전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 GABA의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된
Summary
우리는 약리 시 약 전체 셀 패치 클램프 기록 하는 동안 관리 될 수 및 그것의 성공에 대 한 중요 한 기능의 다양 한 측면을 강조 퍼프 기술을 설명 합니다.
Abstract
약리학 관리 전체 셀 패치 클램프 두뇌 조각에서 녹화를 할 때 주로 사용 됩니다. Electrophysiological 녹음 중 약물 응용 프로그램의 가장 좋은 방법 중 하나는 두뇌 조각에서 신경 활동에 약리 시 약의 효과 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 퍼프 기술입니다. 퍼프 응용 프로그램의 가장 큰 장점은 그 녹음 사이트 약물 농도 증가, 따라서 방지 막 수용 체의 둔감. 퍼프 응용 프로그램의 성공적인 사용 주의 다음과 같은 요소를 포함: 약물의 농도, 퍼프 micropipette, 퍼프 micropipette 기록, 신경의 끝 및 기간 사이의 거리의 매개 변수 및 퍼프는 운전 압력 (평방 인치 당 파운드 psi). 이 문서에서는 피 감마-aminobutyric 산 (GABA) 전 두 엽 피 질 조각의 뉴런에 의해 유도 된 전체 셀 전류를 기록 하기 위한 단계별 절차를 설명 합니다. 특히, 마가, 등 다른 두뇌 지역 그리고 다른 준비, 세포 배양 등 사소한 수정 같은 절차를 적용할 수 있습니다.
Introduction
패치 클램프 기술, 뉴런의 전기 신호를 조사 하기 위한 기본 도구는 1970 년대1,2에서 개발 되었다. 이 기술의 주요 장점은 어떻게 특정 치료에 지식을 제공 한다는 것입니다 (예를 들어, 약리) 신경 기능 또는 실시간으로3채널을 변경할 수 있습니다. 전체 셀 두뇌 조각에서 녹음 하는 동안 신경 기능 약리학 평가 기록 되 고 신경에 촉진제 또는 특정 수용 체의 길 항 제와 같은 약물의 응용 프로그램을 필요 합니다. 이 메서드는4신경 생리 적 및 병 적인 속성을 더 잘 이해 하는 특정 약물의 응용 프로그램에 따라 발생 하는 신경 변경 식별 수 있습니다. 약리학 관리 중 관류5 또는 퍼프6을 통해 수행할 수 있습니다, 비록 후자의 우수한 기술입니다. 특히: (i) 응용 프로그램을 빠르게 퍼프 증가 약물 농도 수준으로 기록 된 신경 주위를 막 수용 체의 탈 감 작 예방; (ii) 부풀어 약물의 볼륨이 매우 낮은, 따라서 뇌 조각;에 관리 화학 물질의 어떤 바람직하지 않은 효과 감소 시키는 목욕 솔루션에는 효과가 거의 되도록 (iii) 퍼프 프로토콜 수 설정 하 고 저장, 실험을 매우 정확 하 게 재현할 수; 만들기 (iv) 퍼프 응용 촉진제/길 항 근, 특히 어디 이러한 시 약 인지 비싼 얻기 어려운의 경제적인 사용을 나타냅니다.
여기, 우리는 심하게 준비 뇌 조각, 상대적으로 잘 보존 된 두뇌 회로의 장점이 준비에에서 GABA를 피에 의해 유도 된 전체 셀 전류 기록에 집중할 것 이다. 우리가 퍼프 유발 억제 전류7 을 수행 하는 방법이 문서에서 설명 합니다. 세 슘 (Cs+)를 사용 하 여-기반 내부 솔루션, 그리고 0에서 신경 세포를 들고 mV, GABA-퍼프 갖는 소개 합니다 적절 한 기술적 세부 사항 가진 금지 postsynaptic 전류 (eIPSCs). 우리는 eIPSC 보여 lipopolysaccharide (LPS) 주입8에 의해 유도 된 우울증의 마우스 모델을 사용 하 여 GABA 퍼프에 의해 갖는 진폭 차량 컨트롤에 비해 LPS-주입 마우스의 조각에 상당히 절감 됩니다. 우리의 의도이 문서가 어떻게 퍼프 기술 두뇌 조각에서 신경 활동에 어떤 화학 물질, 화합물 또는 약의 효과 평가 하기 위한 연구에 널리 적용 되는 표시 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
퍼프 응용 프로그램은 널리 postsynaptic 수용 체 기능3,,47, 평가 하는 데 사용 됩니다 하지만 각 실험에 정확한 컨트롤을 요구 한다. 여기에 나온 전 두 엽 피 질 뇌 조각에서 Ipsc (즉, eIPSCs)을 유도 하는 GABA 퍼프 전체 셀 패치 클램핑 관련 절차를 설명 합니다. 기록 전극의 저항은 약 5 m ω, 퍼프 micropipettes의 팁 직경에 대해 2-5 µ m. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 다음 단체를 감사 하 고 싶습니다: 국가 자연 과학 재단의 중국 (31171018, 31171355), 과학 및 기술 부의 광 (2013KJCX0054), 자연 과학 재단의 광 동성 ( 2014A030313418, 2014A030313440), 광저우 과학 및 기술 관리국 (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
