Summary
Vi præsenterer her, en protokol til isolering af hele, intakt mus mælkekirtlerne for at undersøge ekstracellulære matrix (ECM) udtryk og duktalt morfologi. Musen #4 abdominal kirtler blev udvundet fra 8-10 uge gammel kvinde har født mus, fast i neutral bufferet formalin, snit og farves ved hjælp af Immunhistokemi for ECM proteiner.
Abstract
Målet med denne procedure var at høste #4 abdominal mælkekirtler fra har født hunmus for at vurdere ECM udtryk og duktalt arkitektur. Her, blev en lille lomme under huden oprettet ved hjælp af Mayo saks, giver mulighed for adskillelse af kirtler i det subkutane væv fra den underliggende bughindebetændelse. Visualisering af kirtler blev hjulpet på vej af brugen af 3,5 x-R kirurgisk mikro loupes. Pelt blev omvendt og besejrede tilbage giver identifikation af de intakte brystkirtler fedtpuder. Hver af de #4 abdominal kirtler var ligefremt dissekeret af glidende skalpel klinge lateralt mellem det subkutane lag og kirtler. Straks efter høst, kirtler var placeret i 10% neutrale bufferet formalin til efterfølgende væv forarbejdning. Excision af hele kirtlen er fordelagtig, fordi det primært eliminerer risikoen for at udelukke vigtige væv-wide interaktioner mellem duktalt epitelceller og andre microenvironmental cellular populationer, der kan blive savnet i en delvis biopsi. En ulempe ved metoden er brugen af seriel afsnit fra faste væv, som begrænser analyser af duktalt morfogenese og protein udtryk til diskrete placeringer i kirtlen. Ændringer i duktalt arkitektur og protein udtryk i 3 dimensioner (3D) er som sådan ikke let opnåelige. Samlet, teknikken er gældende for undersøgelser som kræver helt intakt murine mælkekirtlerne for downstream undersøgelser såsom udviklingsmæssige duktalt morfogenese eller bryst kræft.
Introduction
Brystkræft er karakteriseret ved en betydelig grad af væv fibrose1,2,3,4. Omtales som ECM, denne ikke-cellulære enhed findes i varierende grader i alle væv og består primært af en kompleks meshwork af fibrillar og ikke-fibrillar collagens, elastin, og glykoproteiner ud over forskellige signaling molekyler, der er afsondret i denne matrix. Homeostatiske betingelser styres deposition og nedbrydning af ECM stramt. 5 under bryst tumordannelse, balance af ECM deposition og nedbrydning er forstyrret. Som sådan, er brysttumorer blevet rapporteret at udtrykke rigelige ECM proteiner som collagens, fibronektin og tenascin-C blandt andre. 6 den unormale udtryk for disse proteiner ud over øget mønstre af matrix crosslinking har dokumenteret for at fremme bryst tumor progression, metastaser og terapi modstand1,3, 4,7,8,9.
For at vurdere ECM sammensætning og duktalt morfologi, blev isolation af intakt mælkekirtlerne udført. Her, vi brugte har født hunmus mangelfuld til caveolin-1, en integreret membran protein, som har været forbundet med en aggressiv bryst tumor signatur10,11,12, og kontrollere kvinde har født B6 mus. Histologiske forarbejdning og farvning af disse væv tilladt identifikation af flere ECM proteiner sammen med karakterisering af duktalt morfologi.
Samlet set giver isolering af hele, intakt mælkekirtlerne forskere mulighed for at undersøge vævet hele morfologiske eller cellulære forandringer i svar på eksogene og endogene faktorer. Ulemper ved teknikken, der er knyttet til analyser af 2 dimension (2D) væv sektioner i stedet for en 3D-perspektiv, hvilket ville give et mere komplet billede af den komplekse morfologi af duktalt træet. Betragtning af kompleksiteten af celle-celle og celle-ECM vekselvirkninger, der finder sted i mælkekirtlen, er isolering af hele, intakt kirtler fordelagtige for effektivt analysere duktalt morfologi og protein udtryk i forskellige regioner af den murine brystkirtler kirtel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
procedurer, der involverer dyr emner i denne protokol blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Philadelphia College af osteopatisk medicin og alle teknikker blev gennemført under strenge etiske retningslinjer.
1. prøven indkøb og forarbejdning
- Vælg passende animalske emne og sted i en CO 2 kammer. For dette eksperiment, bruge 8-10 ugers gammel kvinde har født B6. CG-Cav1tmMIs/J og C57BI/6J.
- Tænd gasflow til 30-40%. Når dyret er synligt bevidstløs efter ca 2 min, åbner gas ventil til fuld pres for en yderligere 5 min.
NOTE: Bekræfte dyrs død ved at observere synlige tegn på vejrtrækning (fx bevægelse af thorax) for en periode på 10 min. efter ophør af CO 2 levering. Hvis dyret er stadig i live, må det placeres tilbage i CO 2 sal. Cervikal dislokation kan også anvendes, selvom det ikke anbefales da blodet kan ophobes omkring mælkekirtlerne forstyrrer dissektion og resultater. - Efter offer, pin slagtet i en liggende stilling og mætte med 70% ethanol.
- Knivspids pelt lige over pubis med pincet og nick med små kirurgiske saks. Roterende saks, klippe pelt langs den ventrale midterlinjen flytter caudale til kranie.
- Med større saks eller en hemostat, ligefremt dissekere den subkutane fascia bilateralt, ved hjælp af forsigtighed ikke for at punktere bughinden. Skære langs de vandrette kanter i begge distale ender af incisionen.
- Pin pelt flaps åbne og sprøjte igen med 70% ethanol.
Bemærk: Selvom brugen af 70% ethanol tilladt bedre visuel skelnen mellem kirtel og den omkringliggende subkutane væv, være omhyggelig med at undgå udtørring af væv som følge af brug af denne løsning. For at undgå udtørring, skal du fjerne kirtlen i en tidsramme ikke må overstige 4 min. Som et alternativ til 70% ethanol, investigator kan også erstatte en generel isoleres buffer, som 1 x PBS, at undgå væv udtørring. - Lokalisere mælkekirtlerne af interesse, skub en #4 skalpel kniv langs indersiden af pelt flaps, skære mælkekirtlen og tilknyttede kutane fedtholdigt gratis fra dermis.
Bemærk: 3,5 x kirurgisk mikro loupes kan støtte i lettere visualisering af kirtler. - Straks nedsænkes nyligt isolerede kirtel i koniske rør indeholdende 10:1 løsning-væv volumen af 10% neutrale bufferet formalin for 24-48 h.
Bemærk: Afhængig af hensigten med undersøgelsen, mange alternative fikseringsmidler kan bruges som PARAFORMALDEHYD, ethanol for genomisk undersøgelser og kommercielt tilgængelige RNA bevare buffere. - Følg institutionelle protokoller til paraffin indlejring, indsende prøver til en kreditor til forarbejdning, indlejring, og udskæring/slide montering. Afsnit væv på 5 µm.
Bemærk: På grund af overskydende fedt omkringliggende kirtel, overveje at fjerne 100-200 µm væv før skæring og farvning.
2. Væv farvning
- Immunhistokemi
- sted dias til farves på varme blok sæt på 58 ˚C til 1 h til at smelte paraffin.
Forsigtig: Smeltning af paraffin voks kan løbe af dias. Nøje overvåge eller placere tørre under dias til at fange afstrømning voks.
Bemærk: Dette trin er ikke afgørende og må være hoppet. Hvis resultaterne ikke som forventet, tilføjer dette trin tilbage kan forbedre resultaterne. - Incubate dias i et dias krukke indeholdende 100% xylen i 30 min at sikre fuldstændig nedsænkning. Gentag engang.
Bemærk: på dette tidspunkt, visuel inspektion skal udføres for at sikre, at væv sektioner er gratis af fedtvæv og paraffin. Hvis yderligere fedtvæv eller voks er indlysende, neddykket diasset igen i xylen. Vær forsigtig, for at minimere tilføjet eksponering for xylen, da dette kan forårsage svind af væv. - Rehydrere væv i en slide krukke indeholdende 100% ethanol i 10 min. Gentag engang.
- Flytte dias til et dias krukke indeholdende 95% ethanol i 10 min. Gentag engang.
- Flytte dias til et dias krukke indeholdende 75% ethanol i 5 min.
- Flytte dias til et dias krukke indeholdende 50% ethanol i 5 min.
- Koge 10 mM en natriumcitratopløsning (pH 6.0) i en varmeplade eller en mikrobølgeovn og hæld i Coplin jar.
Forsigtig: Omhyggeligt overvåge løsning samtidig varme og sørge for at undgå at koge. Container vil blive meget varmt. Brug beskyttelse til at undgå forbrændinger. - Langsomt sted glider ind i Coplin krukke, sikre fuldstændig neddykning, og der inkuberes ved 100 ° C i 10 min at hente epitoper. Fjerne og forsigtigt tørre dias.
- Tegner en barriere omkring væv med en hydrofobe markør. Tilføje nok endogene enzym blocker (brintoverilte og natriumazid, tilgængelige kommercielt) til at dække væv og inkuberes i 10 min.
- Submerge dias i 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) i 10 min.
- Tilføje nok 10% æsel serum i 1 x PBS til at dække væv og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i en fugtig afdeling.
Bemærk: Eksperimentet kan være standset her ved at gemme diasene i befugtet kammeret ved 4 ° C natten over. Mens æsel serum blev anset for at give optimal farvning resultater, kan investigator ønske at teste forskellige sera som bovint serumalbumin (BSA), ged serum eller hest serum til at bestemme optimale resultater. Hvis du bruger BSA, investigator skal forberede denne friske før brug. - Dekanteres overskydende blokering fra dias og tilføje korrekt fortyndet primære antistof i 1% serum direkte til dias at sikre at vævet jævnt er dækket i løsning. Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur i en fugtig afdeling.
Bemærk: Dette trin kan videreføres i længere tid varighed med fugtigt kammer opbevares ved 4 ° C. Sørg for at medtage ordentlig negativ kontrol dias (f.eks. et dias med ingen primære antistof, kendt antigen-negative væv, etc.) på dette trin. - Forsigtigt vaske dias af flydende ca. 1 mL diH 2 O over væv og inkuberes i 1 Skift af 1 x PBS i 5 min.
- Dekanteres overskydende PBS og tilføje nok peberrodsperoxidase etiket for at dække væv og Inkuber i 30 min i en fugtig afdeling.
Bemærk: På dette trin skal investigator kan ønske at gå videre til fluorescerende farvning af fluorescently konjugeret sekundære antistoffer. Hvis det ønskes, den næste foranstaltninger beskrevet skal være ændret tilsvarende. - Forsigtigt vaske dias af flydende ca. 1 mL diH 2 O over væv og inkuberes i 1 Skift af 1 x PBS i 5 min.
- Gøre diaminobenzidine (DAB) plus kromogen løsning efter producent foreslog forhold og mix af vortex.
Bemærk: Mange færdige kits er kommercielt tilgængelige bortset fra den, der anvendes i denne protokol. - Decant overskydende buffer fra dias og tilsæt 2-3 dråber (10-50 µL) af kromogen pletten direkte til væv og Inkuber i 5 min i fugtigt kammer. Omhyggeligt vaske dias af strømmende ca. 1 mL diH 2 O over væv.
Forsigtig: DAB-kromogen er meget giftigt. Undgå direkte kontakt af pletten med hud og indsamle flow ud i farligt affald.
- sted dias til farves på varme blok sæt på 58 ˚C til 1 h til at smelte paraffin.
- Hæmatoxylin og Eosin (H & E)
- efter sidste skylning efter kromogen inkubation, dykke dias i Harris hæmatoxylin for 2-2,5 min. Skyl dias forsigtigt under rindende vand i 1-2 min.
Bemærk: Vær omhyggelig med at undgå direkte vandstråle på væv. - Submerge glider for 2-3 s i differentiering løsning (0,25 mL saltsyre i 100 mL ethanol 70%). Skyl dias forsigtigt under rindende vand for ca 1-2 min.
- Nedsænkes dias i blå agent (4,5 mg calciumcarbonat i 100 mL postevand, pH justeret til 9.4) for 60 s. Skyl dias i 95% ethanol for 30 s.
- Submerge dias i alkoholiske eosin Y for 2-3 min.
- Dehydrere væv i 2 ændringer af 95% ethanol i 1 min.
- Dehydrate væv i 1 ændre 100% ethanol i 1 min.
- Forsigtigt tørt dias med en fnugfri serviet. Anvende 1 dråbe (ca 100-200 µL) af syntetiske, ikke-vandige, harpiks-baserede montering medier til at skubbe og anvende coverslip.
Bemærk: Hvis en anden farvning metode blev valgt, en anden montering medier kan være nødvendig. For eksempel, hvis investigator valgte et fluorescerende-konjugeret sekundær antistof, en vandig mount ville være mere ideelt. - Tillade dias til at indstille natten over ved stuetemperatur.
- efter sidste skylning efter kromogen inkubation, dykke dias i Harris hæmatoxylin for 2-2,5 min. Skyl dias forsigtigt under rindende vand i 1-2 min.
- Picrosirius rød (PSR) farvning
- Vælg dias, der skal farves og følg Immunhistokemi protokollen gennem trin 6 (50% ethanol soak).
- Submerge dias i PSR pletten for 1 h.
- Nedsænkes dias i 0,5% eddikesyre til 1-2 s, to gange for at differentiere pletten.
- Dehydrere væv i 2 ændringer af 95% ethanol i 1 min.
- Dehydrate væv i 1 ændre 100% ethanol i 1 min.
- Klare dias ved kortvarigt nedsænkning i 100% xylen til om 3-4 s.
- Forsigtigt tørt dias med en fnugfri serviet. Anvende 1 dråbe (ca 100-200 µL) af syntetiske, ikke-vandige, harpiks-baserede montering medier til at skubbe og anvende coverslip.
3. Prøve analyse
- Duktalt analyse
- Vælg dias farves til α-SMA. Ved hjælp af en lys mikroskop udstyret med et kamera monteret mål, indsamle repræsentative billeder ved 20 X forstørrelse.
- Brug af ImageJ (NIH), skelne og tælle kanalerne i hvert billede. Disse kan optælles manuelt eller man kan tildele en numerisk score til individuelle kanaler. Hvis du vil tildele en numerisk score, åbne ImageJ og vælg Plugins. Næste Vælg analyser og vælg celle Counter fra drop down menuen. Klik på Initialiser derefter fremhæve Type 1 for at starte mærkning kanalerne. Når du er færdig, skal du vælge resultater at se duktalt Greven.
Bemærk: Vær omhyggelig med at kontrollere strukturer er duktalt og ikke vaskulære. - i ' sat måling ' indstillinger, tjek ' Perimeter ' og ' område ".
- Ved hjælp af polygonværktøjet frihånd tegne en streg omkring hver kanal på myoepithelial rum (synlighed hjulpet af α-SMA plet). Vælg ' foranstaltning ' og optage omkreds og areal.
- Igen ved hjælp af polygonværktøjet frihånd tegner en linje langs den apikale side af duktalt epitel i indre af lumen. Vælg ' foranstaltning ' og optage omkreds og areal.
- Trækkes fra omkredsen af den luminale rum fra omkredsen af rum, myoepithelial for at få omkredsen af duktalt epitel. Subtraher området af den luminale rum fra området i myoepithelial rum til at opnå området af duktalt epitel.
- Immunhistokemi analyse
- uploade brightfield billeder til en analytisk software, såsom ImageJ eller FIJI Suite.
Bemærk: Denne protokol skitserer trinnene til farvning analyse ved hjælp af ImageJ og IHC værktøjskasse plugin. - Åbner IHC værktøjskassen fra menuen Plugin. I den " Vælg Model " kombinationsboks, åbner, vælg passende pletten (dvs. H-DAB, PSR, osv.). Vælg den " farve " mulighed for at isolere pletten. Dette vil åbne en resultatvinduet.
Bemærk: Denne metode er passende, hvis en protein af interesse ligger i de ekstracellulære eller cytosole rum, eller er bundet til plasmamembran. Hvis protein af interesse er nukleare, vælge " kerner " vil lynhurtig plugin til at analysere billedet for positivt farves kerner. - Brug farve vælgeren skub til at sikre ordentlig isolering af pletten uden baggrund eller overdreven pletten.
Bemærk: Hvis den automatiske tilstand er afskåret fra opdager pletten eller ikke fører til acceptable billeder, tegne en firkant Region af interesse (ROI) over en identificeret, farves region. Vælg på vinduet IHC værktøjskasse " tog " til direkte plugin til de relevante mål. - Konvertere billedet til 16-bit. Gå til billede → Type → 16 bit.
- Tærskel billedet. Gå til billede → justere → Auto tærskel.
- Indstille måleskala billede ved at trække en streg ROI direkte over skalalinjen i billedet derefter tildele længde. Hvis du vil angive skalalinjen, gå til analyser → sat skala. Indtast antallet af pixel pr. den ønskede længde (f.eks. 120 pixels pr. 50 µm).
- Måler den resulterende område og mener grå værdi. Gå til analyser → sæt målinger og indsamle målingen ved at klikke på analyser → foranstaltning.
- uploade brightfield billeder til en analytisk software, såsom ImageJ eller FIJI Suite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hunmus har 5 par af mælkekirtler. Specifikt, er der et par af cervikal kirtler (#1), to par af thorax kirtler (#2 og #3), et par af abdominal kirtler (#4), og 1 par af lyskebrok kirtler (#5) (fig. 1A). Her, isoleret vi #4 kirtler, som de er let identificerbare. I nogle tilfælde blev både #4 og #5 kirtler isoleret sammen som skelnen mellem to var svært. For at isolere intakt #4 abdominal mælkekirtler, pelt var fastgjort og nøje adskilt fra den underliggende bughindebetændelse, afsløre placeringen af #4 kirtler angivet med en pil (figur 1B). #4 kirtler blev omhyggeligt skåret ud og kontrolleres for tilstedeværelse af eventuelle resterende subkutane eller muskel væv. Selv om disse ikke var identificeres i vores isolerede kirtler (figur 1C), vi opmærksom på væsentligt mere subkutane væv i fibronektin-farvede kirtler fra væv blokke hvor væv ikke var blevet fjernet før skæring (f.eks. overfladiske) (fig. 1D) versus kirtler i hvilke 100-200 µm væv fra vævet blok havde fjernet før skæring (f.eks. dyb) (figur 1E). For at få en bedre forståelse af væv fibrose i mælkekirtlen svar på eksogene og endogene faktorer, investigator måtte ønske at sammenligne fibrose i overfladiske versus dybe nedskæringer af kirtel. For andre analyser, kan det være en fordel for investigator punkt væv blok i halve, før proceduren væv udskæring og farvning hvis betydelige subkutane og/eller muskelvæv er til stede efter kirtel dissektion.
Efter isolering, var kirtler fast i 10% neutrale bufferet formalin, forarbejdet og sectioned til farvning. De trin, der bruges til at analysere kollagen interessetilkendegivelse ud over andre proteiner er afbildet i figur 2A. Repræsentative prøver af ECM proteiner kollagen, fibronektin og tenascin-C er vist i figur 2B. Pilene i hver af billederne viser tilstedeværelsen af kanalerne i disse væv (figur 2B).
For at kvantificere morfologiske træk af kanalerne, er det vigtigt at behandle de histologiske sektioner med omhu, da forkert håndtering kan resultere i beskadigede væv og kanaler, ikke som er målbare. Eksempler på forkert håndtering kan kører buffere eller vand direkte på væv, ved hjælp af buffere på en forkert temperatur eller forlader vævsprøver i barske buffere natriumcitrat og eddikesyre i en længere periode end angivet i protokollen. Et eksempel på en væv afsnit i hvilke væv skader opstod er vist i fig. 3A. Her, kan omfattende skader på væv observeres let som brud i kanalerne (fig. 3A). En afdeling som denne kan ikke anvendes til analyser af duktalt strukturer. Et eksempel på en intakt væv modellen hvor kanalerne er målbare og kvantificerbare er vist i figur 3B. Her, kanalerne er ikke blot præget af den omgivende fibronektin-farvede stroma, men er også kendetegnet ved tilstedeværelsen af en tæt bestand af epitelceller foring lumen af kanalerne (fig. 3B). Det er vigtigt at bemærke at musen mælkekirtlen under udvikling, indeholder en enkelt kanal ved fødslen fra som sekundære sidegrene spire, danner et mere kompliceret duktalt træ, som gennemgår en række forgrening og regression med hver estrous cyklus 13. selv om vi ikke har taget hensyn til estrous cyklus af dyr i disse eksperimenter, investigator kan ønske at gøre dette for at få oplysninger om duktalt numre uafhængigt af estrous cyklus. Investigator er henvist til en protokol af Caligioni14 , hvor fase af estrous cyklus synligt kan bestemmes. Med hensyn til kvantificering af kanalerne, tilstedeværelsen af flere duktalt strukturer i disse histologiske sektioner er ikke udtryk for flere unikke kanalerne, men er snarere udtryk for en mere udviklet duktalt træ som følge af duktalt udvækst. Til at optælle kanaler, kan man bruge et billede analyse software såsom ImageJ (NIH) til at tildele et nummer til individuelle kanaler i et væv afsnit. Investigator kan ønske at optælle kanaler som ændringer i duktalt numre, som kan være tegn på udviklingsmæssige abnormiteter eller en patologisk tilstand. Med hensyn til vores undersøgelse, vi mener, det øgede antal kanaler, et resultat af duktalt udvækst, er relateret til tab af caveolin-1, som kan drive den afvigende udtryk af vækstfaktorer som insulin vækst faktor 1 (IGF-1), en kendt mægler af musen duktalt vækst 15.
Ud over tilstedeværelsen af intakt kanalerne indeholder flere kanaler grene, angivet med pile i en fibronektin-farvede sektion (figur 3C). Med henblik på denne analyse, bør disse duktalt grene ikke betragtes som en separat duktalt struktur. Mens evaluering og måling af kanalerne, er det vigtigt at skelne mellem kanalerne fra vaskulære strukturer. Vaskulære strukturer kan ikke kun identificeres ved tilstedeværelsen af en endotel éncellelag foring lumen, men også ved tilstedeværelsen af en nuklear, eosinofil strukturer vejledende af røde blodlegemer (RBC) i lumen (figur 3D). Selvom tilstedeværelsen af eosinofil strukturer inden for lumen angiver RBC og foreslår Vaskulaturen, er forskydning af RBC under kirtel samling hele væv sektioner muligt. Det er tilrådeligt at bekræfte vaskulære strukturer bruger i endothelial markør CD31. Et eksempel på en histologisk del farves med CD31 er vist (figur 3D). For at kvantificere duktalt omkreds og areal, kan vektorer i ImageJ (NIH) henføres til skitsere myoepithelial grænsen (omkreds) og den luminale grænse i α-SMA-farvede væv sektion. Α-SMA, en markør af glatte muskelceller, blev brugt som det pletter de myoepithelial celler, som linje kanalerne. I billedet vist, viser den røde linje myoepithelial kanten, mens den blå linje viser den luminale kant (figur 3E). Regionen mellem de stromale og luminale rum, vist i skematisk, er området besat af den samlede stromale væv plus duktalt epitelceller (figur 3E).
Figur 1 : Isolering af hele, intakt mælkekirtlerne for histologiske analyser. (A) efter animalske offer, pelt blev omhyggeligt fjernet og besejrede tilbage for at eksponere mælkekirtler beliggende mellem dermis og bughinden. Skematiske viser de relative placering af den cervikale (#1), thorax (#'s 2 og 3), mavesmerter (#4) og lyskebrok (#5) kirtler. (B) den #4 abdominal kirtler, vist i dissekeret dyret og angivet med de røde pile, blev isoleret. (C) repræsentative eksempel på #4 abdominal kirtler isoleret fra en har født kvindelige B6 mus. (D) væsentlig subkutane væv fra kirtler i som ikke havde væv fjernet fra paraffin blok før skæring (fx overfladisk) var tilsyneladende efter farvning for ECM protein fibronektin. (E) Considerably mindre subkutane væv og flere fibronektin farves stromale væv blev observeret fra kirtler i som havde 100-200 µm væv fjernet fra paraffin blok før skæring (f.eks. dyb). Histologiske sektioner er fra repræsentative prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Histological forarbejdning og farvning. (A) skematisk gengivelse af trinene til histologisk forarbejdning. En anden serie af trin blev udnyttet til analyser af kollagen udtryk. (B) repræsentative billeder af ECM proteiner kollagen, fibronektin og tenascin-C fra kirtler i kvinde har født caveolin-1 mangelfuld dyr. Pilene for kollagen, fibronektin og tenascin-C angiver den tætte stroma foring kanalerne. PSR: Picrosirius rød. FN: fibronektin. Ti-C: tenascin-C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyser af duktalt arkitektur. (A) en fibronektin farves afsnit illustrerer omfattende vævsskader. Dette er kendetegnet ved tilstedeværelsen af pauser i duktalt strukturer (pile). (B) en fibronektin farves afsnit illustrerer tilstedeværelsen af intakt duktalt strukturer, som er præget af tilstedeværelsen af lumen, omgivet af et eller flere lag af epitelceller og en omkringliggende stroma. Pilene angiver individuelle duktalt strukturer. (C) en fibronektin-farvede billede fremhæver tilstedeværelsen af duktalt grene, som er angivet med pile. Bemærk kontinuitet af disse med lumen af en større duktalt struktur. (D) vaskulære strukturer (røde pile), kendetegnet ved en enkelt lag af celler og tilstedeværelsen af en nukleeret eosinofil strukturer til vejledende af røde blodlegemer, er ofte observeret i nærhed med kanalerne (sort pil). Lav forstørrelse er vist i billedet til venstre og en tilsvarende høj forstørrelse billede er vist til højre. Disse billeder var plettet med H & E og tenascin-C. CD31 blev brugt som positive markør i endothelial cellerne foring de vaskulære strukturer. Vist er en stor vaskulære struktur i hvilke CD31 positive celler er synlige foring lumen af fartøjet. Lav forstørrelse er vist i billedet til venstre og en tilsvarende høj forstørrelse billede er vist til højre. (E) duktalt omkreds blev målt i en α-SMA-farvede billede ved hjælp af en vektor (vist i rød) til at skitsere myoepithelial rum, mens duktalt område blev målt ved hjælp af en vektor (vist blå) at skitsere den luminale rum. Regionen mellem de stromale og luminale rum blev klassificeret som duktalt området. Skalalinjen = 50 µm. skematisk af en duktalt struktur fremhæve de områder hvorfra omkreds og areal blev målt. Ti-C: tenascin-C. Den histologiske sektion i figur E blev ændret fra: Thompson Christensen et al. 16 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I papiret, har vi beskrevet en teknik til at isolere intakt mus mælkekirtlerne downstream histologiske analyser af ECM udtryk og duktalt morfologi. Med hensyn til analyser af duktalt morfologi, giver denne metode mulighed for hurtig undersøgelse af duktalt arkitektur baseret ud af farvede histologiske sektioner. Andre metoder af duktalt analyser stole på injektioner af farvestoffer til aktiverer visualisering af duktalt træet, metoder, som kan være teknisk udfordrende og tidskrævende.
I brystkræft, er ECM blevet rapporteret at være unormal. 1 , 2 , 6 , 9 specifikt, ændringer i overflod og/eller cross-linking af ECM er blevet rapporteret til at påvirke tumor progression, metastaser og therapy resistance3,4,6,7 ,8,9. Derudover er ændringer i ECM milieu også blevet rapporteret at ændre duktalt epitelcelle morfologi og spredning17, potentielt fører til en situation, favorisere tumor indledning. Mens vi udnyttet en caveolin-1 mangelfuld dyremodel for at vurdere ændringer i ECM udtryk og duktalt morfologi efter tabet af caveolin-1, kan man anvende denne metode i en musemodel. For at vurdere ECM udtryk mønstre og duktalt arkitektur, beskriver vi en teknik til at isolere hele, intakt mælkekirtlerne for downstream histologiske analyser. Resultaterne fra denne metode gav robust analyser af ECM udtryk og glandulær morfologi. Vi fandt at analysere ECM udtryk, især fibronektin, fra afsnit hvori 100-200 µm overfladiske væv blev fjernet før skæring og farvning, givet et mere fuldstændigt billede af glandulær fibrose. Derudover fandt vi, at brugen af æsel serum i modsætning til BSA givet bedre kvalitet histologiske prøver hvori uspecifik farvning blev væsentligt reduceret.
For analyser af duktalt arkitektur er det vigtigt at bruge sektioner, hvor væv er intakt og indeholder kanaler hvor brud point, et resultat af ukorrekt væv håndtering og skæring, er ikke indlysende. Derudover er det vigtigt at skelne korrekt mellem duktalt grene, en anden parameter, der efterforsker måtte ønske at måle og vaskulære strukturer, som kan let identificeres ved deres éncellelag endothelium og eosinofil strukturer inden for den lumen ud over farvning med CD31. Mens kanalerne blev observeret i sektioner farvet for forskellige ECM proteiner, myoepithelial markør αSMA og H & E counterstaining, som fremhævet den cellulære del af kanalerne, optælling af kanaler og tilhørende filialer er opnåelige med H & E farvede væv sektioner alene. For mere detaljerede analyser af duktalt morfogenese eller analyser af tilstedeværelsen af præneoplastiske og/eller neoplastiske læsioner, kan en efterforsker ønske at udnytte Konfokal imaging for at evaluere levende ex-vivo væv. I dette tilfælde kan den samme teknik som er skåret ud hele kirtler anvendes med fiksering og væv operationstrin elimineret.
Kritiske trin i denne protokol omfatter anvendelse af kirurgisk mikro loupes, som ikke kun aktiveret en nøjagtig identifikation af #4 abdominal kirtler, men desuden tilladt dissektion af kirtlen fra overliggende dermis og underliggende bughindebetændelse. Udelukkelse af betydelige subkutane væv og muskler reduceret fedt-associerede forstyrrelser i farvning og histologi. Derudover til bedre identificere ECM udtryk ændringer i kirtlen, vi har fundet det nyttigt at fjerne 100-200 µm af væv blok, som hjalp fjerne resterende fedtvæv. Selvom hele mælkekirtlen isolation giver oplysninger om væv bred ændringer i stromale protein udtryk og duktalt morfogenese, beskrevet teknikken er begrænset til analyse af seriel afsnit fra fast, paraffin indlejrede væv. At etablere graden som er der sket ændringer i duktalt forgrening, hele mount billeddannelse af levende, ex-vivo væv ville være nødvendigt. Her kunne en investigator bruger Cre-Lox for at designe brugerdefinerede, betinget fluorescerende reporter bøjninger at studere kirtel specifikke protein interaktioner eller udnytte et farvestof for at belyse duktalt træet før imaging18. Ud over dette, ville yderligere analyse af proteiner af interesse i helhed af kirtel kræve anvendelse af vestlige skamplet eller massespektrometri eller andre høj overførselshastighed teknikker såsom cross-linking immunoprecipitation (CLIP) eller kromatin immunoprecipitation (ChIP). I dette tilfælde ville være dissekeret hele kirtler, sektioneret i små stykker og forarbejdet i overensstemmelse hermed for de efterfølgende analyser. Derudover kan man også bruge fluorescerende imaging på væv sektioner. Denne teknik ville være ideelt til at analysere flere proteiner og protein udtryk Co lokalisering i det samme væv.
I sammendrag beskriver vi en teknik, der tilbyder hurtige isolering af hele, intakt mælkekirtler og indeholder yderligere oplysninger om histologiske forarbejdning og duktalt analyser. Fremtidige ansøgninger af denne teknik kunne undersøge ECM udtryk og dermed forbundne ændringer i duktalt morfologi i tumor-bærende dyr. Analyser af kollagen orientering og fiber diameter, oplysninger, som kan være nyttige til at analysere væv tæthed, kan desuden også udføres på PSR farves sektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende April Wiles og Dr. Roger Broderson for hjælp til dyr obduktion og kirtel isolation, henholdsvis. Finansiering af dette arbejde blev støttet af Philadelphia College af osteopatisk medicin centre for kroniske lidelser af aldring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
