Detta protokoll skisserar en ny metod för att skapa en rumsligt detaljerad finita element modell av intracellulära arkitekturen av hjärtmuskelceller från elektronmikroskopi och konfokalmikroskopi bilder. Kraften i denna rumsligt detaljerad modell demonstreras med hjälp av fallstudier i Kalciumsignalering och blockeringar.
Med tillkomsten av tredimensionella (3D) avbildningstekniker såsom elektron tomografi, serial-block-face scanning electron microscopy och konfokalmikroskopi, det vetenskapliga samfundet har oöverträffad tillgång till stora datamängder på sub mikrometer upplösning som kännetecknar arkitektoniska ombyggnaden som medföljer förändringar i hjärtmuskelcellen funktion vid hälsa och sjukdom. Dessa datamängder har emellertid varit underutnyttjade för att undersöka rollen av cellulära arkitektur ombyggnad i hjärtmuskelcellen funktion. Syftet med detta protokoll är att beskriva hur man skapar en exakt finita element modell av en hjärtmuskelcellen med högupplöst elektronmikroskopi och konfokalmikroskopi bilder. En detaljerad och korrekt modell av cellulära arkitekturen har betydande potential att ge nya insikter i hjärtmuskelcellen biologi, mer än experiment ensam kan samla. Kraften i denna metod ligger i dess förmåga att beräkningsmässigt säkring information från två olika avbildningsmetoder för hjärtmuskelcellen ultrastruktur att utveckla ett enhetligt och detaljerad modell av hjärtmuskelcellen. Detta protokoll beskriver stegen för att integrera elektron tomografi och konfokalmikroskopi bilder av vuxna manliga Wistar (namn för en viss ras av albino råtta) råtta hjärtmuskelcellerna att utveckla en halv-sarcomere finita element modell av hjärtmuskelcellen. Förfaranden som genererar en 3D finita element-modell som innehåller en korrekt, högupplösta skildring (storleksordningen ~ 35 nm) av fördelningen av mitokondrier, myofibrils och ryanodine receptor kluster som frigör behövs kalcium för hjärtmuskelcellen kontraktion från sarkoplasmatiska retikulära nätverket (SR) in i myofibril och cytosoliska fack. Den modell som genereras här som en illustration inbegriper inte detaljer tvärgående-tubuli arkitekturen eller det sarkoplasmatiska retikulära nätverket och är därför en minimal modell av hjärtmuskelcellen. Modellen kan dock redan tillämpas i simuleringsbaserad utredningar in i rollen av cellstrukturen i calcium signalering och mitokondrie blockeringar, vilket illustreras och diskuteras med två fallstudier som presenteras efter den detaljerade protokoll.
Excitation-contraction koppling (ECC) i hjärtat refererar till den viktiga och intrikata koppling mellan elektrisk magnetisering av hjärtmuskelcellen membranet och efterföljande mekaniska sammandragning av cellen under varje hjärtslag. Matematiska modeller har spelat en nyckelroll i utvecklingen av en kvantitativ förståelse av de sammanlänkade biokemiska processer som reglerar de potentiella åtgärder1, cytosoliska calcium signalering2, bioenergetik3, och efterföljande kontraktila styrkebidrag. Sådana modeller har också framgångsrikt förutsagt ändringar hjärtslag när en eller flera av dessa biokemiska processer genomgå förändringar4,5. Den mycket organiserade ultrastruktur av hjärtmuskelcellen har alltmer erkänts att spela en avgörande roll i den normala kontraktila funktionen av cellen och hela hjärtat. Faktiskt, ändringar i morfologi och organisation av komponenterna i hjärt ultrastruktur ske parallellt att biokemiska förändringar i sjukdomstillstånd såsom hypertrofi6, hjärtsvikt7och diabetiker kardiomyopati8. Huruvida dessa strukturella förändringar är mindre, adaptiv eller patologiska svar på de förändrade biokemiska förhållanden är fortfarande till stor del okända9. Inneboende snäva kopplingen mellan form och funktion i biologi innebär att experimentella studier enbart kan ge djupare insikter än korrelationer mellan strukturella remodeling och hjärtmuskelcellen funktion. En ny generation av matematiska modeller som kan integrera den strukturella församlingen av sub cellulära komponenter, tillsammans med de väl studerat biokemiska processerna, är nödvändiga för att utveckla en heltäckande, kvantitativ förståelse av förhållandet mellan struktur, biokemi och kontraktila kraft i hjärtmuskelceller. Det här protokollet beskriver metoder som kan användas för att generera strukturellt korrekt finita element modeller av hjärtmuskelceller som kan användas för sådana utredningar.
Det senaste decenniet har sett betydande framsteg i 3D elektronmikroskopi10, confocal11och super-resolution mikroskopi12 som ger oöverträffad, högupplösta insikter i nano-skala och mikroskala monteringen av den sub cellulära komponenter i hjärtmuskelcellen. Dessa datamängder har nyligen använts för att generera beräkningsmodeller hjärtmuskelcellen ultrastruktur13,14,15,16. Dessa modeller använder en väletablerad engineering simulering-metod, som kallas de finita element metod17, för att skapa finita element computational maskor över vilka biokemiska processer och hjärtmuskelcellen sammandragningar kan simuleras. Dessa modeller är dock begränsad av den upplösning och detaljrikedom som en metod för mikroskopi kan ge i en bild datamängd. Till exempel elektronmikroskopi kan generera nanometer-nivå detalj av cellens struktur, men det är svårt att identifiera specifika proteiner i bilden som skulle vara nödvändigt att skapa en modell. Däremot, super-resolution optisk mikroskopi kan ge hög kontrast bilder med upplösningar på order av 50 nm av endast en Välj några molekylära komponenter av cellen. Endast genom att integrera kompletterande information från dessa avbildningsmetoder kan man utforska realistiskt känslighet funktion till förändringar i strukturen. Korrelat ljus- och elektronmikroskopi är fortfarande inte ett rutinmässigt förfarande och det skulle fortfarande lida begränsning att endast ett begränsat antal komponenter kan vara målat i vyn immunofluorescens och korrelerade med vyn elektronmikroskopi.
Detta protokoll presenterar en ny metod18 som använder statistiska metoder19 att analysera och beräkningsmässigt säkring ljusmikroskopi information på rumslig distribution av jonkanaler med elektronmikroskopi på andra hjärt ultrastruktur komponenter, till exempel myofibrils och mitokondrier. Detta producerar en finita element-modell som kan användas med biofysiska modeller av biokemiska processer för att studera roll hjärtmuskelcellen sub cellulära organisation på de biokemiska processer som reglerar hjärtmuskelcellen kontraktion. Till exempel detta protokoll kan användas för att skapa modeller från friska och streptozotocin-inducerad diabetes hjärt myocyter att studera effekten av strukturella remodeling hjärt cell funktion som observeras i diabetiska djur modeller8. En ytterligare fördel av statistiska naturen av den presenterade metoden illustreras också i protokollet: metoden kan generera flera instanser av finita element-geometrier som nära efterlikna experimentellt observerade variationerna i cellstrukturen.
Som en översikt, protokollstegen omfattar: (i) beredning av hjärtvävnad för elektronmikroskopi att generera 3D bilder med tillräcklig upplösning och kontrast; (ii) återuppbyggnad och segmentering av 3D bildstaplar från elektronmikroskopi data med hjälp av en 3D elektronmikroskopi återuppbyggnad och bildanalys programvara kallas IMOD20; (iii) använda iso2mesh21 för att generera ett finita element mesh med segmenterad data som indata; (iv) med romanen algoritm och koder för att kartlägga fördelningen av jonkanaler på finita element mesh.
Förutsättningen för en strategi för varje steg beskrivs i protokollet och representativa resultat finns i medföljande siffrorna. En översikt beskrivs anger hur de genererade rumsligt detaljerade modellerna kan användas för att studera rumslig dynamik av kalcium under ECC, liksom mitokondriell bioenergetik. Några av de nuvarande begränsningarna av protokollet diskuteras, liksom nya utvecklingen som pågår för att övervinna dem och vidareutveckla en kvantitativ förståelse av cellens struktur roll till hjärt systembiologi. Hur dessa metoder kan generaliseras för att skapa finita element modeller av andra celltyper tas också upp.
Användare av detta protokoll kan hoppa över steg 1 och återuppbyggnad delen av steg 2 om de har tillgång till en redan existerande elektronmikroskopi bildstapel. Användare som avser att förvärva sina data i samarbete med mer erfarna elektron microscopists vilja att diskutera och jämföra fixering och färgning procedurerna i steg 1 med expert att avgöra en optimal protokoll för förvärvet.
Det ovannämnda protokollet beskriver viktiga steg för att generera en roman finita element geometriska modell för hjärtmuskelcellen ultrastruktur. Metoden möjliggör computational fusion av olika mikroskopi (eller, i princip, andra data) metoder för att utveckla en mer omfattande beräkningsmodell för hjärtmuskelcellen dynamik som innehåller detaljer av rumsliga cell arkitekturen. Det finns för närvarande inga andra protokoll som är tillgängligt för att skapa en sådan modell av en hjärtmuskelcellen.
<…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av det kungliga samhället av nya Zeeland Marsden snabbt starta Grant 11-UOA-184, den mänskliga gränser Science Program forskningsbidrag RGP0027/2013 och den australiska forskning rådet Discovery Project Grant DP170101358.
Materials | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
Equipment | |||
Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
Retort stand | Proscitech | T752 | |
Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
Software | |||
SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
spatstat | R-project | install via R program | |
rgl | R-project | install via R program | |
doparallel | R-project | install via R program | |
foreach | R-project | install via R program | |
doSNOW | R-project | install via R program | |
iterators | R-project | install via R program |