Summary
وهنا، نقدم بروتوكول لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال إلى مواصلة دراسة هذه الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية الخلايا التائية التنظيمية باستخدام التدفق الخلوي.
Abstract
لدينا الجهاز المناعي يتكون من عدد ومتنوعة من الخلايا المناعية بما في ذلك الخلايا خلايا (تريغ) T التنظيمية. ويمكن تقسيم الخلايا تريغ مجموعات فرعية اثنين والغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج) والمستحثه محيطيا تريغ (بتريج) الخلايا. وهي موجودة في مختلف أجهزة الجسم ويمكن تمييزها بعلامات معينة، مثل هيليوس ونيوروبيلين 1. وأفيد أن خلايا تريج وظيفيا القمعية أكثر من الخلايا بتريج. ولذلك، من المهم تحديد نسبة خلايا تريج وبتريج عند التحقيق في الخلية غير المتجانسة السكان. وهنا، جمعنا الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس والطحال من الفئران السكري غير السمنة نورموجليسيميك لتمييز خلايا تريج من الخلايا بتريج استخدام التدفق الخلوي. قمنا بإعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة يدوياً. Fluorochrome مترافق السطحية CD4، CD8، CD25، واستخدمت الأجسام المضادة نيوروبيلين 1 وصمة عار الخلايا. وضعوا في الثلاجة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، كانت ملطخة الخلايا fluorochrome مترافق أضداد Foxp3 وهيليوس داخل الخلايا. واستخدمت هذه العلامات لوصف المجموعات اثنين من الخلايا تريغ. هذا البروتوكول يوضح طريقة بسيطة ولكنها عملية لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال واستخدامها لأغراض تحليل سيتوميتريك تدفق اللاحقة.
Introduction
خلايا تي (تريغ) التنظيمية حاسمة بالنسبة للتوازن للجهاز المناعي. تعرف الخلايا تريغ التعبير عن المستضدات السطحية CD4 و CD25، والنسخ عامل فورخيد مربع P3 (Foxp3)1،،من23. وأظهرت ساكاجوتشى et al. أولاً أعرب CD25 هو مؤثرا في تي القامع الخلايا في الفئران4، الذي ينص مراقبة رائدة للتعرف على الخلايا البشرية تريغ. تريغ خلايا تلعب دوراً مركزياً في منأى عن التسامح بما تمارسه من قدرة قمعية عبر مجموعة متنوعة من الآليات، بما في ذلك سيتوليسيس عن طريق إفراز جرانزيميس للحث على المبرمج واستهلاك سيتوكين وتثبيط من خلال التعبير عن السامة للخلايا اللمفاويات التائية مستضد 45. بالإضافة إلى ذلك، أنها يمكن أن تفرز السيتوكينات المثبطة مثل تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، انترلوكين-10 (إيل-10)، وايل-355. يمكن بطبيعة الحال أن يستمد تريغ خلايا من الغدة الصعترية، في هذه الحالة يتم تعيينهم الغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج)، أو أنهم يمكن أن يتسبب في الأجهزة الطرفية في هذا الحالة تسمى محيطيا المستحث تريغ (بتريج) الخلايا.
هيليوس، عضو الأسرة عامل النسخ إيكاروس، أفيد بأن علامة للتمييز بين خلايا تريج والخلايا بتريج6. في وقت لاحق، أفادت مجموعتين أخريين أن مستقبل الثالث سيمافورين، نيوروبيلين 1 (Nrp1)، يمكن أن تخدم كعلامة سطحية لخلايا تريج تحت بعض الظروف7،8. ومع ذلك، أظهرت سينغ et al. أن Helios علامة أفضل في هذا السياق بالسذاجة الفئران9.
مجموعات فرعية الخلايا تريغ تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على التوازن في الجهاز المناعي، وفي الحماية من العدوى والمناعة الذاتية. ولذلك، من المهم تحديد أرقام ونسب هؤلاء السكان في الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية على حد سواء. ولتحقيق ذلك، يتعين على المرء أن إعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة. تم وصف عدد من البروتوكولات أو المستخدمة في الدراسات السابقة. أساسا، ديسوسياتورس التلقائي قد استخدمت في التقارير المنشورة سابقا10،11. ديسوسياتورس التلقائي باستخدام مناسب وتوفير الوقت، وإنما إجراء مكلفة. ولذلك، استخدمنا أسلوب يدوي لإعداد تعليق خلية مفردة من مورين الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس (بدلنس) والطحال من الفئران (الإيماءة) السكري غير السمنة نورموجليسيميك، وعزل الخلايا المفردة من هذه الأجهزة. وقد استخدم هذا الأسلوب في دراساتنا السابقة ووجدنا أن الطريقة اليدوية لإعداد تعليق خلية مفردة بكفاءة ديسوسياتور التلقائي الأسلوب9،12،،من1314. وعلاوة على ذلك، استخدمنا التدفق الخلوي لتحديد نسب CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ خلايا ومجموعات فرعية من تريغ الخلايا خلايا تريج وبتريج. تم تمييز خلايا تريج وبتريج استخدام هيليوس و Nrp1 كعلامات لخلايا تريج. وهكذا، تشير النتائج التي توصلنا إليها أن الطريقة اليدوية لإعداد الخلايا المفردة العمل بكفاءة، ويمكن استخدام تعليق خلية واحدة مستعدة كذلك لدراسات استخدام التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة الأخلاقيات الحيوانات المحلية في جامعة أوبسالا في التجارب على الحيوانات.
1-جمع الأجهزة من الحيوانات
- التضحية الفئران بخلع عنق الرحم.
- مكان الغدد الغدة الصعترية والطحال في قنينات التﻷلؤ 20 مل أو 15 مل أنابيب مخروطية الشكل مليئة 5 مل Hanks´ متوازن الحل الملح (حبس). مكان بدلنس في أنابيب صغيرة 1.5 مل مليئة 1 مل من 1640 ربمي. استخدام الغدة الصعترية كله والطحال، وجميع بدلنس.
ملاحظة: ينبغي إبقاء الأجهزة على الجليد طوال فترة الإجراءات، والمحقق أن تحاول أن تكون سريعة أثناء إعداد تعليق خلية مفردة، لا سيما عند التعامل مع أنسجة الغدة الصعترية نظراً للخلايا المناعية الغدة الصعترية يمكن أن يتحلل بسرعة في درجات حرارة عالية.
2-وحيد الخلية في معزل عن الغدة الصعترية والطحال
- دقة الضغط على الغدة الصعترية والطحال مع زوج من ملاقط للإفراج عن الخلايا المناعية. تجاهل الكبسولة الغدة الصعترية والطحال المتبقية.
- نقل تعليق خلية الأنبوبة المخروطية 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 433 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لتشكيل بيليه. تجاهل المادة طافية.
- خلايا الدم الحمراء، ريسوسبيند تعليق خلية في 5 مل من 0.2 M NH4Cl واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10 عكس الأنابيب بلطف رأسا على عقب كل دقيقة 2 مل 5 إضافة لحبس في نهاية الحضانة لوقف تحلل.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في حوالي 5 مل حبس. ملء الأنابيب مع هبس.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في حوالي 5 مل هبس. ملء الأنابيب مع حبس.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل حبس للغدة الصعترية و 10 مل للطحال.
- نقل 1 مل تعليق خلية الغدة الصعترية و 500 ميليلتر من تعليق خلية الطحال إلى 5 مل الجولة أنابيب أسفل مع قبعات مصفاة الخلية. تطبيق تعليق خلية إلى خلية قبعات مصفاة.
ملاحظة: نايلون 35 ميكرون أدمجت في عملية النداء الموحد. وجمعت ما يقرب من 5 مليون خلايا في كل أنبوبة.
3-وحيد الخلية في معزل عن بدلن
- ضع 250 ميكرون معدنية عقيمة على أنبوب مخروطي 15 مل في رف. شطف الشبكة مع 1 مل ربمي.
- نقل الليمفاوية إلى شبكة معدنية وطحن لهم من خلال شبكة باستخدام زوج من ملاقط. تطبيق 1 مل ربمي في شبكة معدنية لمسح الخلايا في الأنبوب. كرر 3 مرات أكثر وإزالة الشبكة.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في حوالي 5 مل ربمي. ملء الأنابيب مع ربمي.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في حوالي 5 مل ربمي. ملء الأنابيب مع ربمي.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل ربمي. نقل 2 مل تعليق خلية إلى 5 مل الجولة أنابيب أسفل مع قبعات مصفاة الخلية. تطبيق تعليق خلية إلى خلية قبعات مصفاة.
4-التدفق الخلوي
- الطرد المركزي من تعليق خلية من الغدة الصعترية وبدلن والطحال في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة السطحية التالية في 100 ميليلتر من التدفق الخلوي تلطيخ المخزن المؤقت (المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية): 0.75 ميكروغرام/100 ميليلتر CD4 مترافق FITC جسم، 0.60 100 ميكروغرام/ميليلتر CD8 APC-H7-مترافق جسم، جسم 0.30 100 ميكروغرام/ميليلتر CD25 مترافق PE، 5 ميليلتر (01:20) آسيا والمحيط الهادئ مترافق جسم Nrp1. احتضان هذه الأنابيب على الجليد لمدة 40 دقيقة.
- إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل أنبوبة. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية. كرر مرة أخرى.
- إصلاح وبيرميبيليزي الخلايا التي ريسوسبيندينج بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لتثبيت بيرميبيليزيشن (بفب).
ملاحظة: بفب مستعدة بخلط 1 جزء من التثبيت/بيرميبيليزيشن "التركيز" مع 3 أجزاء من "مادة" التثبيت/بيرميبيليزيشن. - تبقى هذه الأنابيب في الثلاجة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: ويعمل أيضا حضانة ح 1. - الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل بيرميبيليزيشن (PWB). الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
ملاحظة: PWB بتمييع Permeabilization إعداد المخزن المؤقت (10 x) إلى 01:10 في الماء المقطر. - وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة داخل الخلية التالية في 100 ميليلتر من PWB: 0.30 100 ميكروغرام/ميليلتر Foxp3 PE-Cy7-مترافق جسم، جسم هيليوس مترافق باسيفيكبلوي 4 ميليلتر (01:25). احتضان هذه الأنابيب على الجليد ح 1.
- إضافة 500 ميليلتر من PWB لكل أنبوبة. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من PWB. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 433 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
- تحليل الخلايا على سيتوميتير تدفق.
- بوابة وحيدة الخلايا استناداً إلى الجانب مبعثر-المنطقة، والطول والعرض، ومبعثر ناحية الأمام، الارتفاع والعرض. تشغيل الأحداث 1 مليون للتحليل.
- تصدير ملفات FCS للتجارب وتحليلها باستخدام برمجيات محلل تدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتحقيق في التعبير عن Nrp1 وهيليوس في خلايا تريج وبتريج، إعداد الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال نورموجليسيميك إيماءة الفئران والملون منها مع علامات خلية تريغ CD4، CD25، Foxp3، هيليوس، و Nrp1 لتدفق سيتوميتريك تحليل. تم تحليل النتائج كما هو موضح في الممثل النابضة استراتيجيات (الشكل 1). وجدنا أن نسبة الخلايا هيليوس+ بين خلايا CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ الخلايا كان أعلى من Nrp1+ الخلايا في جميع الأجهزة الثلاثة (الشكل 2A). وأعرب أكثر من 80% خلايا الغدة الصعترية تريغ هيليوس، الذي كان أعلى في بدلن والطحال (الشكل 2A). نسبة Nrp1+ الخلايا بين الخلايا تريغ هيليوس+ كان أعلى في بدلن من تلك في الغدة الصعترية والطحال (الشكل 2). أغلبية Nrp1+ تريغ الخلايا كما أعرب هيليوس، ونسب الخلايا هيليوس+ بين Nrp1+تريغ الخلايا في الغدة الصعترية والطحال كانت أعلى من مثيلة في بدلن (الشكل 2). معا، هذه النتائج تشير إلى أن هيليوس علامة أفضل للكشف عن خلايا تريج من Nrp1.
رقم 1: الممثل النابضة استراتيجيات للتدفق الخلوي- كانت بوابات الخلايا الحية واحدة استناداً إلى منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. ثم، كانت زيادة بوابات الخلايا للتعبير CD4 و CD8. خلايا CD4+CD8 الخلايا– كانت بوابات أخرى للتعبير عن CD25. التالي، خلايا CD4+CD8–CD25+ كانت بوابات الخلايا للتعبير Foxp3. خلايا CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ كانت بوابات الخلايا للتعبير Nrp1 أو هيليوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التعبير عن Nrp1 وهيليوس في الخلايا تريغ في الغدة الصعترية وبدلن والطحال. العمر الأسبوع 8 أربعة تم التضحية بالفئران إيماءة غير السكري. وتم إعداد الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية وبدلنس والطحال. كانت ملطخة الخلايا ثم fluorochrome مترافق الأجسام المضادة لتحليل تدفق سيتوميتريك. (أ) النسب المئوية ل Nrp1+ والخلايا هيليوس+ بين خلايا CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ الخلايا. (ب) النسب المئوية ل Nrp1+ الخلايا بين الخلايا تريغ هيليوس+ . (ج) النسبة المئوية هيليوس+ الخلايا بين Nrp1+ تريغ الخلايا. يتم التعبير عن النتائج كوسيلة ± sem. * * *ف < 0.001. أحادي الاتجاه ANOVA تليها المقارنات توكي المتعددة (ألف وباء وجيم) ومزاوج تي-(أ) تم إجراء الاختبارات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، ونحن عزل الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال من الفئران إيماءة، والتحقيق في التعبير عن هيليوس و Nrp1 في خلايا CD4+CD8–CD25+Foxp3+ تريغ الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. واستخدمت في هذه الدراسة، الفئران إيماءة، الذي هو نموذج مورين من داء السكري من النوع 1. في دراسة سابقة، قد استخدمنا نوع البرية الماوس سلالات مؤتمر نزع السلاح-1 والفئران C57BL/6 للتحقيق في ما إذا كان هيليوس أو Nrp1 علامة أفضل للتمييز بين خلايا تريج من الخلايا بتريج. في تلك الدراسة، استخدمنا بروتوكول مماثل لتحديد مجموعات فرعية تريغ الخلايا في الفئران السذاجة9. لقد وجدنا أن Helios علامة أفضل في هذا السياق. ولذلك، هنا استخدمنا نورموجليسيميك إيماءة الفئران إلى تأكيد لدينا الحقائق السابقة في هذا النموذج، ووجد أن النتائج كانت متسقة مع نتائج أعمالنا السابقة في10. يوفر هذا البروتوكول بطريقة فعالة واقتصادية بعد إعداد الخلايا المفردة واستخدامها بعد ذلك لتحليل تدفق سيتوميتريك. وهناك العديد من البروتوكولات المنشورة التي تعد الخلايا المفردة باستخدام11،ديسوسياتور تلقائي12. بدلاً من استخدام ديسوسياتور، بالضغط على الغدد الغدة الصعترية والطحال يدوياً ونبذ الكبسولة المتبقية، يمكننا تجنب وجود أنسجة ليفية في تعليق خلية وتأكد من تعليق خلية يتكون أساسا من الخلايا المناعية والأحمر خلايا الدم. ثم كنا NH4Cl خلايا الدم الحمراء. ويمكن تمديد فترة تحلل لبضع دقائق إضافية إذا كانت الأجهزة أكبر من الحجم العادي. ومع ذلك، لا ينبغي تمديد مدة تحلل الكثير، خلاف ذلك سوف أيضا تفكيك الخلايا المناعية. من المهم السماح لتعليق خلية تمر قبعة مع مصفاة الخلية (أو مرشحات يعادل خلية أخرى)، منع حدوث مشاكل تسد أثناء التدفق الخلوي.
تعمل في الظلام المستحسن عند العمل مع الأجسام المضادة fluorochrome مترافق لتجنب التعرض الطويل للضوء. نحن احتضان الخلايا على الجليد لتلطيخ خارج الخلية وداخل الخلية. يمكن أيضا أن يتم في الحضانة في درجة حرارة الغرفة للسماح ربط أسرع من الأجسام المضادة، ولكن هناك خطر ربط غير محدد.
بعض علامات داخل الخلايا تتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا لإعطاء إشارات جيدة في التدفق الخلوي. ونظرا لصغر حجم بدلنس، طحن لهم على شبكة معدنية يتطلب المزيد من الرعاية للسماح بإصدار قصوى من الخلايا المناعية. جمع بدلنس أكثر أيضا وسيلة لزيادة عدد الخلايا. قيد آخر من هذا البروتوكول هو أن يتم إصلاح الخلايا وبيرميبيليزيد لتحليل تدفق سيتوميتريك، وبالتالي لا يمكن استخدامها للدراسات الفنية اللاحقة. الفرز المغناطيسي خيار السماح للدراسات الفنية إلا إذا كان علامات السطحية ذات الأهمية.
تم تطبيق هذا البروتوكول في نماذج أخرى الماوس للمناعة الذاتية والسرطان13،14. إعداد وحيد الخلية تقنية أساسية ولكنها مفيدة لتحديد الصفات المميزة للخلايا المناعية في مختلف أجهزة المناعة. باستخدام هذا الأسلوب لإعداد خلية واحدة قد يسبب نخر، مما قد يتسبب في انخفاض العدد الإجمالي للخلايا. التداخل الطيفي لقياس التدفق التقليدي يحد من العدد العلامات التي يمكن الكشف عنها في الوقت نفسه. ولذلك، عدة لوحات وإعداد كبيرة من الخلايا المطلوبة للحصول على ملف تعريف المناعة عموما. في المستقبل، وهذا يمكن التغلب عليها بوضع الخلوي الشامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه الدراسة دعم مالي من مجلس البحوث السويدية، اكسودياب، ومؤسسة السكري السويدية والصندوق السكري الطفل السويدي، سيب ديابيتيسفوندين و O.E. أوتش ادلا جوهانسونس فيتينسكابليجا ستيفتيلسي. المؤلف يود أيضا بفضل كل علا كارلسون وساندلر ستيلان ليدعم والمناقشات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
