Summary
Hierin presenteren wij een protocol om te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt aan verdere studie deze cellen met behulp van stroom cytometry. Bovendien, werd dit protocol gebruikt voor het bepalen van de deelverzamelingen van regulatoire T-cellen met behulp van stroom cytometry.
Abstract
Ons immuunsysteem bestaat uit een aantal en de verscheidenheid van immune cellen, met inbegrip van regulatoire T-cellen (Walter) cellen. Treg cellen kunnen worden onderverdeeld in twee subgroepen, serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen en ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen. Ze zijn in verschillende organen van ons lichaam aanwezig en kunnen worden onderscheiden door specifieke markers, zoals Helios en Neuropilin 1. Er werd gemeld dat de tTreg cellen functioneel meer onderdrukkende dan pTreg cellen zijn. Het is daarom belangrijk om te bepalen van het aandeel van zowel tTreg als pTreg cellen, bij het onderzoeken van heterogene cel populaties. Hierin, verzameld wij serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen te onderscheiden van de tTreg cellen van pTreg cellen met behulp van stroom cytometry. Wij kunnen handmatig eencellige schorsingen van deze organen. Fluorescerende geconjugeerd oppervlakte CD4, CD8, CD25 en Neuropilin 1 antilichamen werden gebruikt om de cellen vlek. Ze waren 's nachts in de koelkast bewaren. Op de volgende dag waren de cellen gekleurd met fluorescerende geconjugeerd intracellulaire Foxp3 en Helios antilichamen. Deze markeringen werden gebruikt voor het karakteriseren van de twee subsets van Treg cellen. Dit protocol toont een eenvoudige, maar praktische manier voor te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt en ze gebruiken voor latere flow cytometrische analyse.
Introduction
Regulatoire T (Walter) cellen zijn kritisch voor de homeostase van het immuunsysteem. Treg cellen worden gedefinieerd door de uitdrukking van oppervlakte antigenen CD4 en CD25, en de transcriptie factor forkhead vak P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. toonde eerst dat CD25 constitutively op T suppressor cellen in muizen4, die een baanbrekende constatering voor de identificatie van menselijke Treg cellen wordt uitgedrukt. Treg cellen spelen een centrale rol bij immuun tolerantie door uit te oefenen een onderdrukkende mogelijkheid via diverse mechanismen, met inbegrip van cytolysis via de secretie van granzymes voor het opwekken van apoptosis, cytokine consumptie en remming door middel van de expressie van cytotoxische T-lymfocyten antigeen 45. Bovendien kunnen ze remmende cytokines zoals transformeren groeifactor bèta (TGF-β), interleukine-10 (IL-10) en IL-355afscheiden. Treg cellen kunnen natuurlijk worden afgeleid uit de thymus, in welk geval zij serie afgeleide Treg (tTreg)-cellen zijn aangewezen, of ze kunnen in dat geval heten ook geïnduceerde Treg (pTreg) cellen in het perifere organen worden opgewekt.
Helios, een lid van de familie Ikaros transcriptie factor werd gemeld dat een marker voor onderscheid te maken tussen tTreg cellen en pTreg cellen6. Later, twee andere groepen gemeld dat Neuropilin 1 (Nrp1), een semaphorin III-receptor, als een oppervlak marker voor tTreg cellen onder bepaalde voorwaarden7,8 dienen kan. Toch, Singh et al. is gebleken dat Helios een betere marker in dit verband in naïef muizen9.
De deelverzamelingen van Treg cellen spelen een centrale rol in het behoud van de homeostase van het immuunsysteem en de bescherming tegen autoimmuniteit en infectie. Daarom is het belangrijk om de getallen en verhoudingen van deze populaties in zowel de lymfoïde en de niet-lymfoïde weefsels. Om dit te bereiken, moet een eencellige schorsingen van deze organen voor te bereiden. Een aantal protocollen zijn beschreven of gebruikt in eerdere studies. Automatische dissociators werden vooral gebruikt in eerder gepubliceerde rapporten10,11. Met behulp van de automatische dissociators is handig en tijdbesparend, maar het is een dure procedure. Daarom hebben we een handmatige methode gebruikt om te bereiden eencellige schorsingen van lymfkliertest serie klieren, de alvleesklier zuig lymfklieren (PDLNs) en de milt van normoglycemic nietzwaarlijvige diabetesmuizen (NOD) en geïsoleerde afzonderlijke cellen van deze organen. Deze methode is gebruikt in onze eerdere studies en we vonden dat de handmatige methode voor het opstellen van één celsuspensie zo efficiënt als automatische dissociator methode9,12,13,14 is. Bovendien, we stroom cytometry gebruikt om te bepalen van de verhoudingen van CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen en de subsets van Treg cellen tTreg en pTreg cellen. De tTreg en pTreg cellen werden onderscheiden met behulp van Helios en Nrp1 als markeringen voor tTreg cel. Zo blijkt uit onze resultaten dat de handmatige methode voor het voorbereiden van de afzonderlijke cellen efficiënt werkt en de schorsingen bereid eencellige verder kunnen worden gebruikt voor studies met stroom cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het Comité van de lokale dierlijke ethiek aan de Universiteit van Uppsala goedgekeurd de dierproeven.
1. het oogsten van organen van dieren
- Offeren de muizen door cervicale dislocatie.
- Plaats serie klieren en milt in 20 mL Scintillatie flesjes of 15 mL conische buizen gevuld met 5 mL Hanks´ evenwichtig zoutoplossing (HBSS). Plaats PDLNs in 1,5 mL micro buizen gevuld met 1 mL RPMI 1640. Gebruik de hele zwezerik en milt, en alle van de PDLNs.
Opmerking: Organen moeten worden gehouden op het ijs gedurende de hele procedure en de onderzoeker moet proberen om snel bij de voorbereiding van eencellige schorsingen, vooral bij het verwerken van serie weefsel aangezien serie immune cellen kunnen snel worden afgebroken bij hoge temperaturen.
2. enkele cel los van zwezerik en milt
- Knijp de zwezerik en milt grondig met een pincet om de immune cellen vrij te geven. Gooi de resterende serie en milt capsule.
- De celsuspensie overbrengen in een conische tube van 15 mL en centrifugeer bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot het vormen van een pellet. Verwijder het supernatant.
- Om lyse van de rode bloedcellen, resuspendeer de celsuspensie in 5 mL 0,2 M NH4Cl en Incubeer bij kamertemperatuur voor 10 min. omkeren de buizen ondersteboven zachtjes elke 2 min. Voeg 5 mL van HBSS aan het eind van de incubatie om te stoppen met de lysis.
- Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL HBSS. Vul de buizen met HBSS.
- Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL HBSS. Vul de buizen met HBSS.
- Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in in HBSS voor thymus 5 mL en 10 mL voor de milt.
- 1 mL van de serie celsuspensie overdracht en 500 µL van de milt celsuspensie tot 5 mL ronde onderkant buizen met de kappen van de zeef van de cel. De celsuspensie toepassen op de cel zeef caps.
Opmerking: Een 35 µm nylon gaas is opgenomen in het GLB. Ongeveer 5-10 miljoen cellen werden verzameld in elke buis.
3. enkele cel los van PDLN
- Plaats een steriele 250 µm metalen gaas over een conische tube van 15 mL in een rack. Spoel de Maas met 1 mL RPMI.
- De lymfklieren overbrengen in de metalen gaas en vermalen hen via de Maas met behulp van een pincet. 1 mL van de RPMI van toepassing op de metalen gaas voor het spoelen van de cellen in de buis. Herhaal 3 keer en verwijderen van de Maas.
- Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL RPMI. Vul de buizen met RPMI.
- Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL RPMI. Vul de buizen met RPMI.
- Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver RPMI. Overdracht de celsuspensie 2 mL tot 5 mL ronde onderkant buizen met de kappen van de zeef van de cel. De celsuspensie toepassen op de cel zeef caps.
4. Stroom Cytometry
- Centrifugeer de cel schorsingen van zwezerik, PDLN en milt bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- De cellen met de volgende oppervlakte antilichamen in 100 µL van stroom cytometry buffer (FACS buffer) kleuring vlekken: 0,75 µg/100 µL CD4 FITC-geconjugeerd antilichaam, 0.60 µg/100 µL CD8 APC-H7-geconjugeerde antilichaam, 0,30 µg/100 µL CD25 PE-geconjugeerde antilichaam, 5 µL (1:20) APC-geconjugeerde antilichaam Nrp1. Incubeer de buizen op ijs voor 40 min.
- Voeg 200 µL van FACS buffer toe aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Herhaal nog een keer.
- Lossen en permeabilize van de cellen door het resuspending van de cel pellet in 500 µL van Permeabilization fixatie Buffer (PFB).
Opmerking: PFB is bereid door mengen 1 deel van fixatie/Permeabilization concentreren met 3 delen van fixatie/Permeabilization verdunningsmiddel. - De buizen in de koelkast bewaren bij 4 ° C's nachts.
Opmerking: Een 1 uur incubatie werkt ook. - Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van Permeabilization wassen Buffer (PWB). Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
Opmerking: PWB wordt bereid door verdunning van Permeabilization Buffer (10 x) 1:10 in gedestilleerd water. - Vlekken van de cellen met de volgende intracellulaire antilichamen in 100 µL van PWB: 0,30 µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-geconjugeerde antilichaam, 4 µL (1:25) Helios PacificBlue-geconjugeerd antilichaam. Incubeer de buizen op het ijs gedurende 1 uur.
- Voeg 500 µL van PWB aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van PWB. Centrifugeer de buizen bij 433 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 300 µL van FACS buffer.
- Het analyseren van de cellen in een flow-cytometer.
- Poort van de enkele cellen op basis van kant Scatter-gebied, hoogte en breedte, en vooruit Scatter-gebied, hoogte en breedte. Voert een miljoen gebeurtenissen voor analyse.
- Exporteer de FCS-bestanden van experimenten en analyseren met behulp van een stroom cytometry analyzer software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te onderzoeken de uitdrukking van Nrp1 en Helios op tTreg en pTreg cellen, wij bereid enkele cellen uit de serie klieren, PDLNs en de milt van normoglycemic knik muizen en gekleurd hen met de Treg cel markeringen CD4, CD25, Foxp3, Helios en Nrp1 voor stroom cytometrische analyse. De resultaten werden geanalyseerd zoals aangegeven in de vertegenwoordiger gating strategieën (Figuur 1). We vonden dat het aandeel van Helios+ cellen onder CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen was hoger dan die van Nrp1+ cellen in alle drie organen (figuur 2A). Meer dan 80% van de Treg cellen in de thymus uitgedrukt Helios, die hoger was dan in de PDLN en de milt (figuur 2A). Het aandeel van de Nrp1+ cellen onder Helios+ Treg cellen was hoger in de PDLN dan die in de zwezerik en milt (figuur 2B). De meerderheid van de Nrp1+ Treg cellen ook uitgedrukt Helios, en moet de mengverhouding van Helios+ cellen onder Nrp1+Treg cellen in de zwezerik en milt waren hoger dan die in de PDLN (figuur 2C). Samen, deze resultaten wijzen erop dat Helios een betere marker is te detecteren tTreg cellen dan Nrp1.
Figuur 1: vertegenwoordiger gating strategieën voor stroom cytometry. De levende enkele cellen werden omheinde op basis van FSC en WS. Cellen werden vervolgens verder omheinde voor CD4 en CD8 expressie. CD4+CD8- cellen werden meer gated voor de uitdrukking van CD25. Volgende, CD4+CD8-CD25+ cellen werden gated voor Foxp3 expressie. CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen werden gated voor Nrp1 of Helios expressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de uitdrukking van Nrp1 en Helios in Treg cellen van de zwezerik, de PDLN en de milt. Vier 8 week-oude niet-diabetische knik muizen werden opgeofferd. Afzonderlijke cellen waren bereid uit de serie klieren, de PDLNs en de milt. De cellen werden dan gekleurd met fluorescerende geconjugeerde antilichamen voor flow cytometrische analyse. (A) de percentages van Nrp1+ en Helios+ cellen onder CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen. (B) de percentages van Nrp1+ cellen onder Helios+ Treg cellen. (C) de percentages van Helios+ cellen onder Nrp1+ Treg cellen. Resultaten worden uitgedrukt als middel van ± SEM. ***p < 0,001. One-way ANOVA gevolgd door Tukey van meerdere vergelijkingen (A, B en C) en ongepaarde t-tests (A) werden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie, we geïsoleerd van enkele cellen uit de serie klieren, de PDLNs en de milt van knik muizen, en onderzocht de expressie van Helios en Nrp1 in CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg cellen met behulp van stroom cytometry. In de huidige studie, werden knik muizen gebruikt, die is een lymfkliertest model van type 1 diabetes. In een eerdere studie, hebben we de wild type muis stammen CD-1 en C57BL/6 muizen gebruikt om te onderzoeken of Helios of Nrp1 een betere marker is voor tTreg cellen uit de pTreg cellen te onderscheiden. In deze studie gebruikten we een vergelijkbaar protocol om te bepalen van de deelverzamelingen van Treg cellen in naïef muizen9. We vonden dat Helios een betere marker in dit verband is. Daarom hierin we gewend normoglycemic knik muizen bevestigen onze eerdere bevinding in dit model en vond dat de resultaten consistent met onze vorige resultaten10 waren. Dit protocol biedt een efficiënte, nog economische manier te bereiden enkele cellen en ze vervolgens gebruiken voor flow cytometrische analyse. Er zijn verschillende gepubliceerde protocollen waarin afzonderlijke cellen worden bereid met een automatische dissociator11,12. In plaats van met behulp van een dissociator, door knijpen de serie klieren en milt handmatig en de resterende capsule te verwijderen, kunnen we de aanwezigheid van vezelig weefsel in de celsuspensie te voorkomen en ervoor te zorgen dat de celsuspensie bestaat voornamelijk uit immuuncellen en rood de cellen van het bloed. Wij vervolgens NH4Cl gebruikt lyse van de rode bloedcellen. De duur van lysis kan voor een paar minuten worden verlengd als de organen groter dan de normale grootte zijn. Echter, de lysis duur niet teveel moet worden uitgebreid, anders immune cellen ook lysed zal worden. Het is belangrijk om te laten de celsuspensie doorlopen een cap met cel zeef (of andere equivalente cel filters), om te voorkomen dat klomp problemen tijdens stroom cytometry.
Werken in het donker wordt aanbevolen wanneer u werkt met fluorescerende geconjugeerde antilichamen te vermijden langere blootstelling aan licht. We Incubeer de cellen op het ijs voor de extracellulaire en intracellulaire kleuring. De incubatietijd kan ook gebeuren bij kamertemperatuur tot een snellere binding van antilichamen toestaan, maar er is een risico van aspecifieke binding.
Sommige intracellulaire markeringen vereisen grote aantallen cellen goed signalen af te geven in de stroom cytometry. Gezien de kleine omvang van de PDLNs, vereist ze slijpen op een metalen gaas meer zorg om een maximale hoeveelheid immuuncellen. Het verzamelen van meer PDLNs is ook een manier om het aantal cellen verhogen. Een andere beperking van dit protocol is dat de cellen zijn vaste en permeabel voor flow cytometrische analyse, dus ze kunnen niet worden gebruikt voor latere functionele studies. Magnetische sorteren is een optie voor het toestaan van functionele studies als alleen oppervlakte markers van belang zijn.
Dit protocol is toegepast in andere Muismodellen autoimmuniteit en kanker13,14. Eencellige voorbereiding is een eenvoudige maar nuttige techniek om de kenmerken van immuuncellen in verschillende immuun organen te bepalen. Het gebruik van deze methode eencellige voorbereiding kan veroorzaken necrose, wat kan leiden tot vermindering van de totale aantal cellen. De spectrale overlap tussen traditionele stroom cytometry beperkt het aantal markeringen die tegelijkertijd kunnen worden gedetecteerd. Daarom dienen verschillende panelen en grote aantallen cellen te verwerven van een globaal immuun-profiel. In de toekomst, kan dit worden overwonnen door de ontwikkeling van massale cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De huidige studie werd financieel ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, EXODIAB, de Zweedse Diabetes Foundation, de Zweedse kind Diabetes Fonds, SEB Diabetesfonden en O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Auteurs wil ook bedankt Per-Ola Carlsson en Stellan Sandler voor hun ondersteunt en discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
