Hele-celle strømninger induceret af Puff anvendelse af GABA i hjernen skiver
Summary
Vi beskriver puff teknik, hvormed farmakologiske reagenser kan administreres under hele-celle patch-klemme optagelse, og fremhæve forskellige aspekter af de funktioner, der er afgørende for dens succes.
Abstract
Farmakologiske administration er almindeligt anvendt, når der udføres hele-celle patch-klemme optagelse i hjernen skiver. En af de bedste metoder til drug application under elektrofysiologiske optagelse er puff teknik, som kan bruges til at studere effekten af farmakologisk reagenser på neuronal aktiviteter i hjernen skiver. Den største fordel af puff ansøgning er, at narkotika koncentrationen omkring optagelse site stiger hurtigt, hvilket forhindrer desensibilisering af membranreceptorer. Vellykket brug af puff anvendelse indebærer omhyggelig opmærksomhed på følgende elementer: koncentrationen af stoffet, parametrene for puff mikropipette, afstanden mellem spidsen af en puff mikropipette og neuron indspillet og varighed og pres kørsel pust (pounds per kvadrattomme, psi). I denne artikel beskrives en trinvis procedure til at optage hele-celle strømninger induceret ved puffing gamma – aminosmørsyre (GABA) på en neuron af en præfrontal kortikale skive. Især, kan den samme procedure anvendes med mindre ændringer til andre områder i hjernen som hippocampus og striatum og til forskellige præparater, såsom cellekulturer.
Introduction
Patch-clamp-teknik, en primære værktøj til at undersøge elektriske signaler i neuroner, blev udviklet i 1970s1,2. En stor fordel ved denne teknik er, at det giver viden om hvordan specifikke behandlinger (fx farmakologiske) kan ændre neuronal funktioner eller kanaler i realtid3. Farmakologiske evaluering af neuronal funktion under hele-celle optagelse i en hjerne skive kræver anvendelse af lægemidler, såsom agonister eller antagonister af specifikke receptorer på neuroner at blive optaget. Denne metode giver mulighed for identifikation af neuronale ændringer, der opstår efter anvendelse af et bestemt stof, hvilket fører til en bedre forståelse af de fysiologiske og patologiske egenskaber af neuroner4. Selv om farmakologiske administration kan foretages via enten perfusion5 eller puff6, er sidstnævnte den overlegne teknik. Navnlig: (i) puff ansøgning hurtigt stigninger narkotika koncentration omkring indspillede neuron til et niveau, således at desensibilisering af membranreceptorer hindres; (ii) mængden af stof pustede er ekstremt lavt, derfor er der ringe effekt på bad-løsning, som derfor reducerer eventuelle uønskede virkninger af de administrerede kemikalier på hjernen udsnit; (iii) puff-protokollen kan blive indstillet og gemt, at gøre forsøget meget præcist reproducerbar; (iv) puff program repræsenterer økonomisk brug af agonister/antagonists, især hvor sådanne reagenser er dyrt eller svært at opnå.
Her vil vi fokusere på optagelsen hele-celle strømninger induceret ved puffing GABA i akut forberedte hjerne skiver, et præparat, der har fordelen, relativt velbevaret hjernens kredsløb. Hvordan vi gennemfører puff-induceret hæmmende strømninger7 vil blive beskrevet i denne artikel. Ved hjælp af cæsium (Cs+)-baseret indre løsninger, og holder neuronerne på 0 mV, vil vi introducere GABA-puff fremkaldte hæmmende postsynaptiske strømme (eIPSCs) med passende tekniske detaljer. Ved hjælp af en musemodel af depression induceret af LPS (LPS) injektion8, vi viser, at eIPSC reduceres amplitude fremkaldt af en GABA puff betydeligt i skiver af LPS-indsprøjtning mus i forhold til køretøjets forskellige betjeningsapparater. Vores hensigt er, at denne artikel bør vise, hvordan puff teknik er alment gældende for undersøgelser med henblik på evaluering af effekten af kemikalier, forbindelser eller narkotika på neuronal aktiviteter i hjernen skiver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Puff program er almindeligt anvendt til at evaluere postsynaptiske receptor funktion3,4,7, men kræver præcis kontrol i hvert forsøg. Vi beskriver her en procedure, der omfatter hele-celle patch fastspænding, som demonstrerer GABA-puff induceret IPSCs (dvs. eIPSCs) i præfrontal kortikale hjernen skiver. Modstanden i optagelse elektrode er omkring 5 MΩ, mens puff Mikropipetter tip diameter er omkring 2-5 µm. Puff pres er me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke følgende organisationer: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), videnskab og teknologi afdeling af Guangdong (2013KJCX0054), Natural Science Foundation i Guangdong provinsen ( 2014A030313418, 2014A030313440), og Guangzhou videnskab og teknologi Bureau (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
