ultracentrifugation rør og sentrifuge for 45 min på 100.000 x g og 4 ° C.
  10. Sug opp nedbryting og resuspend pellet forsiktig i 1-2 mL av homogenisering medium med 1/1000 volum protease hemmer cocktailer av pipettering løsningen opp og ned flere ganger for å gjøre en microsome brøkdel for nedstrøms eksperimenter.
  11. Overføre microsome brøken til en ny 5-mL runde bunnen tube.
    Merk: Etter dette trinnet, er det mulig å berike objektive microsomes ved iodixanol tetthet gradert sentrifugering ifølge produsenten ' s-protokollen, fjerne ikke-spesifikk microsomes. Topp fraksjoner for eksogene antigener er samlet og deretter utsatt for neste trinn i rensing (trinn 3).

3. Rensing av Microsomes med bOVA gjennomgår ERAD

  1. Legg til 1/100 volumet av frisk SA-magnetiske perler til microsome brøk trinn 2.11 i 5 mL rundt bunnen tube.
    Merk: Før dette trinnet er det mulig å fjerne pre microsome brøkdel av kontroll-magnetiske perler å redusere forurensing av uspesifisert microsomes.
  2. Forsiktig bland godt og rotere rundt bunnen røret sakte for 30 min på 4 ° C.
  3. Legge 2-3 mL homogenisering medium til 4 mL totalt i runde bunnen røret og forsiktig blandingen.
  4. Sett rundt bunnen røret på en magnetisk stand og Inkuber i 10 min på 4 ° C. Siden perlene bundet til blemmer er tiltrukket av magneten, brun mikro-perler vil gradvis samle seg på røret veggen nærmest magneten.
  5. Med røret igjen i magnetiske standen, nøye forkaste supernatants av aspirasjon fjerne ubundet blemmer.
  6. Vask de magnetiske perlene bundet til blemmer to ganger med 5 mL av homogenisering medium ved de stå i 10 min på 4 ° C og kast nedbryting hver gang ved nøye aspirasjon.
    Merk: Uten magnetisk stativet, rensing av centrifugations 2000 x g for 10 min, 4 ° C er også tilgjengelig.
  7. Resuspend de magnetiske perlene bundet til blemmer nøye i 100 µL homogenisering medium ved pipettering løsningen opp og ned flere ganger.
  8. Overføre resuspended blemmer i en ny microtube som den renset microsome for nedstrøms eksperimenter.
    Merk: Vanligvis 50 µL microsome brøkdel som inneholder 5-20 µg proteiner fra 1 x 10 7 celler kan isoleres.

4. Analyse av det renset Microsomes

  1. Resuspend den magnetiske perler bundet til blemmer fra trinn 3.8 for 100-200 µL TNE bufferen (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) med 1/1000 volum protease hemmer cocktailer i stedet for homogenisering medium.
  2. Overføring av lysate fra trinn 4.1 til en ny 1.5-mL microtube.
  3. Bestemme protein konsentrasjonen av trinn 4.2 ved hjelp av en BCA analysen kit per produsenten ' s protokollen.
    Merk: Vanligvis 5-10 µL lysate fra trinn 4.2 er nok til å bestemme protein konsentrasjonen.
  4. Overføre den lysate fra trinn 4.2 (2 µg protein til sølv farging og 10 µg protein for vestlige blotting) til nye microtubes.
  5. Sette i microtubes på varme blokk på 95 ° C og kok proteiner i 1 x SDS gel-lasting buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM dithiothreitol, 4% SDS, 0,2% bromophenol blå, 20% glyserol) for 5 min.
  6. Sentrifuge microtubes i 10 min 21,500 x g og 4 ° C. samle supernatants i nye microtubes fjerne uløselig fraksjoner.
  7. Analysere løst proteiner i trinn 4.6 (2 µg) av SD-STANDARDSIDEN.
  8. Effekter protein band av sølv flekker bruker sølv flekker kit etter produsenten ' s protokollen.
  9. Analyserer løst proteinene i trinn 4.6 (10 µg) for standard SD-side og vest-blotting. Bruke reagensen (SA-HRP) per produsenten ' s protokollen og visualisere ved fluorography.

5. In Vitro Rekonstituering av ERAD Ubiquitination av bOVA bruker renset Microsomes

  1. overføring av renset microsomes (5-10 µg protein) fra trinn 3.8 med 50% volum av retikulocytt lysate (RL), i 1 x reaksjon buffer (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl 2), og 0 2 pM flagg-merket ubiquitin i en ny microtube. Siste bind i dette eksperimentet er 20-40 µL.
  2. Incubate microtube for 2t på 37 ° C.
    Merk: Hvis mengden ubiquitinated bOVA i trinn 5,12 er for liten til å oppdage ved Western blotting, legge til 10 µM av MG132 eller 2 µM av lactacystin å hemme behandlingen av ubiquitinated bOVA ved proteasomes.
  3. Stoppe reaksjonen ved å plassere microtube på ice.
  4. Løse microsomes ved å legge 500 µL TNE buffer med 1/1000 volum protease hemmer cocktailer.
  5. Sentrifuge microtube for 10 min på 21,500 x g og 4 ° C. samle supernatants i en ny microtube fjerne uløselig fraksjoner, som inneholder ubiquitinated bOVA i DC2.4 før i vitro ubiquitination analysen.
  6. Overføre nedbryting til en ny microtube og legge til 1/100 volumet av nye SA-magnetiske perler (vanligvis 5 µL for 500 µL av supernatants).
  7. Forsiktig bland godt og rotere microtube sakte for 30 min på 4 ° C.
  8. Sentrifuge microtube i 10 min 21,500 x g og 4 ° C. Forkast nedbryting av aspirasjon å gjenopprette bOVA og ubiquitinated bOVA bundet med SA-magnetiske perler.
  9. Vask dobbelt samlet SA-magnetiske perler med 1 mL av TNE buffer med sentrifugering i 10 min 21,500 x g og 4 ° C. Forkast nedbryting hver gang av aspirasjon.
  10. Koke SA-magnetiske perler i 1 x SDS gel lasting bufferen for 5 min på 95 ° C på varme-blokk løse renset proteiner ved SA-magnetiske perler.
  11. Sentrifuge microtube i 10 min 21,500 x g og 4 ° C. samle supernatants i en ny microtube fjerne uløselig fraksjoner.
  12. Analyserer SA-magnetiske perler bundet til proteiner ved standard SD-side og vest-blotting. Bruk av antistoffer (anti-flagg, anti-multi-Ub og anti-musen IgG-HRP) og reagens (SA-HRP) er per produsenten ' s-protokollen og visualisert ved fluorography.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å belyse molekylær mekanismen av CP, er det nødvendig å identifisere mobilnettet seksjonene, der eksogene antigener gjennomgå ERAD-lignende transport og behandling. Mens observasjoner av immunofluorescent mikroskopi eller elektronmikroskop identifiserte mobilnettet rommet hvor eksogene antigener akkumulert16,17,18,19, 30,31,32,33, mobilnettet seksjonene for ERAD-lignende behandling av eksogene antigener er ikke klart definert. Nylig ble det vist at ikke-klassiske endosomes med ER bosatt molekyler var ansvarlig for CP34, men mobilnettet seksjonene var urenset. Vanskeligheten i isolere og rensende mobilnettet seksjonene kan tilskrives det faktum at eksogene antigener er lokalisert både i endosome og ER-lignende rom og at det finnes ingen identifiserende molekyl for endocytic seksjonene enn eksogene antigener. Tilstanden til eksogene antigener gjennomgår ERAD-lignende transport er imidlertid forskjellig fra steady state; i transport over lipid resultatet av dette membran, eksogene antigener trenge membranen via translocons, som Sec61 (figur 2A). Dermed når du bruker bOVA som et eksogene antigen, bør bOVA være knyttet til Sec61. Siden membran-assosiert bOVA spesielt bundet med SA, kan microsome forberedt fra DC2.4, som var forbehandlet med bOVA, være isolert utpreget av SA-magnetiske perler (figur 2A). Deretter ble tilsvarende mengder av proteiner fra renset microsomes med eller uten pre-inkubering av bOVA løst av SDS side etterfulgt av sølv flekker og vestlige blotting med SA-HRP (figur 2B, 2 C). Som vist i figur 2B og figur 2C, inneholdt de isolerte microsomes flere unike proteiner som ble renset avhengig exogenously lagt bOVA og SA-magnetiske perler. I tillegg til disse unike proteiner inneholdt isolerte microsomes også uspesifikke proteiner, som bundet til SA-magnetiske perler med eller uten bOVA. Behandling av microsome med trypsin før rensing av magnet forhindret rensing av microsomes (figur 2D), som angir at metodene rensing avhengig av tilstedeværelsen av membran-gjennomtrengende bOVA.

De renset microsomes viste muligheten til å ubiquitinate den innlemmet bOVA i vitrounder tilstedeværelsen av RLs (figur 3A). Mengden bOVA og poly-ubiquitinated bOVA ble utvidet i nærvær av MG132 (figur 3B), som indikerer at den innlemmet bOVA ble behandlet av ERAD systemet og at våre renset microsomes inneholdt ERAD maskiner proteiner.

Figure 1
Figur 1: intracellulær trasé for CP i DCs. I DCs, er eksogene antigener transportert inn ikke-klassiske endocytic avdelinger, som også inneholder ER-resident molekyler i tillegg til molekyler av den klassiske sen endosome. I dette rommet eksporteres eksogene antigener i stoffer gjennom translocons som Sec61. I stoffer behandles eksogene antigener av ubiquitin-proteasome systemet i antigen peptider som ERAD underlag. Antigen peptider transporteres i samme eller nærliggende ikke-klassiske endocytic avdelinger eller tilstøtende ER gjennom trykk transporter og deretter lastet på MHC jeg molekyler av PLC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: rensing av Microsomes med bOVA gjennomgår ERAD. (A) A skjematisk modell av rensing av microsomes med bOVA gjennomgår ERAD. bOVA er forbundet med membran gjennom Sec61 translocon og målrettet med SA-magnetiske perler. (B) Microsomes med (+) eller uten (-) før tillegg av bOVA var renset med (+) eller uten (-) SA-magnetiske perler. Proteiner (2 µg) eller tilsvarende mengder renset proteiner ble løst på 7,5-15% SDS-side, og sølv flekker ble brukt til å visualisere protein band. Trekanter til høyre angir uspesifikke proteiner binding til SA-magnetiske perler. Trekanter med stjernene angir unik proteiner som finnes bare i nærvær av exogenously ekstra bOVA og SA-magnetiske perler. Pilen viser bOVA. (C) Microsomes med (+) eller uten (-) før tillegg av bOVA var renset med (+) eller uten (-) SA-magnetiske perler. Proteiner (10 µg) eller tilsvarende mengder renset proteiner ble løst på 7,5-15% SDS-side, og utsatt for Western blotting med SA-HRP. P.N.: post-kjernefysiske brøkdel. Stjernene i høyre angir uspesifisert band med SA-HRP. Tilsvarende resultater ble oppnådd ved minst tre uavhengige analyser. (D) Microsomes tidligere tillegg til bOVA var renset med SA-magnetiske perler. Microsomes ble behandlet med (+) eller uten (-) trypsin og TX-100 før rensing (venstre to baner) eller etter rensing (rett to baner). Proteiner (2 µg) eller tilsvarende mengder renset proteiner ble løst på 7,5-15% SDS-side, og sølv flekker ble brukt til å visualisere protein band. Trekanter til høyre angir uspesifikke proteiner binding til SA-magnetiske perler. Trekanter med stjernene angir unik proteiner som finnes bare i nærvær av exogenously ekstra bOVA og SA-magnetiske perler. Tilsvarende resultater ble oppnådd ved minst tre uavhengige analyser. Gjengitt med tillatelse fra referanse28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: In Vitro rekonstituering av behandling og Ubiquitination bruker OVA i renset Microsomes. (A) Purified microsomes med (+) eller uten (-) før tillegg av bOVA ble behandlet med (+) eller uten (-) RL og flagg-Ub 1t og var solubilized bruker TNE. bOVA var renset med SA-magnetiske perler og utsatt for Western blotting med angitte antistoffer. Stjernene i høyre angir uspesifisert band med SA-HRP. Tilsvarende resultater ble oppnådd ved minst tre uavhengige analyser. (B) Purified microsomes ble behandlet med (+) eller uten (-) RL flagg-Ub og MG132 1t og ble deretter solubilized bruker TNE. bOVA var renset med SA-magnetiske perler og utsatt for vestlige blotting med SA-flagg. Stjernene i høyre angir uspesifisert band med SA-HRP. Tilsvarende resultater ble oppnådd ved minst tre uavhengige analyser. Gjengitt med permission fra referanse28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I tidligere studier av CP akkumulert innarbeidet eksogene antigener i begrensede området av sen endosome eller ER ved immunofluorescent mikroskopi16,30,31,32. Det er anslått at ERAD-lignende transport og behandling av eksogene antigener er gjennomført i disse spesialiserte områder ER eller sene endosome, som cellular rommet ble identifisert av sukrose eller iodixanol tetthet gradert sentrifugering bruker ubiquitinated bOVA som en ERAD-lignende behandling markør. Stimulere deres medfødt immunitet, CP effektiviteten betydelig økt og topp brøken for bOVA sammen med ubiquitinated bOVA overført til en høyere tetthet brøkdel (upubliserte resultatene). Målet for disse eksperimentene var å identifisere bestemte molekylære markører for ER eller sene endosome, som overføres bOVA eller ubiquitinated bOVA. Men i resultatene, både ER bosatt molekyler og sent endosome-resident molekyler overført bOVA og ubiquitinated bOVA, indikerer at disse eksperimentene var mislykket virkningen mobilnettet batterirommet ERAD-lignende transport og behandling som klassisk ER eller sen endosome. I disse forsøkene var det ingen spesifikk molekyler i de endocytotic avdelinger unntatt bOVA eller ubiquitinated bOVA. Men mens eksogene antigen gjennomgikk ERAD som transport, trengt disse molekylene lipid bilayer membran av ER gjennom translocons, som Sec61 kompleks (figur 1, figur 2A). Membranen stikker bOVA ble valgt som en markør av endocytic seksjonene, og microsomes ble renset ved SA-magnetiske perler (figur 2A, 2B). I disse renset microsomes, akkumulerte bOVA kom over ERAD-lignende ubiquitination og behandling under tilstedeværelsen av RL og ATP i vitro (figur 3A, 3B). Siden RL inneholder alle cytosolic molekylær apparati, som ubiquitination-relaterte molekyler og proteasomes i tillegg til molekyler for oversettelse og transkripsjon, kan tillegg av RL ubiquitination av bOVA i renset microsome. Disse resultatene indikerer at renset microsomes var de objektive mobilnettet avdelinger for ERAD-lignende transport og behandling av eksogene antigener, inneholder både endosome-spesifikke molekyler og ER-resident molekyler på samme tid; Lamp1 viste både forløperen og modne formene i den renset microsome.

Denne protokollen er avhengig av mengden av membran-gjennomtrengende eksogene antigener; Det er viktig å inkorporere nok av de ytre antigener DC2.4 celler, som viser en høy evne å innlemme eksogene antigener i semi confluent staten. Elongating 6-12 h inkubasjon tiden for DC2.4 med bOVA øker mengden av innarbeidet bOVA. Tillegg av hemmere for proteasomes, MG132 eller lactacystin, øker moderate mengder renset microsomes. Utarbeidelse av microsome er en av de viktigste trinnene for denne protokollen. Den gratis bOVA, som ikke er innarbeidet i DC2.4 celler, bør fjernes ved å vaske cellene med PBS, å forhindre ikke-spesifikk binding av den gratis bOVA til microsome brøk. For å redusere skader på membran avdelinger, avbrutt celler nøye av Dounce homogenizer i vann. Deretter ble ubrutt celler og kjerner fjernet av sentrifugering som microsomes var forberedt fra post-kjernefysiske brøkdel. Etter forberedelse av microsomes, er ettrinns rensing av SA-magnetiske perler utført. I dette trinnet er forsiktig vask av magnet bundet microsome nødvendig å fjerne uspesifisert binding av andre cellulære avdelinger og å ikke miste det spesielt bundet microsome.

I dette ett skritt rensing metoden er en betydelig andel av mål-microsome nødvendig. Hvis den objektive microsome er for liten, reduseres mengden renset målet microsome av konkurransen med uspesifisert binding av andre cellulære avdelinger. Følgelig under slike omstendigheter enrichments av målet microsome og klarering av ikke-spesifikk microsome ville være nødvendig. Det er også mulig å innføre flere trinn før rensing av SA-magnetiske perler. Et slikt skritt er sukrose eller iodixanol tetthet gradert sentrifugering av microsome. Siden forberedt microsomes inneholder alle membran-produkter, kan det være mulig å berike målet microsome før SA-magnetiske perler rensing ved å velge antigen rik fraksjoner for rensing. En annen mulig trinnet er pre-klarering av microsome av kontroll-magnetiske perler uten SA, å redusere ikke-spesifikke bakgrunnen sammenslutninger av microsomes mot SA-magnetiske perler. I disse eksperimentene, begge trinnene forbedret renheten av målet microsome effektivt, men redusert den totale mengden renset produkter disse trinnene er valgt som betyr ytterligere eksperimenter.

Det er velkjent at høyhastighets sentrifugering har vist seg å forårsake fusion eller clotting av intracellulær blemmer. Disse fusjoner eller clottings produsere kunstig microsomes, som er avledet fra ikke-spesifikk samspillet mellom ulike typer organelle-avledet blemmer. Disse kunstig microsomes inneholder statistisk hver membran molekyl som mitokondrie bosatt molekylet, Golgi apparatet bosatt molekylet, etc. Disse renset microsomes inkluderte ikke den caveosome bosatt proteiner, Golgi apparatet bosatt proteiner eller tidlig endosome-resident proteiner, som caveolin1, GM130 og EEA1, som indikerer at de SA-renset microsomes ikke er kunstige produkter avledet fra fusjon mellom ulike typer blemmer. Uten den høyhastighets sentrifugering, bOVA-stikkende blemmer ble isolert, men de kontroll fra blemmer uten bOVA viste høyere mengder uspesifisert molekyler. Dette angir at denne foreløpige metoden er utilstrekkelig for etterfølgende eksperimenter og at høyhastighets sentrifugering trinnet er nødvendig for denne rensing-protokollen.

Denne protokollen gjelder andre celletyper, for eksempel ulike DC delsett eller andre APCs. Det er også mulig å bruke ulike typer eksogene antigener i ulike forhold, som fluorescerende proteiner, antigen-antistoff kompleks, perler bundet antigener, etc. Videre kan vi rense målet microsomes bruke spesifikke antistoffer mot de ytre antigener. Selv om flere tilleggstrinn eller modifikasjoner kanskje må bruke denne protokollen på andre celler og antigener, kan det belyse molekylære mekanismer av proteasome-avhengige CP ved å sammenligne renset molekylene blant forskjellige eksperimenter. Dermed har beskrevet protokollen rom for endring og forbedring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av Takasaki universitetet av helse og velferd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum Equitech bio SFB30
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine gibco by life technologies 25030-164
Penisicillin-Sreptomycin gibco by life technologies 15140-122
DMEM gibco by life technologies 12100-46
OVA SIGMA A5503
Biotin-protein labelling kit Thermo Fisher Scientific F6347
MG-132 Santa Cruz Biotechnology 201270
lactacystin SIGMA L6785
Dounce homogenizer IUCHI 131703
protease inhibitor cocktails SIGMA P8340
iodixanol Cosmo bio 1114542
SA-magnetic beads New England Biolabs 201270
control magnetic beads Chemagen M-PVA012
magnetic stand BD Biosciences 552311
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23225
silver staining kits Cosmo bio 423413
Reticulocyte Lysate Promega 1730714
Flag-tagged ubiquitin SIGMA U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse) Antibody Shop HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse) MBL D058−3
anti-Flag (mouse) SIGMA F3165
trypsin SIGMA 85450C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
  4. Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
  5. Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
  6. Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
  7. Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
  8. Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
  9. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  10. Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
  11. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  12. Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
  13. Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
  14. Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
  15. Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
  16. Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
  17. Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
  18. Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
  19. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
  20. Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
  21. Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
  22. Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
  23. Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
  24. Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
  25. Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
  26. Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
  27. Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
  28. Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
  29. Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
  30. Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
  31. Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
  32. Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
  33. Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
  34. Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).

Tags

Immunologi problemet 126 dendrittiske celler endoplasmatiske retikulum-assosiert fornedrelse cross-presentasjon store histocompatibility klasse I translocon ubiquitin
Rensing av membran kupé for endoplasmatiske retikulum-assosiert nedbrytning av eksogene antigener i Cross-presentasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imai, J., Otani, M., Sakai, T.,… More

Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation. J. Vis. Exp. (126), e55949, doi:10.3791/55949 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter