Summary
यहाँ, हम extracellular मैट्रिक्स (ECM) अभिव्यक्ति और डक्टर आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए पूरे, बरकरार माउस स्तन ग्रंथियों के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. माउस #4 पेट ग्रंथियों 8-10 सप्ताह पुराने महिला nulliparous चूहों से निकाले गए थे, तटस्थ बफर formalin में तय, खोदी और दाग ECM प्रोटीन के लिए immunohistochemistry का उपयोग कर ।
Abstract
इस प्रक्रिया का लक्ष्य ECM अभिव्यक्ति और डक्टर वास्तुकला का आकलन करने के क्रम में महिला nulliparous चूहों से #4 उदर स्तन ग्रंथियों फसल के लिए किया गया था । यहां, त्वचा के नीचे एक छोटी जेब मेयो कैंची का उपयोग कर बनाया गया था, अंतर्निहित से चमड़े के नीचे ऊतक के भीतर ग्रंथियों की जुदाई की अनुमति । ग्रंथियों के दृश्य 3.5 x-R सर्जिकल माइक्रो loupes के उपयोग से सहायता प्राप्त किया गया था । खाल औंधा और वापस बरकरार स्तन वसा पैड की पहचान की अनुमति टिकी थी । #4 उदर ग्रंथियों में से प्रत्येक कुंद स्केलपेल ब्लेड बाद में चमड़े के नीचे परत और ग्रंथियों के बीच फिसलने से विच्छेदित किया गया । तुरंत बाद फसल, ग्रंथियों के बाद ऊतक प्रसंस्करण के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में रखा गया था । संपूर्ण ग्रंथि के उत्पाद लाभप्रद है क्योंकि यह मुख्य रूप से महत्वपूर्ण ऊतक-प्रडक्टर उपकला कोशिकाओं और अंय microenvironmental सेलुलर आबादी है कि एक आंशिक बायोप्सी में याद किया जा सकता है के बीच व्यापक बातचीत को छोड़कर के जोखिम को समाप्त । पद्धति का एक दोष निश्चित ऊतकों से धारावाहिक वर्गों का उपयोग करता है जो ग्रंथि के भीतर असतत स्थानों के लिए डक्टर morphogenesis और प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण की सीमा है । जैसे, वाहिनी वास्तुकला में परिवर्तन और 3 आयामों में प्रोटीन अभिव्यक्ति (3 डी) आसानी से प्राप्य नहीं है । कुल मिलाकर, तकनीक इस तरह के विकास वाहिनी morphogenesis या स्तन कैंसर के रूप में बहाव की जांच के लिए पूरी बरकरार murine स्तन ग्रंथियों की आवश्यकता के अध्ययन के लिए लागू है ।
Introduction
स्तन कैंसर ऊतक फाइब्रोसिस1,2,3,4की एक पर्याप्त डिग्री की विशेषता है । ECM के रूप में संदर्भित, इस गैर सेलुलर इकाई सभी ऊतकों में डिग्री बदलती में पाया जाता है और मुख्य रूप से fibrillar और गैर fibrillar कोलेजन, elastin, और विभिन्न संकेतात्मक अणुओं है कि कर रहे हैं के अलावा नच के एक जटिल meshwork के शामिल है इस मैट्रिक्स में तनहा । समस्थिति शर्तों के तहत, ECM के जमाव और क्षरण कसकर नियंत्रित है । 5 स्तन tumorigenesis के दौरान, ECM जमाव और क्षरण का संतुलन बाधित होता है । जैसे, स्तन ट्यूमर के लिए दूसरों के बीच जैसे कोलेजन, fibronectin और tenascin-सी के रूप में प्रचुर मात्रा में ECM प्रोटीन व्यक्त की सूचना दी गई है । 6 मैट्रिक्स crosslinking के बढ़ा पैटर्न के अलावा इन प्रोटीन के असामांय अभिव्यक्ति स्तन ट्यूमर प्रगति, मेटास्टेसिस और थेरेपी प्रतिरोध को बढ़ावा देने के लिए प्रलेखित किया गया है1,3, 4,7,8,9.
ECM रचना और डक्टर आकृति विज्ञान, बरकरार स्तन ग्रंथियों के अलगाव का आकलन करने के लिए किया गया था । यहां, हम caveolin-1, एक अभिंन झिल्ली प्रोटीन जो एक आक्रामक स्तन ट्यूमर हस्ताक्षर करने के लिए जोड़ा गया है10,11,12, और नियंत्रण महिला nulliparous B6 के लिए कमी महिला nulliparous चूहों का इस्तेमाल किया चूहों. ऊतकीय प्रसंस्करण और इन ऊतकों के दाग डक्टर आकृति विज्ञान के लक्षण वर्णन के साथ साथ कई ECM प्रोटीन की पहचान की अनुमति दी ।
कुल मिलाकर, पूर्ण, बरकरार स्तन ग्रंथियों के अलगाव शोधकर्ताओं ऊतक चौड़ा रूपात्मक या सेलुलर exogenous या अंतर्जात कारकों के जवाब में होने वाले परिवर्तनों की जांच करने का अवसर देता है । तकनीक की कमियां 2 आयाम के विश्लेषण के साथ जुड़े रहे है (2d) ऊतक वर्गों के रूप में एक 3 डी परिप्रेक्ष्य है, जो डक्टर पेड़ के परिसर आकृति विज्ञान की एक और पूरी तस्वीर उपज होगा विरोध किया । कोशिका-कोशिका और कोशिका-ECM बातचीत की जटिलता को देखते हुए कि स्तन ग्रंथि में जगह ले, पूरे के अलगाव, बरकरार ग्रंथियों कुशलतापूर्वक murine स्तन के विभिंन क्षेत्रों में डक्टर आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण के लिए लाभप्रद है ग्रंथ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- उपयुक्त पशु विषय और एक सह 2 चैंबर में जगह का चयन करें । इस प्रयोग के लिए 8-10 सप्ताह पुरानी महिला nulliparous बी-6 का प्रयोग करें । सीजी-Cav1tmMIs/J and C57BI/6J.
- 30-40% करने के लिए गैस के प्रवाह पर बारी । एक बार जानवर के बारे में 2 मिनट के बाद दिख बेहोश है, एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए पूर्ण दबाव के लिए गैस वाल्व खोलो ।
नोट: श्वास के दर्शनीय लक्षण देख कर पशु मौत की पुष्टि ( जैसे छाती के आंदोलन) सह 2 वितरण की समाप्ति के बाद 10 मिनट की अवधि के लिए । यदि पशु अभी भी जीवित है, यह वापस सह 2 चैंबर में रखा जा सकता है । गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन भी इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि यह अनुशंसित नहीं है के रूप में खून स्तन विच्छेदन और परिणाम के साथ हस्तक्षेप ग्रंथियों के आसपास जमा हो सकता है । - निंनलिखित बलिदान, एक लापरवाह स्थिति में पिन लोथ और ७०% इथेनॉल के साथ संतृप्त ।
- चुटकी बस संदंश का उपयोग जघनरोम के ऊपर खाल और छोटे सर्जिकल कैंची के साथ निक । कैंची घुमाना, ventral midline चलती caudal को कपाल के साथ खाल काट. बड़ी कैंची या एक hemostat के साथ
- , कुंद टुकड़े चमड़े के नीचे प्रावरणी के लिए, सावधानी का उपयोग करने के लिए नहीं है । चीरा के दोनों बाहर के सिरों पर क्षैतिज मार्जिन के साथ कट.
- खाल फ्लैप पिन खुला और स्प्रे फिर से ७०% इथेनॉल के साथ.
नोट: हालांकि ७०% इथेनॉल का उपयोग ग्रंथि और आसपास के चमड़े के नीचे ऊतक के बीच बेहतर दृश्य भेद की अनुमति दी, इस समाधान के उपयोग का एक परिणाम के रूप में ऊतक के सूखने से बचने के लिए सावधान रहना । सुखाने से बचने के लिए, एक समय सीमा में ग्रंथि को दूर नहीं 4 मिनट से अधिक है । ७०% इथेनॉल के लिए एक विकल्प के रूप में, अंवेषक भी एक सामांय अलग बफर, ऐसे 1x पंजाबियों के रूप में प्रतिस्थापित कर सकते हैं, ऊतक सुखाना से बचने के लिए । - ब्याज की स्तन ग्रंथियों का पता लगाने, खाल फ्लैप के अंदर के साथ एक #4 स्केलपेल ब्लेड स्लाइड, स्तन ग्रंथि और संबंधित त्वचा वसा dermis.
से मुक्त काटने नोट: 3.5 x सर्जिकल माइक्रो loupes ग्रंथियों के आसान दृश्य में सहायता कर सकते हैं । - तुरंत शंकु ट्यूब में नव पृथक ग्रंथि जलमग्न 10:1 समाधान ऊतक की मात्रा 10% तटस्थ बफ़र्ड formalin 24-48 h.
के लिए नोट: अध्ययन की मंशा के आधार पर, कई वैकल्पिक fixatives ऐसे paraformaldehyde के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जीनोमिक अध्ययन के लिए इथेनॉल, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए संरक्षण बफ़र्स. - तेल embedding के लिए संस्थागत प्रोटोकॉल का पालन करें, प्रसंस्करण के लिए एक विक्रेता के लिए नमूने जमा, embedding, और टुकड़ा करने की क्रिया/ खंड के ऊतकों पर 5 & #181; m.
नोट: अधिक वसा आसपास के ग्रंथि के कारण, हटाने पर विचार 100-200 & #181, खोदी और धुंधला होने से पहले ऊतक के एम.
- Immunohistochemistry
- प्लेस स्लाइड पर सना हुआ हीट ब्लॉक ५८ पर सेट & #730; ग के लिए 1 ज के लिए तेल पिघला ।
चेतावनी: पिघलने आयल मोम स्लाइड बंद चला सकते हैं । अपवाह मोम पर कब्जा करने के लिए स्लाइड के तहत बारीकी से निगरानी या जगह पोंछना.
नोट: यह चरण आवश्यक नहीं है और छोड़ा जा सकता है । यदि परिणाम अपेक्षा के अनुरूप नहीं हैं, तो यह चरण वापस जोड़ने से परिणाम में सुधार हो सकता है. - पूर्ण डुबकी सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट के लिए १००% xylene युक्त एक स्लाइड जार में स्लाइड करना । एक बार दोहराएं ।
नोट: इस बिंदु पर, दृश्य निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि ऊतक वर्गों वसा ऊतक और तेल से मुक्त कर रहे है प्रदर्शन किया जाना चाहिए । यदि अतिरिक्त वसा ऊतक या मोम स्पष्ट है, स्लाइड xylene में फिर से जलमग्न होना चाहिए । सावधानी का प्रयोग करें xylene के लिए जोड़ा जोखिम को कम करने के रूप में इस ऊतक के सिकुड़ने का कारण बन सकता है । - एक स्लाइड जार में reहाइड्रेट ऊतक 10 मिनट के लिए १००% इथेनॉल युक्त एक बार दोहराएं ।
- एक स्लाइड जार में ले जाएं ९५% इथेनॉल युक्त 10 मिनट के लिए एक बार दोहराने ।
- 5 min. के लिए ७५% इथेनॉल युक्त एक स्लाइड जार करने के लिए स्लाइड ले जाएँ
- 5 min. के लिए ५०% इथेनॉल युक्त एक स्लाइड जार करने के लिए स्लाइड ले जाएँ
- एक गर्म थाली या एक माइक्रोवेव में 10 मिमी सोडियम साइट्रेट समाधान (पीएच ६.०) फोड़ा और Coplin जार में डालना ।
सावधानी: ध्यान से निगरानी समाधान जबकि हीटिंग और ध्यान रखना पर फोड़ा से बचने के । कंटेनर बहुत गर्म हो जाएगा । जलने से बचने के लिए सुरक्षा का प्रयोग करें । - धीरे Coplin जार में स्लाइड जगह, पूरा डुबकी सुनिश्चित करने, और १०० & #176 पर मशीन, epitopes पुनः प्राप्त करने के लिए 10 मिनट के लिए सी । निकालें और ध्यान से सूखी स्लाइड ।
- एक hydrophobic मार्कर के साथ ऊतक के आसपास एक बाधा आकर्षित । 10 min. के लिए ऊतक और मशीन को कवर करने के लिए पर्याप्त अंतर्जात एंजाइम अवरोधक (हाइड्रोजन पेरोक्साइड और सोडियम azide, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) जोड़ें
- में जलमग्न स्लाइड 1x फास्फेट खारा (पंजाब) 10 मिनट के लिए
- एक humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊतक और गर्मी को कवर करने के लिए 1x पंजाब में पर्याप्त 10% गधा सीरम जोड़ें ।
नोट: प्रयोग यहां humidified चैंबर में 4 & #176; सी रात भर स्लाइड को संग्रहित करके यहां ठहर सकता है । जबकि गधा सीरम इष्टतम धुंधला परिणाम उपज पाया गया था, अंवेषक के लिए अलग सीरा जैसे गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), बकरी सीरम या घोड़ा सीरम इष्टतम परिणाम निर्धारित करने के लिए परीक्षण करना चाहते हो सकता है । यदि BSA का उपयोग कर, जांचकर्ता इस ताजा उपयोग करने से पहले तैयार करना चाहिए ।
स्लाइड से - खिचड़ी भाषा अतिरिक्त अवरोधक और ठीक से 1% सीरम में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी को सीधे जोड़ सुनिश्चित करना है कि ऊतक समान रूप से समाधान में कवर किया जाता है स्लाइड । एक humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
नोट: यह चरण 4 & #176 पर संग्रहीत आर्द्र कक्ष के साथ अधिक समय अवधि के लिए जारी रखा जा सकता है; C. इस चरण में उचित नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड ( जैसे कोई प्राथमिक एंटीबॉडी, ज्ञात antigen-ऋणात्मक ऊतक, आदि के साथ कोई स्लाइड ) शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें । - ध्यान से स्लाइड धोने के बारे में बहने से 1 मिलीलीटर दीह 2 ओ पर ऊतक और 5 मिनट के लिए 1x पंजाब के 1 परिवर्तन में मशीन ।
- अतिरिक्त पंजाबियों और एक humidified चैंबर में 30 मिनट के लिए ऊतक और मशीन को कवर करने के लिए पर्याप्त सहिजन peroxidase लेबल जोड़ें ।
नोट: इस कदम पर, अंवेषक फ्लोरोसेंट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग दाग फ्लोरोसेंट के लिए आगे बढ़ना चाहते हो सकता है । यदि यह वांछित है, अगले कदम वर्णित तदनुसार संशोधित किया जाना चाहिए । - ध्यान से स्लाइड धोने के बारे में बहने से 1 मिलीलीटर दीह 2 ओ पर ऊतक और 5 मिनट के लिए 1x पंजाब के 1 परिवर्तन में मशीन ।
- बनाने diaminobenzidine (ढाब) प्लस chromogen समाधान के अनुसार निर्माता का सुझाव दिया अनुपात और भंवर से मिश्रण ।
नोट: कई तैयार किट व्यावसायिक रूप से एक अलग इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया से उपलब्ध हैं । - स्लाइड से अतिरिक्त बफर और जोड़ें 2-3 बूंदें (10-50 & #181; L) chromogen के सीधे ऊतकों को दाग और आर्द्र कक्ष में 5 मिनट के लिए मशीन । सावधानी से स्लाइड को धो के बारे में 1 मिलीलीटर दीह 2 ओ ओवर ऊतक बह रही है ।
सावधानी: ढाब-chromogen बेहद विषाक्त है । त्वचा के साथ दाग के सीधे संपर्क से बचें और खतरनाक कचरे में प्रवाह को इकट्ठा ।
- प्लेस स्लाइड पर सना हुआ हीट ब्लॉक ५८ पर सेट & #730; ग के लिए 1 ज के लिए तेल पिघला ।
- Hematoxylin व Eosin (ज & #38; ड)
- म् अंतिम कुल्ला chromogen के बाद, 2-2.5 min. कुल्ला स्लाइड के लिए Hematoxylin में पानी के नीचे स्लाइड के लिए 1-2 min.
नोट: पानी के ऊतकों पर सीधे जेट से बचने के लिए ध्यान रखना । - 2-3 s के लिए अंतर समाधान (०.२५ मिलीलीटर में हाइड्रोक्लोरिक एसिड की ७०% इथेनॉल की १०० मिलीलीटर) के लिए जलमग्न स्लाइड । कुल्ला के बारे में 1-2 min. के लिए नल का पानी के तहत धीरे से स्लाइड
- ब्लू एजेंट (४.५ मिलीग्राम कैल्शियम कार्बोनेट में १०० मिलीलीटर नल का पानी, पीएच ९.४ करने के लिए समायोजित) में जलमग्न स्लाइड ६० एस के लिए ९५% इथेनॉल में कुल्ला स्लाइड के लिए 30 एस 2-3 min.
के लिए शराबी eosin Y में - म् अंतिम कुल्ला chromogen के बाद, 2-2.5 min. कुल्ला स्लाइड के लिए Hematoxylin में पानी के नीचे स्लाइड के लिए 1-2 min.
- जलमग्न स्लाइड
- 1 मिनट के लिए ९५% इथेनॉल के 2 परिवर्तन में निर्जलीकरण ऊतक प्रत्येक.
- 1 min. के लिए १००% इथेनॉल के 1 परिवर्तन में निर्जलीकरण ऊतक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछ के साथ ध्यान से सूखी स्लाइड
- । 1 ड्रॉप लागू करें (के बारे में 100-200 & #181; एल) के सिंथेटिक, गैर जलीय, राल आधारित बढ़ते मीडिया स्लाइड और लागू coverslip.
नोट: यदि एक अलग धुंधला विधि चुना गया था, एक अलग बढ़ते मीडिया की आवश्यकता हो सकती है । उदाहरण के लिए, यदि अंवेषक एक फ्लोरोसेंट-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी चुना है, एक जलीय माउंट और अधिक आदर्श होगा ।
स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर रातोंरात सेट करने की अनुमति - ।
- स्लाइड का चयन करें दाग और कदम 6 (५०% इथेनॉल सोख) के माध्यम से immunohistochemistry प्रोटोकॉल का पालन करें ।
- में जलमग्न स्लाइड PSR 1 h. के लिए दाग
- ०.५% में जलमग्न स्लाइड 1-2 एस के लिए एसिटिक एसिड, दो बार दाग अंतर करने के लिए ।
- 1 मिनट के लिए ९५% इथेनॉल के 2 परिवर्तन में निर्जलीकरण ऊतकों प्रत्येक.
- 1 min. के लिए १००% इथेनॉल के 1 परिवर्तन में निर्जलीकरण के ऊतकों
- के बारे में 3-4 एस के लिए १००% xylene में संक्षेप में विलय द्वारा स्पष्ट स्लाइड्स एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछ के साथ ध्यान से सूखी स्लाइड
- । 1 ड्रॉप लागू करें (के बारे में 100-200 & #181; एल) के सिंथेटिक, गैर जलीय, राल आधारित बढ़ते मीडिया स्लाइड और लागू coverslip.
- नलिकात्मक विश्लेषण
- स्लाइड का चयन करें सना हुआ के लिए & #945;-SMA. एक प्रकाश एक कैमरा-उद्देश्य घुड़सवार, 20X आवर्धन पर प्रतिनिधि छवियों को इकट्ठा करने के साथ सज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करना ।
- का उपयोग ImageJ (NIH), भेद और प्रत्येक छवि में नलिकाओं गिनती । ये मैंयुअल रूप से गणना की जा सकती है या एक संख्यात्मक स्कोर व्यक्तिगत नलिकाओं को असाइन कर सकते हैं । एक संख्यात्मक स्कोर असाइन करने के लिए, ओपन ImageJ और Plugins का चयन करें. अगले का चयन करें विश्लेषण और ड्रॉप डाउन मेनू से सेल काउंटर चुनें । प्रारंभ क्लिक करें, और फिर लेबलिंग नलिकाएं शुरू करने के लिए प्रकार 1 हाइलाइट । समाप्त होने पर, डक्टर गणना देखने के लिए परिणामों का चयन करें.
नोट: संरचना और संवहनी नहीं संरचनाओं सत्यापित करने के लिए ध्यान रखना. - & #39; सेट मापन & #39; विकल्प, चेक & #39;P erimeter & #39; व & #39; लका & #34;.
- मुक्तहस्त बहुभुज उपकरण का उपयोग करके, myoepithelial डिब्बे में प्रत्येक वाहिनी के चारों ओर एक रेखा आरेखित करें (& #945 द्वारा सहायता प्राप्त दृश्यता;-SMA दाग) । Select & #39; नाप & #39; और परिधि और क्षेत्र को रिकॉर्ड करें ।
- फिर मुक्तहस्त बहुभुज उपकरण का उपयोग कर, लुमेन के इंटीरियर के भीतर डक्टर उपकला के शिखर पक्ष के साथ एक लाइन आकर्षित । Select & #39; नाप & #39; और परिधि और क्षेत्र को रिकॉर्ड करें ।
- वाहिनी उपकला की परिधि को प्राप्त करने के क्रम में myoepithelial डिब्बे की परिधि से चमकदार डिब्बे की परिधि घटाना. myoepithelial डिब्बे के क्षेत्र से चमकदार डिब्बे के क्षेत्र को घटाना करने के लिए डक्टर उपकला के क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए ।
- Immunohistochemistry विश्लेषण
- एक विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर के लिए brightfield छवियों को अपलोड करें, जैसे ImageJ या फिजी सुइट.
नोट: इस प्रोटोकॉल ImageJ और आइएचसी Toolbox प्लगइन का उपयोग कर विश्लेषण धुंधला के लिए कदम रूपरेखा । - प्लगइन मेनू से आइएचसी Toolbox खोलें. म & #34; चय मॉडल & #34; कॉंबो बॉक्स जो खुलता है, उपयुक्त दाग ( अर्थात H-ढाब, PSR, आदि ) का चयन करें । सना को अलग करने के लिए & #34; Color & #34; विकल्प का चयन करें । इससे एक रिजल्ट विंडो खुलेगी ।
नोट: यदि ब्याज की एक प्रोटीन extracellular या cytosolic रिक्त स्थान में स्थित है, या प्लाज्मा झिल्ली के लिए बाध्य है यह विधि उचित है । अगर प् याज का प्रोटीन न्यूक्लियर है तो उसका चयन & #34; नाभिक & #34; प्लगइन का संकेत होगा सकारात्मक दाग नाभिक के लिए छवि का विश्लेषण करने के लिए । - पृष्ठभूमि शामिल किए जाने या अत्यधिक दाग अपवर्जन के बिना दाग की उचित अलगाव सुनिश्चित करने के लिए रंग चयनकर्ता स्लाइड का उपयोग करें ।
नोट: यदि स्वचालित मोड दाग का पता लगाने में असमर्थ है या स्वीकार्य छवियों में परिणाम नहीं है, एक पहचान दाग क्षेत्र पर ब्याज की एक वर्ग क्षेत्र (रॉय) आकर्षित । आइएचसी उपकरण बॉक्स विंडो पर, चयन & #34; लेल & #34; प्लगइन को उचित लक्ष्य तक निर्देशित करने के लिए । - छवि को 16-बिट में कनवर्ट करें । गो इमेज & #8594; टाइप & #8594; & #160; 16 सा.
- थ्रेसहोल्ड छवि । गो Image & #160; & #8594; & #160; समायोजित & #8594; & #160; स्वत: थ्रेशोल्ड.
- छवि में पैमाने बार पर सीधे एक लाइन रॉय ड्राइंग द्वारा छवि माप पैमाने पर सेट तो लंबाई निर्दिष्ट । स्केल बार सेट करने के लिए, पर जाएं विश्लेषण & #8594; & #160; सेट स्केल. इनपुट लंबाई की वांछित इकाई प्रति पिक्सल की संख्या ( उदा १२० पिक्सल प्रति ५० & #181; m).
- परिणाम क्षेत्र को मापने और ग्रे मूल्य मतलब है । गो श्लेष & #8594; & #160; माप सेट और माप को क्लिक करके एकत्रित विश्लेषण & #8594; & #160; नाप.
- एक विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर के लिए brightfield छवियों को अपलोड करें, जैसे ImageJ या फिजी सुइट.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
महिला चूहों स्तन ग्रंथियों के 5 जोड़े हैं । विशेष रूप से, वहाँ एक जोड़ी ग्रीवा ग्रंथियों (#1), वक्ष ग्रंथियों के दो जोड़े (#2 और #3), पेट ग्रंथियों की एक जोड़ी (#4), और वंक्षण ग्रंथियों के 1 जोड़ी (#5) (चित्रा 1ए). यहां, हम #4 ग्रंथियों अलग के रूप में वे आसानी से पहचाने जाते हैं । कुछ परिस्थितियों में, दोनों #4 और #5 ग्रंथियों दोनों के बीच भेद के रूप में एक साथ अलग थलग पड़ गया था मुश्किल था । बरकरार #4 उदर स्तन ग्रंथियों को अलग करने के लिए, खाल पिन किया गया था और ध्यान से अंतर्निहित से अलग कर दिया, #4 ग्रंथियों के स्थान का खुलासा एक तीर द्वारा संकेत (चित्रा 1बी). #4 ग्रंथियों को ध्यान से किया गया और किसी भी अवशिष्ट चमड़े के नीचे या मांसपेशियों के ऊतकों की उपस्थिति के लिए निरीक्षण किया । हालांकि ये हमारे अलग ग्रंथियों में पहचाने जाने योग्य नहीं थे (चित्रा 1सी), हम fibronectin में काफी अधिक चमड़े के नीचे ऊतक नोट किया था ऊतक ब्लॉकों में ऊतक खंड से पहले हटाया नहीं गया था, जिसमें से दाग ग्रंथियों (उदा सतही) (चित्रा 1डी) बनाम ग्रंथियों जिसमें ऊतक ब्लॉक से ऊतक के 100-200 µm (जैसे गहरी) खंड से पहले हटा दिया गया था (चित्रा 1ई) । exogenous या अंतर्जात कारकों के जवाब में स्तन ग्रंथि में ऊतक फाइब्रोसिस की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, अन्वेषक सतही बनाम गहरी कटौती ग्रंथि में फाइब्रोसिस की तुलना करना चाह सकते हैं । अंय विश्लेषण के लिए, यह अंवेषक के लिए लाभप्रद करने के लिए ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया और धुंधला अगर पर्याप्त चमड़े के नीचे और/या मांसपेशी ऊतक निंनलिखित ग्रंथि विच्छेदन के लिए आगे बढ़ने से पहले ऊतक ब्लॉक अनुभाग के लिए हो सकता है ।
अलगाव के बाद, ग्रंथियों 10% तटस्थ बफर formalin, संसाधित और धुंधला के लिए खोदी में तय किया गया । ब्याज के अंय प्रोटीन के अलावा कोलेजन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया कदम चित्रा 2aमें चित्रित कर रहे हैं । ECM प्रोटीन कोलेजन, fibronectin और tenascin-सी से प्रतिनिधि नमूने चित्रा 2बीमें दिखाए जाते हैं । प्रत्येक चित्र में तीर इन ऊतकों (चित्रा 2बी) में नलिकाओं की उपस्थिति दिखा ।
नलिकाओं की रूपात्मक सुविधाओं का अंदाजा लगाने के लिए, यह ध्यान के साथ ऊतकीय वर्गों का इलाज महत्वपूर्ण है के रूप में अनुचित हैंडलिंग क्षतिग्रस्त ऊतकों और नलिकाओं कि मध्यम श्रेणी का नहीं कर रहे है में परिणाम हो सकता है । अनुचित हैंडलिंग के उदाहरण बफ़र्स या पानी सीधे ऊतकों पर चल रहा हो सकता है, एक अनुचित तापमान पर बफ़र्स का उपयोग कर या इस तरह सोडियम साइट्रेट और एसिटिक एसिड के रूप में कठोर बफ़र्स में ऊतक नमूने छोड़ने से प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट समय की एक लंबी अवधि के लिए । एक ऊतक खंड में जो ऊतक क्षति हुई है का एक उदाहरण चित्रा 3एमें दिखाया गया है । यहां, ऊतक को व्यापक क्षति आसानी से नलिकाओं में टूटना अंक के रूप में देखा जा सकता है (चित्रा 3) । इस रूप में एक खंड का उपयोग वाहिनीई संरचनाओं के विश्लेषण के लिए नहीं किया जा सकता । एक बरकरार ऊतक नमूना का एक उदाहरण है जहां नलिकाएं मध्यम श्रेणी का है और quantifiable चित्रा 3बीमें दिखाया गया है । यहाँ, नलिकाओं केवल आसपास के fibronectin-सना हुआ स्ट्रोमा द्वारा विशेषता नहीं हैं, लेकिन यह भी नलिकाओं के लुमेन अस्तर उपकला कोशिकाओं की एक घने आबादी की उपस्थिति की विशेषता है (चित्रा 3बी). यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि विकास के दौरान, माउस स्तन ग्रंथि जो पार्श्व माध्यमिक शाखाओं अंकुरित, एक और अधिक जटिल डक्टर पेड़ जो बंटी और प्रत्येक मद चक्र के साथ प्रतिगमन की एक श्रृंखला से गुजरना में एक एकल वाहिनी शामिल 13. यद्यपि हमने इन प्रयोगों में पशुओं के मद चक्र को ध्यान में नहीं रखा है, इसलिए जांचकर्ता मद चक्र से स्वतंत्र वाहिनी संख्या के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए ऐसा करने की इच्छा कर सकते हैं । जांचकर्ता Caligioni14 जिसमें मद चक्र के चरण दिख निर्धारित किया जा सकता है द्वारा एक प्रोटोकॉल के लिए भेजा जाता है । के साथ नलिकाओं को बढ़ाता है, इन ऊतकीय वर्गों में एकाधिक वाहिनी संरचनाओं की उपस्थिति एकाधिक अद्वितीय नलिकाओं का संकेत नहीं है, लेकिन बल्कि एक और अधिक विकसित डक्टर पेड़ वाहिनी की वृद्धि से उत्पंन का संकेत है । नलिकाओं की गणना करने के लिए, एक एक ऊतक अनुभाग में व्यक्तिगत नलिकाओं को एक नंबर आवंटित करने के लिए एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर जैसे ImageJ (NIH) का उपयोग कर सकते हैं । अन्वेषक नलिकाओं में परिवर्तन के रूप में नलिकाओं की गणना करना चाह सकते हैं, जो विकासात्मक विषमताओं या रोग की स्थिति का संकेत हो सकता है । हमारे अध्ययन के संबंध में, हमारा मानना है कि नलिकाओं की वृद्धि हुई संख्या, वाहिनी की वृद्धि का परिणाम, caveolin के नुकसान से संबंधित है-1 जो विकास कारकों की ंयायपालिका अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं जैसे इंसुलिन वृद्धि कारक 1 (IGF-1), माउस डक्टर के एक ज्ञात मध्यस्थ विकास 15.
बरकरार नलिकाओं की उपस्थिति के अलावा, कई नलिकाएं शाखाओं, एक fibronectin-सना हुआ खंड (चित्रा 3सी) में तीर द्वारा संकेत शामिल हैं । इस विश्लेषण के प्रयोजन के लिए, इन नलिकात्मक शाखाओं को एक पृथक वाहिनीीय संरचना के रूप में नहीं माना जाना चाहिए । जबकि नलिकाओं का मूल्यांकन और मापने, यह संवहनी संरचनाओं से नलिकाओं भेद करने के लिए महत्वपूर्ण है । संवहनी संरचनाओं केवल लुमेन अस्तर monolayer एक endothelial की उपस्थिति से नहीं पहचाना जा सकता है, लेकिन यह भी एक परमाणु की उपस्थिति से, इओसिनोफिलिक संरचनाओं लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के भीतर लुमेन (चित्रा 3डी) का संकेत. हालांकि लुमेन के भीतर इओसिनोफिलिक संरचनाओं की उपस्थिति आरबीसी इंगित करता है और vasculature पता चलता है, ऊतक वर्गों में ग्रंथि संग्रह के दौरान आरबीसी के विस्थापन संभव है । यह endothelial मार्कर CD31 का उपयोग संवहनी संरचनाओं की पुष्टि करने के लिए सलाह दी जाती है । CD31 के साथ सना हुआ एक ऊतकीय धारा का एक उदाहरण (चित्रा 3डी) दिखाया गया है । क्रम में डक्टर परिधि और क्षेत्र, ImageJ (NIH) में वैक्टर myoepithelial सीमा (परिधि) और α-SMA-सना हुआ ऊतक अनुभाग में चमकदार सीमा रूपरेखा करने के लिए सौंपा जा सकता है । α-SMA, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं का एक मार्कर, यह myoepithelial कोशिकाओं जो लाइन नलिकाओं दाग के रूप में इस्तेमाल किया गया था । दिखाई गई छवि में, लाल रेखा myoepithelial बॉर्डर को दिखाती है जबकि नीली रेखा चमकदार सीमा (चित्रा 3ई) दिखाती है । stromal और चमकदार डिब्बों के बीच क्षेत्र, योजनाबद्ध में दिखाया गया है, कुल stromal ऊतक से अधिक डक्टर उपकला कोशिकाओं (चित्रा 3ई) के कब्जे वाले क्षेत्र है.
चित्र 1 : अलगाव की पूरी, बरकरार स्तन ग्रंथियों के लिए ऊतकीय विश्लेषण । (क) निंनलिखित पशु बलिदान, खाल ध्यान से हटा दिया गया था और वापस टिकी dermis और योनि के बीच स्थित स्तन ग्रंथियों का पर्दाफाश । योजनाबद्ध गर्भाशय ग्रीवा (#1), वक्ष (# 2 और 3), उदर (#4) और वंक्षण (#5) ग्रंथियों के सापेक्ष पदों को दर्शाता है । (ख) #4 उदर ग्रंथियों, विच्छेदित पशु में दिखाया गया है और लाल तीर से संकेत दिया, अलग-थलग पड़ गए. (ग) #4 उदर ग्रंथियों के प्रतिनिधि उदाहरण एक nulliparous महिला बी-6 माउस से पृथक । (घ) ग्रंथियों से पर्याप्त चमड़े के नीचे ऊतक जिसमें ऊतक आयल ब्लॉक से पहले नहीं हटाया गया था खंड (जैसे सतही) ECM प्रोटीन fibronectin के लिए दाग के बाद स्पष्ट था । (ङ) Considerabकम चमड़े के नीचे ऊतक और अधिक fibronectin सना हुआ stromal ऊतक ग्रंथियों से मनाया गया था जिसमें 100-200 ऊतक के µm तेल खंड से हटा दिया गया था (जैसे गहरी) अनुभाग से पहले । ऊतकीय अनुभाग प्रतिनिधि नमूनों से हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: ऊतकीय प्रसंस्करण और धुंधला । (A) ऊतकीय संसाधन के लिए उपयोग किए गए चरणों का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । कदम की एक अलग श्रृंखला कोलेजन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था । (ख) ECM प्रोटीन कोलेजन, fibronectin और tenascin-सी की महिला nulliparous caveolin की ग्रंथियों से-1 की कमी पशुओं के प्रतिनिधि छवियां । कोलेजन, fibronectin और tenascin के लिए तीर-सी घने स्ट्रोमा अस्तर नलिकाओं संकेत मिलता है । PSR: Picrosirius लाल । एफ एन: fibronectin । दस-सी: tenascin-सी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: डक्टर वास्तुकला का विश्लेषण । (क) एक fibronectin दाग अनुभाग व्यापक ऊतक क्षति दिखाता है । यह वाहिनी संरचनाओं (तीर) में टूट की उपस्थिति के द्वारा चिह्नित है । (ख) एक fibronectin दाग अनुभाग बरकरार वाहिनी संरचनाओं जो उपकला कोशिकाओं की एक या एक से अधिक परतों और आसपास के स्ट्रोमा से घिरा लुमेन की उपस्थिति के द्वारा चिह्नित कर रहे हैं की उपस्थिति दिखाता है । तीर व्यक्तिगत वाहिनी संरचनाओं संकेत मिलता है । (ग) एक fibronectin-सना हुआ छवि वाहिनी शाखाओं, जो तीर के साथ संकेत कर रहे है की उपस्थिति पर प्रकाश डाला गया । बड़े डक्टर संरचना के लुमेन के साथ इन की निरंतरता को ध्यान दें । (D) संवहनी संरचनाओं (लाल तीर), कोशिकाओं की एक परत की विशेषता और एक-nucleated इओसिनोफिलिक संरचनाओं की उपस्थिति लाल रक्त कोशिकाओं का संकेत है, अक्सर नलिकाओं (काला तीर) के साथ निकटता में मनाया जाता है । कम आवर्धन बाईं ओर छवि में दिखाया गया है और एक इसी उच्च इज़ाफ़ा छवि सही पर दिखाया गया है । ये बिंब एच & #38; ई और tenascin-सी से सना थे. CD31 संवहनी संरचनाओं अस्तर endothelial कोशिकाओं के लिए एक सकारात्मक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था । दिखाया एक बड़े संवहनी संरचना जिसमें CD31 सकारात्मक कोशिकाओं पोत के लुमेन अस्तर दिखाई दे रहे हैं । कम आवर्धन बाईं ओर छवि में दिखाया गया है और एक इसी उच्च इज़ाफ़ा छवि सही पर दिखाया गया है । (ङ) डक्टर परिधि एक सदिश का उपयोग करते हुए एक α-SMA-सना हुआ छवि में मापा गया था (लाल में दिखाया गया है) myoepithelial डिब्बे की रूपरेखा के लिए जबकि वाहिनी क्षेत्र एक सदिश का उपयोग कर मापा गया था (नीले रंग में दिखाया गया है) चमकदार डिब्बे की रूपरेखा । stromal और चमकीले डिब्बों के बीच में इस क्षेत्र को वाहिनीई क्षेत्र के रूप में वर्गीकृत किया गया था । स्केल बार = ५० µm. एक वाहिनी संरचना के योजनाबद्ध क्षेत्रों जिसमें से परिधि और क्षेत्र को मापा गया पर प्रकाश डाला । दस-सी: tenascin-सी. चित्रा ई में ऊतकीय अनुभाग से संशोधित किया गया था: Thompson सी एट अल । 16 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
कागज में, हम एक तकनीक का वर्णन किया है के लिए बरकरार माउस स्तन ग्रंथियों को अलग ECM अभिव्यक्ति और डक्टर आकृति विज्ञान के बहाव ऊतकीय विश्लेषण के लिए । वाहिनी आकृति विज्ञान के विश्लेषण के संबंध में, इस पद्धति के दाग ऊतकीय वर्गों के बंद आधारित डक्टर वास्तुकला की तेजी से जांच में सक्षम बनाता है । डक्टर विश्लेषण के अन्य तरीकों नलिकात्मक पेड़, जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और समय लेने के तरीकों का दृश्य सक्षम करने के लिए रंजक के इंजेक्शन पर निर्भर करते हैं ।
ब्रेस्ट कैंसर में ECM के असामान्य होने की सूचना मिली है । 1 , 2 , ६ , 9 विशेष रूप से, बहुतायत में परिवर्तन और/या पार ECM के पैटर्न को ट्यूमर प्रगति, मेटास्टेसिस और चिकित्सा प्रतिरोध3,4,6,7 प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है ,8,9. इसके अलावा, ECM वातावरण में परिवर्तन भी डक्टर उपकला कोशिका आकृति विज्ञान और प्रसार17, संभावित एक ट्यूमर दीक्षा के पक्ष में अग्रणी बदलने के लिए सूचित किया गया है । जब तक हम एक caveolin-1 कमी पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए ECM अभिव्यक्ति और caveolin-1 के नुकसान के बाद वाहिनी आकृति विज्ञान में परिवर्तन का आकलन, एक किसी भी माउस मॉडल में इस पद्धति को लागू कर सकते हैं । ECM अभिव्यक्ति पैटर्न और वाहिनी वास्तुकला का आकलन करने के लिए, हम बहाव ऊतकीय विश्लेषण के लिए पूरे, बरकरार स्तन ग्रंथियों को अलग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन । इस पद्धति से परिणाम ECM अभिव्यक्ति और ग्रंथियों आकृति विज्ञान के मजबूत विश्लेषण उपज । हमने पाया है कि ECM अभिव्यक्ति का विश्लेषण, विशेष रूप से fibronectin, वर्गों से जिसमें 100-200 सतही ऊतक के µm से पहले हटा दिया गया था और धुंधला ग्रंथियों फाइब्रोसिस की एक और पूरी तस्वीर की उपज । इसके अतिरिक्त, हम BSA के विरोध के रूप में गधा सीरम का उपयोग पाया बेहतर गुणवत्ता ऊतकीय नमूनों में जो गैर विशिष्ट धुंधला काफी कम हो गया था उपज ।
डक्टर वास्तुकला के विश्लेषण के लिए, यह महत्वपूर्ण है वर्गों का उपयोग करने के लिए जो ऊतकों में बरकरार है और नलिकाओं में जो टूटना अंक, अनुचित ऊतक हैंडलिंग और अनुभाग के परिणामस्वरूप, स्पष्ट नहीं हैं । इसके अलावा, यह सही ढंग से डक्टर शाखाओं भेद महत्वपूर्ण है, एक और पैरामीटर है कि एक अंवेषक को मापने के लिए चाहते हो सकता है, और संवहनी संरचनाओं जो आसानी से अपने monolayer endothelium और इओसिनोफिलिक संरचनाओं के भीतर द्वारा पहचाना जा सकता है CD31 के साथ दाग के अलावा लुमेन । जबकि नलिकाएं विभिन्न ECM प्रोटीन के लिए दाग वर्गों में मनाया गया था, myoepithelial मार्कर αSMA और एच & #38; ई counterstaining, जो नलिकाओं के सेलुलर घटक पर प्रकाश डाला, नलिकाओं के गणन और किसी भी संबंधित शाखाओं के साथ प्राप्त होता है h & #38; e सना हुआ ऊतक वर्गों अकेले । पूर्व-नवोत्पादित और/या नवोत्पादित घावों की उपस्थिति के नलिकात्मक morphogenesis या विश्लेषण के अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, एक अन्वेषक लाइव पूर्व vivo ऊतकों का मूल्यांकन करने के लिए फोकल इमेजिंग का उपयोग करने के लिए चाहते हो सकता है । इस उदाहरण में, एक ही तकनीक है जो पूरी ग्रंथियों में एक्साइज है निर्धारण और ऊतक प्रसंस्करण कदम खत्म करने के साथ लागू किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम सर्जिकल माइक्रो loupes जो न केवल #4 उदर ग्रंथियों की सटीक पहचान सक्षम है, लेकिन इसके अतिरिक्त dermis और अंतर्निहित एक से अधिक ग्रंथि के विच्छेदन की अनुमति का उपयोग शामिल हैं । पर्याप्त चमड़े के नीचे के ऊतकों और मांसपेशियों के अपवर्जन वसा कम-धुंधला और प्रोटोकॉल में जुड़े हस्तक्षेप । इसके अलावा, बेहतर ग्रंथि में ECM अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान करने के लिए, हम यह ऊतक ब्लॉक है, जो अवशिष्ट वसा ऊतक को खत्म करने में मदद की 100-200 µm को दूर करने के लिए उपयोगी पाया । हालांकि पूरे स्तन ग्रंथि अलगाव stromal प्रोटीन अभिव्यक्ति और वाहिनी morphogenesis में ऊतक व्यापक परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान करता है, वर्णित तकनीक निश्चित, आयल एंबेडेड ऊतकों से धारावाहिक वर्गों के विश्लेषण तक ही सीमित है । करने के लिए जो वाहिनी शाखाओं में परिवर्तन हुआ है डिग्री की स्थापना, पूरे माउंट लाइव की इमेजिंग, पूर्व vivo ऊतकों आवश्यक हो जाएगा । यहां, एक अन्वेषक Cre-लोक्स डिजाइन करने के लिए कस्टम, सशर्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर conjugations ग्रंथि विशिष्ट प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए या एक रंग का उपयोग करने के लिए डक्टर पेड़ रोशन करने से पहले इमेजिंग18। इस के अलावा, ग्रंथि की संपूर्णता में रुचि के प्रोटीन के आगे विश्लेषण पश्चिमी दाग या जन स्पेक्ट्रोमेट्री या अंय उच्च प्रवाह तकनीक जैसे पार से जोड़ने immunoprecipitation (क्लिप) या क्रोमेटिन के उपयोग जरूरत होगा immunoprecipitation (चिप). इस उदाहरण में, पूरे ग्रंथियों, विच्छेदित छोटे टुकड़ों में खोदी और नीचे के विश्लेषण के लिए तदनुसार कार्रवाई की जाएगी । इसके अलावा, एक भी ऊतक वर्गों पर फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग कर सकते हैं । यह तकनीक एक ही ऊतक में कई प्रोटीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति सह स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए आदर्श होगा ।
सारांश में, हम एक तकनीक है कि पूरी की तेजी से अलगाव प्रदान करता है का वर्णन, बरकरार स्तन ग्रंथियों और ऊतकीय प्रसंस्करण और वाहिनी विश्लेषण पर और अधिक जानकारी प्रदान करता है । इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों ECM अभिव्यक्ति और ट्यूमर असर जानवरों में डक्टर आकृति विज्ञान में जुड़े परिवर्तन की जांच सकता है । इसके अलावा, कोलेजन अभिविन्यास और फाइबर व्यास का विश्लेषण, जानकारी जो ऊतक घनत्व का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है, PSR सना हुआ वर्गों पर भी किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक अप्रैल वाईल् और डॉ रोजर Broderson पशु necropsy और ग्रंथि अलगाव के साथ सहायता के लिए, क्रमशः स्वीकार करना चाहते हैं । इस काम के लिए धन उंर बढ़ने के पुराने विकारों के लिए Osteopathic चिकित्सा केंद्र के फिलाडेल्फिया कॉलेज द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
