Generation av diskriminerande humana monoklonala antikroppar från sällsynta Antigen-specifika B-celler som cirkulerar i blodet

Summary

Vi beskriver en metod för framställning av humana antikroppar specifika för antigen av intresse, start från sällsynta B-celler som cirkulerar i blod. Generation av dessa naturliga antikroppar är snabbt och effektivt, och antikroppar erhållits kan diskriminera mellan starkt relaterade antigener.

Abstract

Monoklonala antikroppar (mAbs) är kraftfulla verktyg som är användbara för både grundforskning och i biomedicin. Deras hög specificitet är oumbärlig när antikroppen måste skilja mellan mycket relaterade strukturer (t.ex., ett protein som normal och en muterad version därav). Det nuvarande sättet att generera sådana diskriminerande mAbs innebär omfattande screening av flera Ab-producerar B-celler, vilket är både kostsamt och tidskrävande. Vi föreslår här en snabb och kostnadseffektiv metod för generering av diskriminerande, helt human mAbs start från humant blod cirkulerar B-lymfocyter. Originaliteten i denna strategi beror på valet av specifika antigen bindande B celler kombinerat med kampen mot valet av alla andra celler, med hjälp av lättillgängliga perifert blod mononukleära celler (PBMC). När specifika B-celler är isolerade, erhålls cDNA (kompletterande deoxiribonukleinsyra) sekvenser som kodar för den motsvarande mAb med enstaka cell omvänd Transkription-polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) teknik och därefter uttryckt i mänskliga celler. Inom så lite som 1 månad är det möjligt att producera milligram mycket diskriminerande mänskliga mAbs mot valfri önskad antigen naturligt upptäcks av B-cell repertoaren.

Introduction

Den metod som beskrivs här tillåter snabb och mångsidig produktion av fullt humana monoklonala antikroppar (mAbs) mot en önskad antigen (Ag). mAbs är viktiga verktyg i många grundläggande forskning program in vitro och i vivo: flow flödescytometri, histologi, western-analys, och blockering experiment till exempel. Dessutom används mAbs mer och mer i medicin för behandling av autoimmuna sjukdomar, cancer, och att styra transplantation avslag¹. Anti-CTLA-4 och anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs användes exempelvis nyligen som immun checkpoint-hämmare i cancer behandlingar².

De första mAbs producerades av immunglobulin (Ig)-utsöndrar hybridomceller erhållits från mjälten cellerna av immuniserade möss eller råttor. Men hämmar det starkt immunsvaret mot murint eller råtta mAbs deras terapeutiska användning på människor, på grund av deras snabba clearance och sannolikt induktion av överkänslighet reaktioner³. För att tackla detta problem, har animaliskt proteinsekvenser av mAbs delvis ersatts av mänskliga sådana att generera så kallade chimär mus-mänskliga eller humaniserade antikroppar. Denna strategi minskar dock endast delvis immunogenicitet, samtidigt väsentligen öka både kostnaden och tidsskalan för produktion. En bättre lösning är att skapa mänskliga mAbs direkt från mänskliga B-celler och flera strategier för detta finns. En av dem är användningen av phage eller jäst display. Detta innebär att Visa variabla domäner från ett kombinatoriska bibliotek med slumpmässiga mänskliga Ig tung och ljus kedjor på Fager eller jäst, och genomför ett urval steg med specifika antigen av intresse. En stor nackdel med denna strategi är att tunga och lätta kedjor är slumpmässigt förknippade, leder till en mycket stor ökning i mångfalden av genererade antikroppar. Antikroppar som erhålls är osannolikt att motsvara till de som skulle uppstå genom en naturlig immunsvar mot en viss Ag. Övrigt mänskliga proteinveckning och post-translationella modifieringar återges inte systematiskt i prokaryoter eller ens i jäst. En andra mänskliga mAb produktionsmetod är immortalization av naturliga mänskliga B celler, av Epstein - Barr-virusinfektion eller uttryck av de anti-apoptotiska faktorer BCL-6 och BCL-XL⁴. Dock denna metod gäller endast för minne B celler och är ineffektiv, som kräver screening av talrika mAb-förevigade B celler att identifiera de få (om några) mAb-klonerna med önskad antigen specificitet. Metoden är således både kostsamt och tidskrävande.

Ett nytt protokoll har nyligen beskrivits för produktion av mänskliga mAbs från isolerade enda B celler⁵. Det bygger på en optimerad encelliga omvänd Transkription-polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) för förstärkning av både tunga - och ljus-kedjan kodning segment från en enda sorterade B-cell. Detta följs av kloning och uttryck av dessa segment i en eukaryota uttryck systemet, vilket möjliggör återuppbyggnad av en fullt human mAb. Detta protokoll har använts framgångsrikt start från B-celler från vaccinerade givare. Celler skördats flera veckor efter vaccination att få högre frekvenser av B-celler som riktas mot önskad Ag, och därmed begränsa den tid som krävs för screening⁶. Andra helt human mAbs har också producerats från⁺ (humant immunbristvirus) HIV-infekterade patienter⁷ och melanom patienter⁸. Trots dessa framsteg finns det fortfarande inget förfarande som är tillgängliga som gör det möjligt för isolering av Ag-specifika B-celler som är oberoende av deras minne fenotyp eller frekvens.

Förfarandet beskrivs här leder till effektiv ex vivo isolering av mänskliga cirkulerande B celler baserat på deras BCR specificitet, följt av produktionen av fullt humana antigen-specifika mAbs i hög avkastning och med en låg screening tid. Metoden är inte begränsad till B-minnesceller eller antikropp-utsöndrar B celler inducerad efter ett immunsvar, men kan också tillämpas på mänskliga naiva B-celler repertoaren. Den funkar även start från Ag-specifika B-celler som är närvarande vid mycket låga frekvenser är en bra indikation på dess effektivitet. Principen för metoden är följande: perifert blod mononukleära celler (PBMC) färgas med två tetramers presenterar antigen av intresse, var märkt med en annan fluorokrom (t.ex., fykoerytrin (PE) och från (APC)), och en tredje tetramer presenterar ett närbesläktade antigen konjugerat med ett tredje fluorokrom (t.ex., Brillant Violet 421 (BV421)). För att berika för antigen-bindande celler, celler inkuberas därefter med pärlor belagd med anti-PE och anti-APC Abs, och sorterade i cell Separationskolonner. PE⁺ APC⁺ cell fraktionen är markerad, färgade med en mängd mAbs specifika för olika Laboratoriestammar celltyper att medge identifiering av B-celler och betvingade flöda flödescytometri cell sortering. B-celler som är PE⁺ och APC⁺, men lysande violett^-, är isolerade. Detta steg markerar räknaren celler som inte är B-celler eller binder inte till tetramerized antigen, men binda till antingen PE eller APC (dessa celler kommer att PE⁺ APC^– eller PE^– APC⁺) eller till den icke-antigen delen av de tetramers som används (dessa celler kommer att BV421⁺). B-celler inte mycket specifika för epitop av intresse väljs också kontraproduktivt i detta steg (dessa celler kommer också att vara BV421⁺). Denna metod kan således rena mycket specifika B-celler som uttrycker B-cellernas receptorer (BCR) kunna diskriminera mellan två mycket närbesläktade antigener. Enda specifika B-celler samlas i rör och deras PCR-förstärkta Ig cDNAs (kompletterande deoxiribonukleinsyra syror) klonade och uttryckt av en human cellinje som utsöndrade IgG mAbs.

Som ett proof of concept, denna studie beskriver effektiv generering av mänskliga mAbs, som erkänner en peptid som presenteras av en större histocompatibility komplex klass jag (MHC-jag) molekyl och kan diskriminera mellan denna peptid och andra peptider som lastats på samma MHC-jag allel. Även om graden av komplexitet i detta Ag är viktigt, kan med denna metod (i) hög kapacitet återvinning av Ag-specifika mAbs; (ii) produktion av mAbs kunna diskriminera mellan två strukturellt nära Ags. Detta tillvägagångssätt kan förlängas till vaccinerade eller infekterade patienter utan ändringar protokoll, och också redan har genomförts framgångsrikt i en humaniserad rat system⁹. Således, denna studie beskriver en mångsidig och effektiv strategi för att generera fullt humana mAbs som kan användas i grundforskning och immunterapi.

Protocol

Alla mänskliga perifert blodprover erhölls från anonym vuxen givare efter informerat samtycke, i enlighet med den lokala etiska kommittén (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, förfarande re NTS-2016-08).

1. isolering av människans perifera mononukleära blodceller

Obs: Utgångsmaterial kan vara totalt perifert blod eller cytapheresis prover. Prover bör inte vara äldre än 8 h och kompletteras med antikoagulantia (t.ex., heparin).

1. Späda ut blodet med 2 volymer (humant perifert blod) eller 5 volymer (cytapheresis exempel) RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium.
2. Noggrant lager 35 mL utspädd cellsuspension på 15 mL för täthet lutning medium i en 50 mL konisk slang. Göra så många rör som behövs för att distribuera alla utspädda blodet. Centrifugera vid 1 290 x g i 25 min i rumstemperatur i en svängande-hink rotor med broms.
3. Försiktigt aspirera det mononukleära celllagrar i gränssnittet mellan täthet lutning mediet och plasma lagret och överföra cellerna till en 50 mL konisk reservrör.
4. Fyll röret med RPMI medium, blanda och centrifugera 1 290 x g under 10 minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten.
5. Återsuspendera cellpelleten i 20 mL RPMI medium och centrifugera vid 200 x g i 10 min bort blodplättarna. Ta försiktigt bort supernatanten. Upprepa detta en gång.
6. Återsuspendera cellpelleten i RPMI medium med 10% fetalt bovint Serum (FBS).
   Obs: Gå direkt till tetramer märkning eller hålla celler vid 4 ° C över natten vid en koncentration på 10⁷ celler/mL.

2. tetramer-associerade magnetisk anrikning av Ag-specifika B-celler

1. Förbereda Ag-tetramers genom att lägga till antingen PE eller APC-märkt premium grade streptividin eller BV421-märkt streptividin på en molar förhållandet 1:4 till biotinylerade antigen monomerer. Tillsätt lämplig mängd streptividin-konjugat i tre separata delar, lägga till en alikvot varje 10 min i rumstemperatur.
2. Distribuera celler (upp till 3 x 10⁸ per rör) i 15 mL koniska rör och centrifugera vid 460 x g i 5 min.
   Anmärkning: Följande protokoll är för en tub.
3. Återsuspendera cellpelleten i 200 µL PBS (fosfat buffrad koksaltlösning) med 2% FBS. Lägg till PE - APC- och BV421-konjugerad tetramers, var och en till en slutlig koncentration på 10 µg/mL. Blanda väl och inkubera i 30 min i rumstemperatur.
4. Förbereda iskall cell separation buffert (SB) med PBS med 0,5% BSA (bovint Serum Albumin) och EDTA (etylendiamintetraättiksyra syra) 2 mM.
5. Tillsätt 10 mL av SB. Pellet celler genom centrifugering vid 460 x g i 5 min.
6. Att resuspendera cellerna i 500 µL av iskall SB. Tillsätt 50 µL anti-PE och 50 µL anti-APC magnetiska mikrokulor.
7. Blanda väl och Inkubera under 20 minuter vid 4 ° C.
8. Upprepa steg 2.5 två gånger.
9. Eliminera supernatanten noggrant andresuspend cellpelleten vid en koncentration på 2 x 10⁸ celler/mL i is kallt SB.
10. Temperera en stor magnetiska kolumn placerad på en magnet med 3 mL SB.
11. Överföra cellsuspension från 2,9 till toppen av kolumnen skakad och låt det rinna av helt. KRITISKA steg: För att undvika klumpar av kolumnen, passera celler genom en 70 µm nylon mesh.
12. Skölj röret som innehöll cellerna med 3 mL is kallt SB och överföra bufferten direkt på kolumnen (vid filtrering, skölj 70 µm nylon mesh).
13. När bufferten har helt dräneras in i kolonnen, lägga till ytterligare 3 mL is kallt SB i kolumnen.
14. Upprepa steg 2.13 för en annan 3 mL tvätt.
15. Ta bort kolumnen från magnet och plats över en 15 mL koniska samlande röret.
16. Tillsätt 5 mL av is kallt SB på toppen av kolonnen och spola omedelbart cellerna ur kolumnen använda kolven. Upprepa detta en gång.
17. Centrifugera de insamlade cellerna (berikat relevanta tetramer positiv cell fraktion) vid 460 x g i 5 min och gå vidare till ytterligare antikropp färgning.
    Obs: Pool insamlade celler från alla rör, om så är lämpligt.

3. färgning av Ag-specifika mänskliga B-celler och Cell sortering

1. Återsuspendera cellpelleten med en cocktail av anti-humana antikroppar mot CD3 (slutlig spädning: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), och 7AAD (1: 1000) i en slutlig volym av 100 µL av PBS med 2% FBS. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C.
2. Tillsätt 10 mL PBS till celler, Centrifugera vid 460 x g i 5 min, och eliminera supernatanten. Upprepa detta en gång. Återsuspendera cellpelleten i 200 µL av PBS, filter på 70 µm nylon mesh.
3. Fortsätt att sortera specifika B-celler på enstaka cellnivå om en cell sorterare cytometer med ett 100 µm-munstycke och ett tryck på 20 psi utan att överskrida 1000 evenemang/s⁹.
   Obs: Den portande strategi som används visas i figur 1. Cellerna var först gated på CD14^–CD16^–7AAD^– celler att utesluta monocyter, NK och döda celler (visas inte i figur 1). Sedan CD19⁺ B celler valdes före gating på dubbel färgade celler av PE och APC relevanta Ag-tetramers. Icke-specifika B-celler har undantagits av gating på BV421 negativa celler (ofärgade av irrelevanta Ag-tetramer).
4. Samla in enstaka B celler i 8-strip PCR-rör tidigare fylld med 10 µL 1 x PBS och 10 enheter av RNAse Inhibitor och placeras på ett rack för 96 mikrorör. Genast frysa PCR-rören vid-80 ° C.
   Obs: Sortera maskerna valt på cytometer instrument är avkastningen mask: 0, renhet mask: 32 och fas mask: 0. depositionen encelliga kunde justeras till en 96 - eller 384-väl PCR-plattan om det behövs. Enda B-celler skall frysas så snabbt som möjligt och kan lämnas vid-80 ° C för flera veckor, om det behövs.

4. enda Cell RT-PCR

1. Lysera celler genom direkt uppvärmning de frysta proverna i PCR-remsor vid 70 ° C under 5 minuter i en torr bad.
2. Överföra remsor för att is och gå vidare till omvänd Transkription (RT) genom att lägga till 10 µL per tub med en 2 x huvudmixen buffert innehållande 1 mM dNTP, 25 µg/mL oligod(T) primers, 5 µM random hexamers, 20 enheter av RNAse inhibitor och 400 enheter av omvänt transkriptas.
   Obs: Efter cell upptining, RT måste ske snabbt för att undvika RNA nedbrytning.
3. Inkubera vid 25 ° C i 5 min att tillåta slumpmässiga hexamers att hybridisera, sedan Inkubera i 1 h vid 50 ° C, och avsluta med en inkubation vid 95 ° C under 3 min att stoppa reaktionen.
4. Fortsätt med två rundor av nästlade PCR-amplifiering för var och en av Regionkommittén kodning för variabel tunga (vH) och kappa (vLκ) eller lambda lätta kedjor (vLλ).
   Obs: Alternativt RT prover kan frysas vid-20 ° C och hållas i en vecka.
   1. För den första omgången av PCR, tillsätt 3 µL av cDNA för en 40 µL slutlig volym innehållande 1,5 mM MgCl₂, 0,25 mM dNTP, 2,5 enheter av DNA-polymeras och 200 nM av yttre primers (se figur 2 och Tabell av material för primer sekvenser).
      Obs: Sammansättning av yttre primers mix. För tung kedja förstärkning: 4 vanliga primers (LVH mix 5') och 2 omvända primers (CµCγ mix 3'). För ljus kappa kedja amplifiering, 3 framåt primers (5' LV | blanda) och 1 reverse primer (3' Cκ543-566). För lätta lambda kedja amplifiering, 7 framåt primers (5' LVl mix) och 1 reverse primer (3' Cl).
      Obs: Primers ritades av rorkulten et al. för förstärkning av alla tunga och lätta kedjan familj gener⁵.
   2. Tillämpa följande cykling villkor: 94 ° C i 4 min, följt av 40 cykler av 30 s vid 94 ° C, 30 s vid 58 ° C för VH och VLκ (60 ° C för VLλ) och 55 s vid 72 ° C, med en sista töjning steg vid 72 ° C under 7 minuter.
   3. För det andra runda PCR, använda 3 µL av den första förstärkning produkten för en slutlig volym av 40 µL innehållande 1,5 mM MgCl₂, 0,25 mM dNTP, 2,5 enheter av DNA-polymeras och 200 nM av inre primers som innehåller restriktionsenzym platser för kloning till uttryck vektorer (se figur 2 och Tabell av material för primer sekvenser).
      Obs: Sammansättning av inre primers mix. För tung kedja förstärkning: 9 vanliga primers (5' AgeIVH mix) och 3 omvända primers (3' SalIJH mix). För ljus kappa kedja amplifiering, 9 vidarebefordra primers (5' AgeIV | blanda) och 3 vända primers (3' BsiWIJκ mix). För lätta lambda kedja amplifiering, 6 framåt primers (5' AgeIVl mix) och 1 reverse primer (3' XhoICl).
      Obs: Primers ritades av rorkulten et al., för förstärkning av allt av tunga och lätta kedjan familj gener⁵.
   4. Tillämpa följande cykling villkor: 94 ° C i 4 min, följt av 40 cykler av 30 s vid 94° C, 30 s vid 58 ° C för VH och LCκ (60 ° C för LCλ), och 45 s vid 72 ° C med en slutlig töjning steg vid 72 ° C under 7 minuter.
5. Identifiera positiva brunnar genom att migrera 5 μl av PCR-produkter av vH, vLκ och vLλ på en 1,5% agarosgel (500 bp produkter för kodning segment av variabel tung kedja) och en 350 bp produkt för variabel ljusslinga kodning segment.
6. Rena de återstående 35 µL PCR produkter från positiva brunnarna med ultrafiltrering membran avsedd för rening av PCR-produkter som återstår.
7. Eluera PCR-produkter med 60 µL av H₂O.

5. redovisning kloning

1. Förbereda skär
   Obs: Smälta 60 µL av varje renat PCR produkt i en slutlig volym av 100 µL som innehåller lämpliga restriktionsenzym bufferten.
   1. För vH PCR-produkter, lägga till 50 enheter av AgeI och 50 enheter av SalI, och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
   2. För vLλ PCR-produkter, lägga till 50 enheter av AgeI och 50 enheter av XhoI och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
   3. För vLκ PCR-produkter, lägga till 50 enheter av AgeI och inkubera i 1 timme vid 37 ° C. Rena smälter med 96 PCR-membran och eluera med 60 µL av H₂O. Digest 60 µL eluatet i en slutlig volym av 100 µL av BsiWI restriktionsenzym buffert, lägga till 50 enheter av BsiWI och inkubera i 1 h vid 55 ° C.
   4. Inaktivera enzymer genom uppvärmning vid 80 ° C i 15 min.
2. Beredning av uttrycker vektorer
   Obs: klonade vH PCR-produkter i ett uttryck vektor (HCγ1) som innehåller den konstant tung kedjan Cγ1 av IgG1. vLκ PCR-produkter är klonade i ett uttryck vektor (LCκ) som innehåller den konstant lätt kedjan Cκ. vLλ PCR-produkter är klonade i ett uttryck vektor (LCλ) som innehåller den konstant lätt kedjan Cλ.
   1. Utföra de följande tumörheterogenitet:
      1. Blanda 1 µg yttrandefrihet vektor HCγ1 med 10 enheter av AgeI och 10 enheter av SalI endonucleases i en total volym av 20 µL av begränsning buffert rekommenderas av tillverkaren och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
      2. Blanda 1 µg uttryck vektor LCκ med 10 enheter av AgeI restriktionsenzym i en total volym av 20 µL av begränsning buffert rekommenderas av tillverkaren och inkubera i 1 timme vid 37° C. Lägga till 10 enheter av BsiWI restriktionsenzym och inkubera i 1 h vid 55 ° C.
      3. Blanda 1 µg uttryck vektor LCλ med 10 enheter av AgeI och 10 enheter av XhoI endonucleases i en total volym av 20 µL av begränsning buffert rekommenderas av tillverkaren och inkubera i 1 timme vid 37 ° C
   2. Värm varje matsmältningen blandning vid 65 ° C i ca 10 min att inaktivera restriktionsenzym.
   3. Utföra ligatur av 5 µL av smält PCR-produkt med 2 µL (100 ng) av motsvarande linearized uttryck vektor i en total volym på 20 µL av 1 x DNA-ligase buffert med 1 enhet av T4 DNA-Ligase genom inkubation över natten vid 4 ° C.
      Obs: Alternativt ligering utförs för 3 h vid 4° C.
3. Kloning
   1. Electroporate 1 µL 20 µL ligering blandningen i 45 µL av hemmagjord electrocompetent TOP10 E. coli (nuvarande protokoll i molekylärbiologi, avsnitt 1.8.4-1.8.8). Omedelbart tillsätt 500 µL av 2 X YT medium och inkubera i ett vattenbad vid 37 ° C i 30 min. spridning omvandlas bakterier på 2 x YT ampicillin plattor. Inkubera över natten vid 37 ° C.
   2. För varje omformning, skärm åtta kolonier med PCR.
      1. Ställa in en reaktion premix enligt följande på is: 45 µL av 5 x 12 µL av MgCl₂ (25 mM), 4 µL av dNTP (från ett lager som innehåller 10 mM av varje), PCR Buffer, 10 µL framåt primer (lager 10 µM) korsa att sekvensen vektor (primer Ab-vec-känsla) , och 10 µL reverse primer (lager 10 µM) inriktning regionen konstant tungt eller lätt kedja (se Tabell av material för primer sekvenser). Tjäna upp till en slutlig volym av 200 µL med H₂O. Tillsätt sedan 4 µL av DNA-polymeras enzym (5 U/µL).
      2. Fördela 25 µL reaktion premix per 8-strip PCR-röret på isen.
      3. Använd en steril tandpetare för att plocka upp enskilda kolonier. Strimma tandpetare på 2 x TY ampicillin plåt att utgöra en replikera tallrik och sedan doppa den i en PCR-reaktion tube.
      4. Utföra screening PCR på följande cykling villkor: 94 ° C i 10 min, följt av 25 cykler av 30 s vid 94 ° C, 30 s vid 55 ° C och 50 s vid 72 ° C.
      5. Identifiera positiva bakterier genom att migrera 5 µL av PCR-produkter på en 1,5% agarosgel.
         Obs: Positiva kolonier ger en PCR produkt runt 850 bp för tung kedja vector och 600 bp för lätt kedja vector.
   3. Inokulera fyra positiva kolonier från replikera plattan i 2 mL LB medium och inkubera över natten vid 37 ° C under skakning på 200 rpm.
   4. Extrahera plasmider från flytande kulturer med hjälp av en plasmid rening kit, som anges av tillverkaren.
   5. Verifierar korrekt insättning av variabel domäner av Sanger sekvensering av plasmidsna med Ab-vec-sense primer.
      Obs: Plasmider med rätta skäret (kodning på HC och motsvarande LC) skall vara cotransfected i 293A celler för sekretion. Specificiteten för liten skala-producerade mAbs har analyserats av ELISA. Storskalig produktion utförs sedan, om tillämpligt.

6. produktion av mAbs

1. Småskalig produktion för specificitet kontroll
   1. Dagen innan transfection, utsäde 15.000 mänskliga embryonala njure 293A (HEK 293A) celler i 200 µL av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% FBS per brunn i 96 brunnar. Inkubera över natten i en CO₂ inkubator (5% CO₂) vid 37 ° C.
   2. Cotransfect 293A celler DMEM medium innehållande 10% FBS använder en linjär polyethylenimine derivat som transfection reagens.
      Obs: Utföra transfection i exemplar. Följande protokoll är för en brunn av en platt bottenplattan med 96 brunnar.
      1. Späd 0,5 µL av DNA transfection reagens till 10 µL av 150 mM NaCl. Späd 0,125 µg för vH och vL uttrycker vektorer 0,125 µg till 10 µL av 150 mM NaCl. Vortex varje utspädning för 10 s.
      2. Tillsätt 10 µL utspädd DNA transfection reagens i 10 µL DNA lösning. Vortex 15 s och inkubera i 15 min i rumstemperatur. Tillsätt 20 µL mixen drop-wise på 293A celler och blanda genom att försiktigt virvlande plattan.
   3. Ersätta den medelstora 16 h efter transfection och kultur celler under 5 dagar i serumfritt medium.
      Obs: Använd serumfritt medium för att undvika serum Igs kontaminerande producerade antikroppar.
   4. Eliminera celler och skräp genom centrifugering vid 460 x g i 5 min.
   5. Skörda supernatanterna genom aspiration med en flerkanalig pipett och överföra dem till en V-botten 96 brunnar platta.
   6. Coat relevanta Ag övernattning på 4 ° C i 100 µL per brunn av rekonstituerade ELISA/ELISPOT beläggning buffert 1 x med en slutlig koncentration på 2 µg/mL i 96 brunnar ELISA-plattorna. Se exempel i ⁹.
   7. Blockera brunnar med 10% FBS DMEM medium för 2 h vid 37 ° C
   8. Tillsätt 50 µL av supernatanterna transfekterade 293A celler från steg 6.1.5 och inkubera i 2 h på RT.
   9. Tillsätt 100 µL av en anti-humant IgG Ab konjugerat till pepparrotperoxidas (HRP) enzymet på 1 µg/mL och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Tillsätt 50 µL kromogent substrat (TMB) och inkubera i 20 min.
   10. Läs optisk densitet vid 450 nm på en spektrofotometer.
       Obs: Den specifika mAbs avslöjades av ELISA-testet ytterligare kan produceras i stor skala och renas på protein en kolumn som presenterar affinitet för humant IgG.
2. Storskalig produktion och rening av specifika mAbs
   1. Dagen innan transfection, utsäde 6 x 10⁶ mänskliga embryonala njure 293A (HEK 293A) celler till 175 cm² kolvar som innehåller 25 mL DMEM kompletteras med 10% FBS. Inkubera över natten i en CO₂ inkubator (5% CO₂) vid 37 ° C.
      Obs: Celler bör vara 70% konfluenta när transfekterade.
   2. Cotransfect 293A celler DMEM medium innehållande 10% FBS använder en linjär polyethylenimine derivat som transfection reagens.
      1. Späd 50 µL av DNA transfection reagens in 450 µL av 150 mM NaCl. Späd 10 µg av vH och 10 µg av vL uttrycker vektorer in 500 µL av 150 mM NaCl. Vortex 10 s varje utspädning.
      2. Lägger till utspädda DNA transfection reagenset i DNA-lösningen. Vortex 15 s och inkubera i 15 min i rumstemperatur. Tillsätt 1 mL mixen drop-wise till cellerna, och blanda genom att försiktigt snurra kolven.
   3. Ersätta den medelstora 16 h efter transfection och kultur celler under 5 dagar i serumfritt medium.
   4. Skörda medium genom att aspirera med 25 mL pipett.
   5. Eliminera celler och skräp genom centrifugering vid 460 x g i 5 min.
   6. Rena antikroppar med en 1 mL kolonn belagd med protein A på ett snabbt protein vätskekromatografi (FPLC) system vid 4 ° C.
      1. Temperera proteinet en sepharose kolumn med 20 mM fosfatbuffert (pH 7).
      2. Filtrera cellodlingsmedium från 6.2.5 använda ett 1,22 µm filter, sedan ett 0,45 µm filter.
      3. Ladda det filtrerade mediet på kolumnen.
      4. Tvätta med 20 mM fosfatbuffert (pH 7) och eluera med en 0,1 M citratbuffert (pH 3,5).
      5. Läs optiska densiteter på 280 nm på en absorption spektrofotometer och omedelbart neutralisera proteinhaltiga fraktioner med 1 M Tris buffert (pH 9).
   7. Dialyze renat Ab övernattning på 4 ° C i en kassett med 3.5K molekylvikt cutoff mot PBS-bufferten (pH 7,4).
   8. Sterilisera i 0,2 µm filtrering och kontroll renhet genom storlek-utslagning kromatografi, som anges av tillverkaren.

Representative Results

Start från PBMC från friska donatorer, detta projekt presenterar generationen av mänskliga mAbs, som erkänner peptiden Pp65₄₉₅ (Pp65, från human cytomegalovirus) presenteras av klassen stora histocompatibility komplex jag (MHC-jag) molekylen HLA - A * 0201 () HLA-A2). Dessa mAbs kan diskriminera mellan detta komplex och komplex som representerar andra peptider som lastas den samma MHC-I molekylen.

Laboratoriestammar var fläckad med HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC och HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers som beskrivs i ovanstående protokoll. Efter immunmagnetisk cell anrikning av PE - och APC-tetramer positiva celler, var de eluerade cellerna färgas med ytterligare mAbs. På flow flödescytometri cell Sorteraren, magnetiskt berikad celler var först gated på livskraftiga CD14^–CD16^–CD3^–CD19⁺ undertröjor (B-celler). Figur 1 visar den portande strategi som används för att isolera B-celler som uttrycker BCR kunna diskriminera mellan HLA-A2/Pp65 och andra relaterade HLA-A2/peptid komplex. Urval av B-celler av intresse utfördes efter gating på HLA-A2/Pp65 PE⁺ och HLA-A2/Pp65 APC⁺ dubbel-positiva, för att utesluta fluorokrom specifika B-celler som var ensamma färgas PE⁺ eller APC⁺. Slutligen identifierades mycket specifika B-celler av gating på HLA-A2/MelA2-BV421 negativa celler. Detta möjliggör identifiering av B-celler som uttrycker BCR kunna binda HLA-A2/Pp65, i en peptid och HLA-A2-beroende sätt diskriminera dessa B-celler och de riktade mot β2-mikroglobulin, biotin, HLA-A2 eller de som inte diskriminerar mellan peptider i MHC bindande spåret. Alla dessa sistnämnda celler blir BV421 positiva celler. Som tidigare visat och ytterligare dokumenterat med andra typer av Ag, denna utslagning strategi är viktigare på grund av ökningen av B-celler för Ag⁹diskriminerande förmåga.

När enstaka specifika B-celler sorterades, cDNAs kodning för tunga och lätta Ig-kedjor var förstärks av RT-PCR. Par av tunga och lätta kedjan kodning segment erhölls i cirka 50% av enstaka B celler testade (tabell 1). Variabla domänen sekvenser var sedan klonade in uttrycket vektorer som innehåller motsvarande konstant domän sekvenser (tunga konstant 1 och lätt konstant κ eller λ). Mänskliga embryonala njurceller (HEK, 293A celler) var cotransfected med tunga och lätta kedjan vektorer. De utsöndrade mAbs av IgG1 isotypen skördats från cellkulturer av 293A celler 5 dagar efter transfection (se figur 3 för den globala strategin fullt humana mAbs produktion). Detta producerade framgångsrikt en HLA-A2/Pp65 antikroppsreaktion start från 3 enda B-lymfocyter celler ger par av tunga och lätta kedjan kodning segment (tabell 1). ELISA-analyser visade tydligt att denna mAb gjordes både MHC - och peptid-beroende för dess bindning till HLA-A2/Pp65 komplex (figur 4A), och flera milligram av mAb producerades lätt för vidare analys (t.ex., det affinitet analyser, funktionella analyser). Dess affinitet, bestäms av ytan plasmon resonans (SPR), var ca 7 x 10^-6 M (figur 4B).

Sålunda, den här artikeln beskrivs en kombination av känslig och effektiva metoder som tillåter i) identifiering av relevanta Ag-specifika B-celler, när närvarande även vid mycket låga frekvenser i blodet hos friska donatorer och ii) generering av mycket diskriminerande mänskliga mAbs.

Figur 1: Påvisande av HLA-A2/Pp65 specifika B-celler från mänskliga PBMC.
3 x 10⁸ Laboratoriestammar var fläckad med HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC och HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers. Efter immunmagnetisk cell anrikning av PE - och APC-tetramer positiva celler, var de eluerade cellerna färgas med ytterligare mAbs. På ett flöde flödescytometri cell sorterare, celler var gated först på livskraftiga singlet CD14^–CD16^– lymfocyter (visas inte), sedan på CD19⁺CD3^– celler. Sedan, B-celler som färgas med både HLA-A2/Pp65-PE och HLA-A2/Pp65-APC tetramers var inhängnat. Den HLA-A2/MelA-BV421 tetramer användes för att utesluta B-celler som inte kände igen HLA-A2/Pp65, på en peptid och MHC-beroende sätt.

Figur 2: strategi för amplifiering och kloning av Ig gener. Lätta och tunga Ig-kedjan-kodning gener var förstärks av kapslade RT-PCR. Första PCRs utfördes med en blandning av framåt primers korsa ledare regionen och omvänd primers specifika för konstant regioner av lämpliga tung, ljus kappa eller lambda lätta kedjor. Andra primärvården utfördes med primers som innehåller begränsning platser, framåt och bakåt primers var respektive specifika för början av V segment och slutet av J segment. PCR-produkter var sekvenserade, smält med restriktionsenzym och klonade i uttrycket vektorer som innehåller lämpliga konstant domäner. CMV: cytomegalovirus arrangören; AmpR: motstånd genen för ampicillin.

Figur 3: Övergripande strategi för återuppbyggnad av rekombinant human mAbs.
En tetramer sortering strategi tillåter identifiering av B-celler av intresse. Mycket specifika B-celler var encelliga sorterade. Lätta och tunga Ig-kedjan-kodning segment var förstärkt med RT-PCR. Variabla domänen sekvenser var klonade in separata eukaryota uttryck vektorer i ram med gen segment kodning konstant lätta och tunga regioner. De motsvarande helt human mAbs var uttryckt av övergående transfekterade HEK 293A celler och renas från kulturen supernatant. Denna siffra ändrades från Ouisse et al. (2017) ⁹.

Figur 4: Karakterisering av en representativ mycket diskriminerande mAb mot HLA-A2/Pp65 genereras från perifert blod cirkulerar B-celler.
A) specificitet av mAb PC1.02 mot HLA-A2/Pp65 testad av ELISA. Plattorna var belagda med relevanta (HLA-A2/Pp65) eller irrelevanta HLA-A2 komplex som innehåller HLA-A2-begränsad peptider: MelA, NS3 (HCV-1), och GagP17 (HIV-1) på 2 µg/mL, den mAb PC1.02 lades och en anti-humant IgG-HRP Ab användes för detektion. Optiska densiteter (OD) lästes vid 450 nm. B) affinitet bestämning av mAb PC1.02 med ytan Plasmon resonans (SPR) genom rinner olika koncentrationer av HLA-A2/Pp65 komplex över CM5 chip-bundna mAb. Denna siffra ändrades från Ouisse et al. (2017) ⁹.

	Antal PBMC	Antalet PE + APC + celler efter anrikning	Antal uteslutna (BV421 +) celler	Antal sorterade enstaka celler	Antal analyserade brunnar	Antal brunnar med HC och LC associerade (% återvinning)	Antal mAbs produceras	Antalet särskilda mAbs
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02)	3 x 108	818	117	161	7	3 (43%)	3	1

Tabell 1: Analys av HLA-A2/Pp65 specifika B-celler.
Effekterna av strategin uteslutning av ospecifika B-celler, avkastningarna av Ig gen amplifiering, och mAb produktion från isolerade HLA-A2/Pp65 specifika B-celler var utvärderas/mätt.

Discussion

Föreslagna protokollet är en kraftfull metod för generering av mänskliga mAbs direkt från Ag-specifika B-celler som cirkulerar i blodet. Den kombinerar tre viktiga aspekter: (i) användning av en tetramer-associerade magnetiska berikning, som tillåter en ex vivo -isolering av även sällsynta Ag-bindande B-celler; (ii) en Usenets strategi som använder tre Ag tetramers (två relevanta ettor och en irrelevant en) märkt med tre olika fluorokromer för att isolera, genom flödescytometri, bara de B-celler som uttrycker en BCR specifikt för önskad Ag; (iii) återuppbyggnaden av den motsvarande rekombinant mAb cDNAs av RT-PCR vid enstaka cellnivå och uttryck för cDNAs i mänskliga celler.

Tidigare studier föreslog en eller två fluorescerande relevanta antigener för att märka mänskliga B celler innan sorterings- och efterföljande produktion av mAbs från isolerade B celler^6,7,8. En analys hos patienter med reumatoid artrit, och en i en autoimmun musmodell, har associerat irrelevant fluorescerande antigen att karakterisera autoreaktiva B-celler och avgöra deras frekvens^10,11. Såvitt vi vet, användning av en kombination av två fluorescerande relevanta antigen-tetramers och en irrelevant antigen tetramer har inte beskrivits tidigare för berikning av specifika B-celler innan används för produktion av helt human mAbs. Denna optimerad metod tillåter fullt humana diskriminerande mAbs att erhållas i så lite som en månad, och kan utföras framgångsrikt även när start från en naiv B-cell repertoar. Således, det har ingen av de stora nackdelarna med phage display, mänsklig B cell immortalization, eller andra tidigare beskrivits molekylärbiologi-baserade mAb återuppbyggnad förfaranden.

Denna cell sortering strategi resulterar i en hög kapacitet återhämtning av Ag-specifika mänskliga mAbs. Par från enstaka isolerade B celler segment på tunga och lätta kedja förstärks med en framgång på runt 50%. Ljusslinga segment förstärks nästan alltid, men detta är inte fallet för tung kedja segment. RT-PCR effektivitet beror starkt på respektera följande punkter: jag) sorterade enda B-celler skall frysas så snabbt som möjligt. (II) lägga till 30 enheter av RNase inhibitor och minimera tiden mellan tar de B-cellerna ur frysen och lanserar den RT-reaktionen; (III) upptining alla grundfärger på is; IV) aldrig upptining frysning/primers mer än tre gånger; v) strumpa primers för högst ett år.

När det gäller produktionseffektiviteten i den motsvarande rekombinant mAbs med önskad specificitet är det ca 30-40% av fallet för pMHC särskilda mAbs. Dessa särskilda mAbs har att erkänna både peptiden och MHC molekylen, som är ganska krävande, och vi har tidigare visat att den totala avkastningen av återvinning av specifika mAbs riktad mot mer konventionella antigener är överlägsen, upp till 100% för de Β-galaktosidas antigen⁹. Det måste understrykas att valet av en lämplig Ag för de irrelevanta tetramer är viktigt att öka specificiteten för den mAbs produceras.

Frändskapet av den anti-HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) beskrivs i denna artikel är relativt låg, 7 x 10^-6 M, liknar en TCR affinitet. Detta resultat var väntat, eftersom B-cell isolering utfördes från naiva givare. De flesta tetramer⁺ B-celler var IgM⁺IgG^-, vilket minskar sannolikheten för att erhålla bra Ag-bindemedel. Dock kan denna metod också möjliggöra sortering av korsa-reactive minne B celler mot en önskad Ag från naiva givare, på grund av immunologiska förflutna individer¹². Dessutom, denna metod är enkelt tillämplig till vaccinerade eller infekterade patienter eller immuniserade humaniserad djur, som beskrivs i ⁹, där i vivo samhörighet mognad kan öka resulterande mAbs affinitet till ca 1 x 10^-9 M. olika förfaranden har också beskrivits för att förbättra frändskapet av mAbs i vitro, särskilt genom reproducera somatisk hypermutation i celler som uttrycker antikroppen (ses i ¹³).

Sammanfattningsvis föreslår vi en mångsidig strategi för mycket diskriminerande mAbs produktion som kan användas i olika typer av situation, från en naiv enskilda vaccinerade givare eller en patient som lider av en autoimmun sjukdom. Helt human mAbs genereras på detta sätt mot en önskad epitop kunde vara användbart både för grundläggande forskning och immunterapi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003