Generation af diskriminerende menneskelige monoklonale antistoffer fra sjældne Antigen-specifikke B celler cirkulerer i blodet

Summary

Vi beskriver en metode til produktion af humane antistoffer specifikke for et antigen af interesse, med udgangspunkt i sjældne B celler cirkulerer i humant blod. Generation af disse naturlige antistoffer er effektiv og hurtig, og antistofferne fremstillet kan forskelsbehandle stærkt relaterede antigener.

Abstract

Monoklonale antistoffer (papagøjesyge) er kraftfulde værktøjer nyttigt for både grundforskning og i biomedicin. Deres høj specificitet er uundværlig, når antistoffet skal skelne mellem stærkt relaterede strukturer (fx, en normal protein og en muteret version heraf). Den nuværende måde at generere sådanne diskriminerende mAbs indebærer omfattende screening af flere Ab-producerende B-celler, som er både kostbar og tidskrævende. Vi foreslår her en hurtig og omkostningseffektiv metode til generation af diskriminerende, fuldt humane mAbs startende fra humant blod cirkulerende B-lymfocytter. Originaliteten af denne strategi er Udvalget af specifikke antigen bindende B celler kombineret med Counter markeringen af alle andre celler, ved hjælp af let tilgængelige perifert blod mononukleære celler (PBMC). Når specifikke B-celler er isoleret, er cDNA (supplerende deoxyribonukleinsyre) sekvenser, der koder for den tilsvarende mAb opnået ved hjælp af enkelt celle Reverse transkription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) teknologi og efterfølgende udtrykt i menneskelige celler. Inden for så lidt som 1 måned er det muligt at producere milligram af yderst diskriminerende menneskelige mAbs rettet mod stort set alle ønskede antigen naturligvis opdaget af B-celle repertoire.

Introduction

Metoden beskrevet her giver mulighed for hurtig og alsidig produktion af fuldt humane monoklonale antistoffer (papagøjesyge) mod en ønskede antigen (Ag). mAbs er uundværlige redskaber i mange grundlæggende forskning applikationer in vitro og i vivo: flow flowcytometri, histologi, western blotting og blokerende eksperimenter f.eks. Derudover anvendes mAbs mere og mere i medicin til behandling af autoimmune sygdomme, kræft, og til at styre transplantation afvisning¹. For eksempel, blev anti-CTLA-4 og anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs for nylig brugt som immun checkpoint hæmmere i kræft behandlinger².

De første mAbs blev produceret af immunglobulin (Ig)-secernerende hybridomer fremstillet af milt cellerne i immuniserede mus eller rotter. Men den stærke immunrespons mod murine eller rotte mAbs hæmmer deres terapeutiske brug i mennesker, på grund af deres hurtig clearance og den sandsynlige fremkaldelse af overfølsomhed reaktioner³. For at tackle dette problem, er animalsk protein sekvenser af mAbs blevet delvist erstattet af menneskelige dem til at generere såkaldte kimære Mus-menneskelige eller humaniseret antistoffer. Denne strategi falder dog kun delvist immunogenicitet, samtidig væsentligt øge omkostningerne og tidshorisont for produktion. En bedre løsning er at skabe menneskelige mAbs direkte fra menneskelige B-celler og flere strategier for dette er tilgængelige. En af dem er brugen af phage eller gær display. Dette omfatter visning af variable domæner fra en kombinatorisk bibliotek af tilfældige menneskers Ig tunge og lys kæder på phages eller gær og foretage en udvælgelse trin ved hjælp af den specifikke antigen af interesse. En væsentlig ulempe ved denne strategi er, at tunge og lette kæder er tilfældigt forbundet, fører til en meget stor stigning i mangfoldigheden af genererede antistoffer. Antistoffer opnået er usandsynligt at svare til dem, der ville opstå fra en naturlige immunrespons mod en bestemt Ag. Desuden er menneskelige proteinfoldning og posttranslationelle modifikationer ikke systematisk gengivet i prokaryoter eller endda i gær. En anden humane mAb produktionsmetode er immortalization af naturlige menneskelige B-celler ved Epstein - Barr virusinfektion eller udtryk for anti-apoptotiske faktorer BCL-6 og BCL-XL⁴. Men denne metode gælder kun for hukommelse B-celler og er ineffektive, der kræver screening af talrige mAb-producerende udødeliggjort B celler til at identificere par (hvis nogen) mAb kloner med den ønskede antigene specificitet. Metoden er således både dyrt og tidskrævende.

En ny protokol er for nylig blevet beskrevet for produktion af menneskelige mAbs fra isolerede enkelt B celler⁵. Det bygger på en optimeret enkelt celle Reverse transkription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) til forstærkning af både heavy - og lys-kæden kodning segmenter fra en enkelt sorteret B celle. Dette er efterfulgt af kloning og udtryk for disse segmenter i en eukaryote ekspressionssystem, således at genopbygningen af et fuldt humane mAb. Denne protokol har været anvendt med held startende fra B-celler fra vaccinerede donorer. Celler er høstet adskillige uger efter vaccination til at opnå højere frekvenser af B-celler rettet mod den ønskede Ag, og dermed begrænse den tid, der kræves til screening af⁶. Andre fuldt humane mAbs er også fremstillet af HIV⁺ (Human immundefekt Virus) inficerede patienter⁷ og melanom patienter⁸. Trods disse fremskridt er der stadig ingen procedure tilgængelig, der muliggør dyrkning af Ag-specifikke B celler uafhængigt af deres hukommelse fænotype eller frekvens.

Proceduren beskrevet her fører til effektiv ex vivo isolation af menneskelige cirkulerende B-celler baseret på deres BCR specificitet, efterfulgt af produktionen af fuldt humane antigen-specifikke mAbs i højt udbytte og med en lav screening tid. Metoden er ikke begrænset til hukommelse B celler eller antistof-secernerende B celler inducerede efter en immunrespons, men kan også anvendes til menneskelige naive B-celle repertoire. At det virker endda med udgangspunkt i Ag-specifikke B celler stede ved meget lave frekvenser er en god indikation af dens effektivitet. Princippet om metoden er som følger: perifert blod mononukleære celler (PBMC) farves med to tetramers præsenterer antigen af interesse, hver mærket med en anden fluorokrom (fxPhycoerythrin (PE) og Allophycocyanin (APC)), og en tredje tetramer præsenterer et nært beslægtede antigen konjugeret med et tredje fluorokrom (fxBrillant Violet 421 (BV421)). For at berige for antigen-bindende celler, celler er derefter inkuberes med perler belagt med anti-PE og anti-APC Abs, og sorteret i celle adskillelse kolonner. PE⁺ APC⁺ celle brøkdel er valgt, farves med en bred vifte af mAbs specifikke for forskellige PBMC celletyper identificering af B-celler, og underkastet flyde flowcytometri celle sortering. B-celler, som er PE⁺ og APC⁺, men strålende Violet^-, er isoleret. Dette skridt vælger mod celler, der er ikke B-celler eller ikke binder sig til den tetramerized antigen, men binder til enten PE eller APC (disse celler vil være PE⁺ APC^- eller PE^- APC⁺) eller til den antigen-del af tetramers anvendes (disse cellerne bliver BV421⁺). B-celler ikke meget specifikke for epitop af interesse er også mod valgt på dette trin (disse celler vil også være BV421⁺). Således, denne metode kan rense særdeles specifikke B-celler udtrykker B-celle receptorer (oplysningspligt) stand til at skelne mellem to meget nært beslægtede antigener. Enkelt specifikke B-celler er indsamlet i rør og deres PCR-forstærket Ig cDNAs (supplerende desoxyribonukleinsyre syrer) klonet og udtrykt af en human cellelinie som udskilles IgG mAbs.

Som en proof of concept, denne undersøgelse beskriver den effektive generation af menneskelige mAbs, som anerkender et peptid præsenteret ved et større histocompatibility komplekse klasse (MHC-jeg) molekylet og kan skelne mellem dette peptid og andre peptider indlæst på samme MHC-jeg allel. Selv om kompleksiteten af denne Ag er vigtig, tillader denne metode (i) højt udbytte opsving af Ag-specifikke mAbs; (ii) produktionen af mAbs stand til at skelne mellem to strukturelt tæt Ags. Denne fremgangsmåde kan udvides til at omfatte vaccineret eller inficerede patienter uden enhver aendring af protokollen, og også allerede har gennemført med succes i en humaniseret rotte system⁹. Således, denne undersøgelse beskriver en alsidig og effektiv fremgangsmåde for at generere fuldt humane mAbs, der kan bruges i grundforskning og immunterapi.

Protocol

Alle menneskelige perifert blodprøver blev indhentet fra anonyme voksne donorer efter informeret samtykke, i overensstemmelse med den lokale etiske komité (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedure PLER NTS-2016-08).

1. isolering af humant perifert blod mononukleære celler

Bemærk: Start materiale kan være samlede humant perifert blod eller cytapheresis prøver. Prøverne bør ikke være ældre end 8 h og suppleret med antikoagulantia (fx, heparin).

1. Fortynde blodet med 2 bind (humant perifert blod) eller 5-diskenheder (cytapheresis eksempel) af RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium.
2. Omhyggeligt lag 35 mL fortyndet cellesuspension på 15 mL af tæthed gradient medium i en 50 mL konisk slange. Gøre så mange rør som nødvendigt for at distribuere alt det fortyndede blod. Centrifugeres ved 1.290 x g i 25 min ved stuetemperatur i en svinge spanden rotor med bremse ned.
3. Omhyggeligt Opsug den mononukleære cellelag på grænsefladen mellem tæthed gradient medium og plasma lag, og overføre cellerne til en ny 50 mL konisk slange.
4. Fyld glasset med RPMI medium, mix og centrifugeres ved 1.290 x g i 10 min. ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten.
5. Resuspenderes celle i 20 mL RPMI medium og centrifugeres ved 200 x g i 10 min. til at fjerne blodpladerne. Fjern forsigtigt supernatanten. Gentag dette trin en gang.
6. Resuspenderes celle i RPMI medium med 10% føtal bovin Serum (FBS).
   Bemærk: Fortsætte direkte til tetramer mærkning eller holde celler ved 4 ° C natten over i en koncentration på 10⁷ celler/mL.

2. tetramer-associerede magnetiske berigelse af Ag-specifikke B-celler

1. Forbered Ag-tetramers ved at tilføje enten PE eller APC-mærket premium grade streptavidin eller BV421-mærket streptavidin på en kindtand forholdet 1:4 til biotinylated antigen monomerer. Tilføje den passende mængde streptavidin-konjugat i tre separate dele, tilføje en alikvot hver 10 min ved stuetemperatur.
2. Distribuere celler (op til 3 x 10⁸ pr tube) i 15 mL koniske rør og centrifugeres ved 460 x g i 5 min.
   Bemærk: Følgende protokol er for et rør.
3. Resuspenderes celle i 200 µL af PBS (phosphat bufferet saltvand) med 2% FBS. Tilføje PE-, APC- og BV421-konjugeret tetramers, hver til en slutkoncentration på 10 µg/mL. Bland godt og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
4. Forberede iskold celle adskillelse buffer (SB) ved hjælp af PBS med 0,5% BSA (bovint serumalbumin) og EDTA (ethylendiamintetra syre) 2 mM.
5. Der tilsættes 10 mL af SB. Pellet celler ved centrifugering ved 460 x g i 5 min.
6. Resuspend celler i 500 µL af iskold vejledende tilsættes 50 µL anti-PE og 50 µL af anti-APC magnetiske microbeads.
7. Bland godt og Inkuber i 20 min. ved 4 ° C.
8. Gentag trin 2.5 to gange.
9. Fjerne supernatanten omhyggeligt andresuspend celle pellet ved en koncentration på 2 x 10⁸ celler/mL i is koldt SB.
10. Blandingen henstår en stor magnetisk kolonne placeret på en magnet med 3 mL af SB.
11. Overføre cellesuspension fra 2,9 på toppen af kolonnen afbalancerede og lad det dræne fuldstændigt. KRITISKE trin: For at undgå sammenklumpning af kolonnen, passere celler gennem en 70 µm nylon mesh.
12. Skyl de rør, der indeholdt celler med 3 mL af is kold SB og overføre bufferen direkte på kolonnen (ved filtrering, skyl 70 µm nylon mesh).
13. Når bufferen er helt drænet i kolonnen, skal du tilføje en anden 3 mL af is kold SB til kolonnen.
14. Gentag trin 2.13 for en anden 3 mL vask.
15. Fjern kolonnen fra magnet og sted over en 15 mL konisk indsamling rør.
16. Der tilsættes 5 mL af is kold SB op på toppen af kolonnen og straks skylle celler ud af kolonnen bruge stemplet. Gentag dette trin en gang.
17. Centrifugeres de indsamlede celler (beriget relevante tetramer positive celle brøkdel) på 460 x g i 5 min og gå videre til yderligere antistoffarvning.
    Bemærk: Swimmingpool indsamlet celler fra alle rør, hvis det er relevant.

3. farvning af Ag-specifikke humane B-celler og celle sortering

1. Resuspenderes celle med en cocktail af antihumant antistoffer mod CD3 (endelig fortynding: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), og 7AAD (1:1000) i en endelige mængden af 100 µL af PBS med 2% FBS. Inkuber i 30 min. ved 4 ° C.
2. Der tilsættes 10 mL PBS til celler, der centrifugeres ved 460 x g i 5 min, og eliminere supernatanten. Gentag dette trin en gang. Resuspenderes celle i 200 µL af PBS, filter på 70 µm nylon mesh.
3. Gå videre til at sortere specifikke B celler på enkelt celle-niveau på en celle sorteringsanlæg forskellige med en 100 µm-dyse og et tryk på 20 psi uden overstiger 1.000 arrangementer/s⁹.
   Bemærk: Den gating strategi, der anvendes er vist i figur 1. Celler var først låge på CD14^-CD16^-7AAD^- celler til at udelukke monocytter, NK, og døde celler (ikke vist i figur 1). Derefter CD19⁺ B celler blev valgt før gating på dobbelt farvede celler af PE og APC relevante Ag-tetramers. Ikke-specifikke B-celler blev udelukket af gating på BV421 negative celler (unstained af irrelevante Ag-tetramer).
4. Indsamle enkelt B-celler i 8-strip PCR rør tidligere fyldt med 10 µL 1 x PBS og 10 enheder af RNAse hæmmer og placeres på en rist til 96 microtubes. Straks fryse PCR rør ved-80 ° C.
   Bemærk: Slags masker valgt på de forskellige instrument er udbyttet maske: 0, renhed maske: 32, og fase maske: 0. depositumet encellede kunne justeres til en 96 - eller 384-godt PCR plade, hvis det er nødvendigt. Enkelt B celler skal fryses så hurtigt som muligt og kan stå ved-80 ° C i flere uger, hvis det er nødvendigt.

4. enkelt celle RT-PCR

1. Lyse celler ved direkte opvarmning af frosne prøver i PCR strimler på 70 ° C i 5 min i en tør bad.
2. Overføre strimler is og gå videre til reverse transkription (RT) ved at tilføje 10 µL pr. tube af en 2 x master mix buffer indeholdende 1 mM dNTP, 25 µg/mL oligod(T) primere, 5 µM tilfældige hexamers, 20 enheder af RNAse hæmmer og 400 enheder af reverse transkriptase.
   Bemærk: Efter celle optøning, RT skal foretages hurtigt for at undgå RNA nedbrydning.
3. Der inkuberes ved 25 ° C i 5 min at tillade tilfældige hexamers til at krydse, derefter inkuberes i 1 time ved 50 ° C, og slut af med en inkubation ved 95 ° C i 3 min at stoppe reaktionen.
4. Fortsætte med to runder af indlejrede PCR-amplifikation for hver af regionerne kodning for variabel tunge (vH) og kappa (vLκ) eller lambda lette kæder (vLλ).
   Bemærk: Alternativt RT prøver kan være frosset ved-20 ° C og opbevares i en uge.
   1. For den første runde af PCR, tilføje 3 µL cDNA for en 40 µL endelige rumfang indeholdende 1,5 mM MgCl₂, 0,25 mM dNTP'er, 2,5 enheder af DNA Polymerase og 200 nM af ydre primere (Se figur 2 og Tabel af materialer til primer sekvenser).
      Bemærk: Sammensætning af ydre primere mix. For tunge kæde forstærkning: 4 frem primere (5' LVH mix) og 2 bak primere (3' CµCγ mix). For lys kappa kæde forstærkning, 3 videresende primere (5' LV | mix) og 1 bak primer (3' Cκ543-566). For lys lambda kæde forstærkning, 7 frem primere (5' LVl mix) og 1 bak primer (3' Cl).
      Bemærk: Primere var designet af rorpinden et al. for forstærkning af alle tunge og lette kæde familie gener⁵.
   2. Følgende cykling betingelser: 94 ° C i 4 min, efterfulgt af 40 cyklusser af 30 s på 94 ° C, 30 s på 58 ° C for VH og VLκ (60 ° C for VLλ) og 55 s ved 72 ° C, med en afsluttende brudforlængelse trin ved 72 ° C i 7 min.
   3. For den anden runde PCR, bruge 3 µL af den første forstærkning produkt for en endelige mængden af 40 µL indeholdende 1,5 mM MgCl₂, 0,25 mM dNTP'er, 2,5 enheder af DNA polymerase og 200 nM af indre primere indeholdende begrænsning enzym websteder for kloning til udtryk vektorer (Se figur 2 og Tabel af materialer til primer sekvenser).
      Bemærk: Sammensætning af indre primere mix. For tunge kæde forstærkning: 9 frem primere (5' AgeIVH mix) og 3 bak primere (3' SalIJH mix). For lys kappa kæde forstærkning, 9 videresende primere (5' AgeIV | mix) og 3 bak primere (3' BsiWIJκ mix). For lys lambda kæde forstærkning, 6 frem primere (5' AgeIVl mix) og 1 bak primer (3' XhoICl).
      Bemærk: Primere var designet af rorpinden et al., til forstærkning af alle af tunge og lette kæde familie gener⁵.
   4. Følgende cykling betingelser: 94 ° C i 4 min, efterfulgt af 40 cyklusser af 30 s på 94° C, 30 s på 58 ° C for VH og LCκ (60 ° C for LCλ), og 45 s ved 72 ° C med en afsluttende brudforlængelse trin ved 72 ° C i 7 min.
5. Identificere positive brønde ved overflytning 5 μl PCR produkter vH, vLκ og vLλ på en 1,5% agarosegel (500 bp produkter til variabel tunge kæde kodning segmenter) og en 350 bp produkt for variable lys kæde kodning segmenter.
6. Rense de resterende 35 µL PCR produkter tilbage fra positive brønde ved hjælp af ultrafiltrering membraner designet til oprensning af PCR produkter.
7. Elueres PCR produkter med 60 µL af H₂O.

5. udtryk kloning

1. Forberede skær
   Bemærk: Fordøje 60 µL af hver renset PCR produkt i en endelige mængden af 100 µL indeholdende den passende begrænsning enzym buffer.
   1. VH PCR produkter, tilføje 50 enheder af AgeI og 50 enheder af SalI, og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
   2. For vLλ PCR produkter, tilføje 50 enheder af AgeI og 50 enheder af XhoI, og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
   3. For vLκ PCR produkter, tilføje 50 enheder af AgeI og Inkuber i 1 time ved 37 ° C. Rense fordøjer bruger 96 PCR membraner og elueres med 60 µL af H₂O. Digest 60 µL eluatet i en endelige mængden af 100 µL af BsiWI begrænsning enzym buffer, tilføje 50 enheder af BsiWI og Inkuber i 1 time ved 55 ° C.
   4. Inaktivere enzymerne ved opvarmning på 80 ° C i 15 min.
2. Forberedelse til at udtrykke vektorer
   Bemærk: vH PCR produkter er klonet i et udtryk vektor (HCγ1) indeholdende den konstante tunge kæde Cγ1 af IgG1. vLκ PCR produkter er klonet i et udtryk vektor (LCκ) indeholdende den konstant lys kæde Cκ. vLλ PCR produkter er klonet i et udtryk vektor (LCλ) indeholdende den konstant lys kæde Cλ.
   1. Udfør de følgende digestions:
      1. Mix 1 µg ytringsfriheden vektor HCγ1 med 10 enheder af AgeI og 10 enheder af SalI endonucleases i en samlet maengde paa 20 µL af begrænsning buffer anbefalet af fabrikanten, og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
      2. Mix 1 µg udtryk vektor LCκ med 10 enheder af AgeI begrænsning enzym i en samlet maengde paa 20 µL af begrænsning buffer anbefalet af fabrikanten, og Inkuber i 1 time ved 37° C. Tilføje 10 enheder af BsiWI begrænsning enzym, og Inkuber i 1 time ved 55 ° C.
      3. Mix 1 µg udtryk vektor LCλ med 10 enheder af AgeI og 10 enheder af XhoI endonucleases i en samlet maengde paa 20 µL af begrænsning buffer anbefalet af fabrikanten, og Inkuber i 1 time ved 37 ° C
   2. Varme hver fordøjelse blanding ved 65 ° C i 10 min til at inaktivere restriktionsenzymer.
   3. Udføre ligatur af 5 µL af fordøjet PCR produkt med 2 µL (100 ng) af tilsvarende lineariseret udtryk vektor i en samlet maengde paa 20 µL 1 x DNA ligase buffer med 1 enhed af T4 DNA-Ligase ved inkubering natten over ved 4 ° C.
      Bemærk: Alternativt ligatur er udført i 3 timer ved 4° C.
3. Kloning
   1. Electroporate 1 µL af 20 µL ligatur blandingen i 45 µL af hjemmelavet electrocompetent TOP10 E. coli (nuværende protokoller i molekylær biologi, sektion 1.8.4-1.8.8). Straks tilsættes 500 µL af 2 X YT medium og der inkuberes i vandbad ved 37 ° C i 30 min. spredning omdannet bakterier på 2 x YT ampicillin plader. Der inkuberes natten over ved 37 ° C.
   2. For hver transformation, skærm otte kolonier ved PCR.
      1. Oprette en reaktion premix som følger på is: 45 µL af 5 x PCR Buffer, 12 µL af MgCl₂ (25 mM), 4 µL af dNTP'er (fra en bestand indeholdende 10 mM for hver), 10 µL af fremad primer (stock 10 µM) hybridizing til vektor sekvens (primer Ab-vec-forstand) , og 10 µL af reverse primer (stock 10 µM) rettet mod regionen konstant tung eller let kæde (Se Tabel af materialer til primer sekvenser). Der fyldes op til en endelige mængden af 200 µL med H₂O. Derefter tilsættes 4 µL DNA polymerase enzym (5 U/µL).
      2. Distribuere 25 µL af reaktion premix pr. 8-strip PCR rør på is.
      3. Brug en steril tandstikker til at afhente enkelte kolonier. Streak tandstikker på en 2 x TY ampicillin tallerken udgør en Repliker plade og derefter dyppe den i en PCR reaktion tube.
      4. Udføre screeningen PCR på følgende cykling betingelser: 94 ° C i 10 min, efterfulgt af 25 cykler 30 s på 94 ° C, 30 s på 55 ° C og 50 s på 72 ° C.
      5. Identificere positive bakterier ved overflytning 5 µL af PCR-produkter på en 1,5% agarosegel.
         Bemærk: Positiver kolonier give en PCR produkt omkring 850 bp for tunge kæde vektor og 600 bp for lys kæde vektor.
   3. Podes fire positive kolonier fra Repliker pladen til 2 mL af LB medium og inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm.
   4. Uddrag plasmider fra flydende kulturer ved hjælp af en plasmid rensning kit, som angivet af fabrikanten.
   5. Kontrollér korrekt isætning af variable domæner af Sanger sekventering af plasmider med Ab-vec-sense primer.
      Bemærk: Plasmider med den korrekte Indsæt (kodning af HC og den tilsvarende LC) er at være cotransfected i 293A celler til sekretion. Specificiteten af lille skala-producerede mAbs er analyseret ved hjælp af ELISA. Stor skala produktion udføres derefter, hvis det er relevant.

6. fremstilling af mAbs

1. Lille skala produktion for kontrol af specificitet
   1. Dagen før Transfektion, frø 15.000 menneskelige embryonale nyre 293A (HEK 293A) celler i 200 µL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS pr. brønd i 96-brønd plader. Der inkuberes natten over i en CO₂ inkubator (5% CO₂) ved 37 ° C.
   2. Cotransfect 293A celler i DMEM medium som indeholder 10% FBS ved hjælp af en lineær polyethylenimine afledede som Transfektion reagens.
      Bemærk: Udfør Transfektion i tre. Følgende protokol er for et godt i en flad bund 96-brønd plade.
      1. Fortynd 0,5 µL DNA Transfektion reagens i 10 µL af 150 mM NaCl. Fortynd 0,125 µg vH og 0,125 µg vL udtrykker vektorer i 10 µL af 150 mM NaCl. Vortex hver fortynding for 10 s.
      2. Tilsæt 10 µL fortyndet DNA Transfektion reagens i 10 µL DNA løsning. Vortex 15 s og Inkuber i 15 min ved stuetemperatur. Tilføj 20 µL mix Dråbevist på 293A celler, og blandes forsigtigt hvirvlende pladen.
   3. Erstatte den medium 16 h efter Transfektion og kultur celler i 5 dage i serumfrit medium.
      Bemærk: Brug serumfrit medium til at undgå serum Igs forurener de producerede antistoffer.
   4. Fjerne celler og snavs ved centrifugering ved 460 x g i 5 min.
   5. Høste analysere ved aspiration med en multikanal-pipette og overføre dem til en V-bund 96-brønd plade.
   6. Frakke relevante Ag natten over ved 4 ° C i 100 µL pr. brønd af rekonstitueret ELISA/ELISPOT belægning buffer 1 x i en endelig koncentration på 2 µg/mL i 96-vel ELISA-plader. Se eksempler i ⁹.
   7. Blok brønde med 10% FBS DMEM medium i 2 timer ved 37 ° C
   8. Tilsæt 50 µL af supernatanter af transfekteret 293A celler fra trin 6.1.5, og der inkuberes i 2 timer ved RT.
   9. Tilsæt 100 µL af en anti-humant IgG Ab konjugeret til peberrod peberrodsperoxidase (HRP) enzym på 1 µg/mL og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Tilsæt 50 µL kromogent substrat (TMB), og Inkuber i 20 min.
   10. Læs optisk tætheder ved 450 nm på et spektrofotometer.
       Bemærk: Den særlige mAbs afsløret af ELISA assay yderligere kan fremstilles i stor skala og renset på protein en kolonne præsentere affinitet for humant IgG.
2. Storstilet produktion og rensning af specifikke mAbs
   1. Dagen før Transfektion, seed 6 x 10⁶ menneskelige embryonale nyre 293A (HEK 293A) celler i 175 cm² flasker der indeholder 25 mL DMEM suppleret med 10% FBS. Der inkuberes natten over i en CO₂ inkubator (5% CO₂) ved 37 ° C.
      Bemærk: Celler skal være 70% sammenflydende når transfekteret.
   2. Cotransfect 293A celler i DMEM medium som indeholder 10% FBS ved hjælp af en lineær polyethylenimine afledede som Transfektion reagens.
      1. Fortyndet 50 µL DNA Transfektion reagens til 450 µL af 150 mM NaCl. Fortyndet 10 µg vH og 10 µg vL udtrykker vektorer til 500 µL af 150 mM NaCl. Vortex 10 s hver fortynding.
      2. Tilføje fortyndet DNA Transfektion reagens til DNA-løsning. Vortex 15 s og Inkuber i 15 min ved stuetemperatur. Tilsæt 1 mL blanding Dråbevist til cellerne, og bland af forsigtigt hvirvlende kolben.
   3. Erstatte den medium 16 h efter Transfektion og kultur celler i 5 dage i serumfrit medium.
   4. Høst medium af sugning med en 25-mL pipette.
   5. Fjerne celler og snavs ved centrifugering ved 460 x g i 5 min.
   6. Rense antistoffer ved hjælp af en 1 mL kolonne belagt med protein A på en hurtig protein væskekromatografi (FPLC) systemet ved 4 ° C.
      1. Reagensglasset protein en sepharose kolonne med 20 mM fosfat buffer (pH 7).
      2. Filtrer cellekulturmedium fra 6.2.5 ved hjælp af en 1,22 µm filter, derefter et 0,45 µm filter.
      3. Indlæse den filtrerede medium over på kolonnen.
      4. Vask med 20 mM fosfat buffer (pH 7) og elueres med en 0,1 M citratbuffer (pH 3,5).
      5. Læs optisk tæthed på 280 nm på en absorption Spektrofotometer og straks neutralisere protein-holdige fraktioner med 1 M Tris buffer (pH 9).
   7. Dialyze renset Ab natten over ved 4 ° C i en kassette med en 3.5K molekylvægt cutoff mod PBS buffer (pH 7,4).
   8. Sterilisere ved 0,2 µm filtrering og kontrol renhed af størrelse-udelukkelse kromatografi, som angivet af fabrikanten.

Representative Results

Start fra PBMC fra raske donorer, dette projekt præsenterer generation af menneskelige mAbs, der anerkender peptid Pp65₄₉₅ (Pp65, fra menneskelig cytomegalovirus) præsenteret af de store histocompatibility komplekse klasse jeg (MHC-jeg) molekyle () HLA - A * 0201 HLA-A2). Disse mAbs kan diskriminere mellem denne komplekse og komplekser, der repræsenterer andre peptider læsset på den samme MHC-jeg molekyle.

PBMC var plettet med HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC og HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers som beskrevet i ovennævnte protokol. Efter immunomagnetic celle berigelse af PE og APC tetramer positive celler, var eluted celler plettet med yderligere mAbs. På flow flowcytometri celle sorteringsanlæg, magnetisk beriget celler blev først låge på levedygtige CD14^-CD16^-CD3^-CD19⁺ slåbrokker (B-celler). Figur 1 viser den gating strategi, der anvendes til at isolere B-celler udtrykker oplysningspligt stand til at skelne mellem HLA-A2/Pp65 og andre relaterede HLA-A2/peptid komplekser. Markering af B-celler af interesse blev udført efter gating på HLA-A2/Pp65 PE⁺ og HLA-A2/Pp65 APC⁺ dobbelt-positiver, for at udelukke fluorokrom specifikke B-celler, der var enkeltvis farves PE⁺ eller APC⁺. Endelig, særdeles specifikke B-celler blev identificeret ved gating på HLA-A2/MelA2-BV421 negative celler. Dette giver mulighed for identifikation af B-celler udtrykker oplysningspligt stand til at binde HLA-A2/Pp65, på et peptid og HLA-A2-afhængige måde diskriminere mellem disse B-celler og rettet mod β2 mikroglobulin, biotin, HLA-A2, eller dem, der ikke diskriminerer mellem peptider i MHC bindende groove. Alle disse sidstnævnte celler bliver BV421 positive celler. Som tidligere vist og yderligere dokumenteret med andre typer af Ag, er denne udelukkelse strategi vigtigere som følge af stigninger i B-celler for Ag⁹diskriminerende evne.

Når enkelt specifikke B-celler blev sorteret, cDNAs kodning for tunge og lys Ig-kæder blev forstærket af RT-PCR. Par af tunge og lette kæde kodning segmenter blev indhentet i omkring 50% af enkelt B celler testet (tabel 1). Variabel domæne sekvenser blev derefter klones til udtryk vektorer indeholdende tilsvarende konstant domæne sekvenser (tunge konstant 1 og lys konstant κ eller λ). Menneskelige embryonale nyreceller (HEK, 293A celler) var cotransfected med tunge og lette kæde vektorer. De udskilles mAbs af IgG1 isotype blev høstet fra kultur analysere af 293A celler 5 dage efter Transfektion (Se figur 3 for den globale strategi for fuldt humane mAbs produktion). Dette produceret med succes en HLA-A2/Pp65 specifikt antistof start fra 3 enkelt B-lymfocytter celler giver par af tunge og lette kæde kodning segmenter (tabel 1). ELISA assays tydeligt at dette mAb var både MHC og peptid-afhængig af for sin binding til HLA-A2/Pp65 komplekser (figur 4A), og flere milligram mAb var let produceret for yderligere analyse (f.eks., affinitet analyser, funktionelle assays). Dets bindende affinitet, bestemmes af overflade plasmon resonans (SPR), var ca 7 x 10^-6 M (figur 4B).

Således i denne artikel beskrives en kombination af følsomme og effektive metoder tillader i) påvisning af relevante Ag-specifikke B-celler, når præsenterer selv ved meget lave frekvenser i blodet hos raske donorer og ii) generation af stærkt diskriminerende menneskelige mAbs.

Figur 1: Påvisning af HLA-A2/Pp65 specifikke B celler fra menneskelige PBMC.
3 x 10⁸ PBMC var plettet med HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC og HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers. Efter immunomagnetic celle berigelse af PE og APC tetramer positive celler, var eluted celler plettet med yderligere mAbs. På en flow flowcytometri celle sorteringsanlæg, celler var gated først på levedygtige singlet CD14^-CD16^- lymfocytter (ikke vist), derefter på CD19⁺CD3^- celler. Derefter, B-celler farves med både HLA-A2/Pp65-PE og HLA-A2/Pp65-APC tetramers var gated. HLA-A2/MelA-BV421 tetramer blev brugt til at udelukke B-celler, der ikke genkende HLA-A2/Pp65, i et peptid og MHC-afhængige måde.

Figur 2: strategi for forstærkning og kloning af Ig gener. Lette og tunge Ig-kæde kodning gener blev forstærket af indlejrede RT-PCR. Første PCR'er blev udført med en blanding af fremad primere hybridizing leder region og omvendt primere specifikke for konstant regioner af passende tunge, lys kappa eller lambda lette kæder. Anden PCR'er blev udført med primere, der indeholder begrænsning websteder, frem og bak primere var henholdsvis specifikke for begyndelsen af V segmenter og til slutningen af J segmenter. PCR produkter blev sekventeret, fordøjet med restriktionsenzymer og klonede i udtryk vektorer indeholdende relevante konstante domæner. CMV: cytomegalovirus promotor; AmpR: modstand genet for ampicillin.

Figur 3: Overordnede strategi for genopbygningen af rekombinant humant mAbs.
En tetramer-baseret sortering strategi giver mulighed for påvisning af B celler af interesse. Særdeles specifikke B-celler blev encellede sorteret. Lette og tunge Ig-kæde kodning segmenter blev forstærket ved hjælp af RT-PCR. Variabel domæne sekvenser blev klonet i separate eukaryote udtryk vektorer i ramme med gen segmenter kodning konstante lette og tunge regioner. De tilsvarende fuldt humane mAbs blev udtrykt af forbigående transfekteret HEK 293A celler og renset fra kultur supernatanten. Dette tal blev ændret fra Ouisse et al. (2017) ⁹.

Figur 4: Karakterisering af en repræsentativ yderst diskriminerende mAb mod HLA-A2/Pp65 genereret fra humant perifert blod cirkulerende B-celler.
A) specificitet mAb PC1.02 mod HLA-A2/Pp65 testet af ELISA. Pladerne var belagt med relevante (HLA-A2/Pp65) eller irrelevante HLA-A2 komplekser indeholdende HLA-A2-begrænset peptider: MelA, NS3 (HCV-1), og GagP17 (HIV-1) på 2 µg/mL, mAb PC1.02 blev tilføjet, og en anti-humant IgG-HRP Ab blev brugt til registrering. Optisk tætheder (OD) blev læst ved 450 nm. B) affinitet bestemmelse af mAb PC1.02 ved hjælp af overflade Plasmon resonans (SPR) af flydende forskellige koncentrationer af HLA-A2/Pp65 komplekser over CM5 chip-bundet mAb. Dette tal blev ændret fra Ouisse et al. (2017) ⁹.

	Antallet af PBMC	Antallet af PE + APC + celler efter berigelse	Antallet af udstødte (BV421 +) celler	Antallet af sorterede enkelt celler	Antallet af analyserede brønde	Antallet af brønde med HC og LC forbundet (% genfinding)	Antallet af mAbs produceret	Antallet af specifikke mAbs
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02)	3 x 108	818	117	161	7	3 (43%)	3	1

Tabel 1: Analyse af HLA-A2/Pp65 specifikke B-celler.
Virkningen af strategiens udelukkelse af uspecifik B-celler, udbytterne af Ig-gen forstærkning og mAb produktion fra isolerede HLA-A2/Pp65 specifikke B-celler blev vurderes/måles.

Discussion

Den foreslåede protokol er en kraftfuld metode for generation af menneskelige mAbs direkte fra Ag-specifikke B celler cirkulerer i blodet. Det kombinerer tre vigtige aspekter: (i) anvendelse af en tetramer-associerede magnetiske berigelse, som giver mulighed for en ex vivo isolation af endda sjældne Ag-bindende B celler; (ii) en gating strategi, der bruger tre Ag tetramers (to relevante dem og en irrelevant én) mærket med tre forskellige fluorokromer til at isolere, ved flowcytometri, kun B-celler udtrykker BCR specifikke for den ønskede Ag; (iii) til genopbygningen af den tilsvarende rekombinant mAb cDNAs af RT-PCR på enkelt celle niveau og udtryk for cDNAs i humane celler.

Tidligere undersøgelser har foreslået ved hjælp af en eller to fluorescerende relevante antigener til mærke B menneskeceller før sortering og efterfølgende produktion af mAbs fra isolerede B celler^6,7,8. En analyse hos patienter med leddegigt, og en i en autoimmun musemodel, har knyttet en irrelevant fluorescerende antigen til at karakterisere autoreactive B celler og bestemme deres frekvens^10,11. Så vidt vi ved, brug af en kombination af to fluorescerende relevante antigen tetramers og en irrelevant antigen tetramer er ikke blevet beskrevet tidligere for berigelse af specifikke B celler forud for deres anvendelse til fremstilling af fuldt humane mAbs. Denne optimerede metode giver mulighed for fuldt humane diskriminerende mAbs fremstilles i så lidt som en måned, og kan udføres med succes, selv når du starter fra en naive B-celle repertoire. Således, det har ingen af de store ulemper ved phage display, humane B-celle immortalization, eller andre tidligere beskrevet molekylær biologi-baserede mAb genopbygning procedurer.

Denne celle sortering strategi resulterer i et højt udbytte opsving af Ag-specifikke menneskelige mAbs. Par af tunge og lette kæde segmenter fra enkelt isoleret B-celler er forstærket med en succesrate på omkring 50%. Lys kæde segmenter forstærkes næsten altid, men dette er ikke tilfældet for tunge kæde segmenter. RT-PCR effektivitet afhænger i høj grad respekterer følgende punkter: Jeg) sorterede enkelt B celler skal fryses så hurtigt som muligt; II) tilføjer 30 enheder af RNase-hæmmer og ved at minimere tid mellem at tage B-celler ud af fryseren og lancere RT reaktion; III) optøning alle primere på isen; IV) aldrig optøning frysning/primere mere end tre gange; v) strømpe primere i højst et år.

Med hensyn til produktionseffektivitet af den tilsvarende rekombinant mAbs med den ønskede specificitet er det omkring 30-40% af tilfælde for pMHC specifikke mAbs. Disse særlige mAbs nødt til at anerkende peptid og MHC-molekyle, som ganske krævende, og vi har tidligere vist, at det samlede udbytte af inddrivelse af specifikke mAbs rettet mod mere konventionelle antigener er overlegen, op til 100% for de Β-galactosidase antigen⁹. Det skal understreges, at valget af en passende Ag for de irrelevante tetramer er vigtigt at øge mAbs produceret specificitet.

Affinitet af anti-HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) er beskrevet i denne artikel er relativt lav, om 7 x 10^-6 M, svarende til en TCR affinitet. Dette resultat var forventet, som B-celle isolation blev udført fra naiv donorer. De fleste tetramer⁺ B celler blev IgM⁺IgG^-, hvilket reducerer sandsynligheden for at opnå god Ag-ringbind. Ikke desto mindre, denne metode kan også gøre muligt Udsortering af cross-reactive hukommelse B celler mod en ønskede Ag fra naiv donorer, på grund af immunologisk fortid af enkeltpersoner¹². Desuden, denne metode er let anvendelig til vaccineret eller inficerede patienter eller immuniserede humaniseret dyr, som beskrevet i ⁹, hvor i vivo affinitet modning kan øge affinitet af resulterende mAbs til omkring 1 x 10^-9 M. forskellige procedurer er også blevet beskrevet til at forbedre affinitet af mAbs i vitro, navnlig gennem gengive somatiske hypermutation i celler, der udtrykker det antistof (gennemgik i ¹³).

Afslutningsvis foreslår vi en alsidig strategi for yderst diskriminerende mAbs produktion, der kan bruges i forskellige typer af situationen, fra en naiv individuelle vaccinerede donor eller en patient, der lider af en autoimmun sygdom. Fuldt humane mAbs genereres på denne måde imod en ønskede epitop kunne være nyttigt både for grundforskning og immunterapi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003