Summary
Her presenterer vi en protokoll for å forberede enkeltceller fra murine thymus, bukspyttkjertelen drenering lymfeknute og milt å ytterligere studere disse celler ved hjelp av flowcytometri. I tillegg ble denne protokollen brukt for å bestemme delsett av regulatoriske T celler ved hjelp av flowcytometri.
Abstract
Våre immunsystem består av et tall og et utvalg av immunceller inkludert regulatoriske T celler (Treg) celler. Treg celler kan deles inn i to undergrupper, thymic avledede Treg (tTreg) cellene og perifert indusert Treg (pTreg). De finnes i forskjellige organer i kroppen og kan være preget av bestemte markører, som Helios og Neuropilin 1. Det har blitt rapportert at tTreg celler er funksjonelt mer undertrykkende enn pTreg celler. Derfor er det viktig å bestemme andelen av både tTreg og pTreg celler når undersøker ulike celle populasjoner. Her har vi samlet thymic kjertler, bukspyttkjertelen drenering lymfeknuter og spleens fra normoglycemic ikke-obese diabetiker mus å skille tTreg celler fra pTreg celler ved hjelp av flowcytometri. Vi forberedt manuelt enkeltcelle suspensjoner fra disse organene. Fluorochrome bøyd overflate CD4, CD8, CD25 og Neuropilin 1 antistoffer ble brukt stain cellene. De ble holdt i kjøleskapet over natten. På den neste dagen, var cellene farget med fluorochrome konjugert intracellulær Foxp3 og Helios antistoffer. Disse markørene ble brukt for å karakterisere de to undergrupper av Treg celler. Denne protokollen demonstrerer en enkel, men praktisk måte å forberede enkeltceller fra murine thymus, bukspyttkjertelen drenering lymfeknute og milt og bruke dem for påfølgende flyt cytometric analyse.
Introduction
Regulatoriske T (Treg) celler er avgjørende for homeostase av immunsystemet. Treg celler er definert av uttrykk for overflate antigener CD4 og CD25, og den transkripsjon faktor forkhead boksen P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. først viste at CD25 er constitutively uttrykt i T suppressor cellene i mus4, som ga en banebrytende observasjon for identifikasjon av Treg menneskeceller. Treg cellene spille en sentral rolle i immunforsvaret toleranse ved en undertrykkende evne via en rekke mekanismer, inkludert cytolysis gjennom utskillelsen av granzymes å indusere apoptose, cytokin forbruk og hemming gjennom uttrykk for cytotoksiske T-lymfocytt antigen 45. I tillegg kan de skiller hemmende cytokiner som transformerer vekstfaktor beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) og IL-355. Treg celler kan naturlig utledes fra thymus, da de angis thymic avledede Treg (tTreg) celler, eller de kan bli indusert i eksterne organer i dette tilfellet kalles perifert indusert Treg (pTreg) celler.
Helios, medlem av Ikaros transkripsjon faktor familien, ble rapportert å være en markør for å skille mellom tTreg celler og pTreg celler6. Senere, rapportert to andre grupper at Neuropilin 1 (Nrp1), en semaphorin III-reseptor, kunne tjene som en overflate markør for tTreg celler under visse forhold7,8. Likevel, Singh et al. har vist at Helios er en bedre i denne sammenheng i naiv mus9.
Delsett av Treg cellene spille en sentral rolle i vedlikehold av homeostase av immunsystemet og i beskyttelse mot autoimmunitet og infeksjon. Derfor er det viktig å bestemme tallene og proporsjoner av disse befolkningene i både lymfoide og ikke-lymfoid vev. For å oppnå dette, må man forberede enkeltcelle suspensjoner fra disse organene. Flere protokoller er beskrevet eller brukes i tidligere studier. Hovedsakelig, har automatisk dissociators blitt brukt i tidligere publiserte rapporter10,11. Bruke automatiske dissociators er praktisk og tidsbesparende, men det er en kostbar prosedyre. Derfor har vi brukt en manuell metode for å forberede enkeltcelle suspensjoner fra murine thymic kjertler, bukspyttkjertelen drenering lymfeknuter (PDLNs) og spleens fra normoglycemic ikke-obese diabetiker (NIKKER) mus og isolert enkeltceller fra disse organene. Denne metoden er brukt i våre tidligere studier, og vi fant at den manuelle metoden for å forberede enkeltcelle suspensjon er så effektiv som automatisk dissociator metode9,12,13,14. Videre har vi brukt flowcytometri for å bestemme CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg celler og delsett av Treg celler tTreg og pTreg celler. TTreg og pTreg cellene var preget av Helios og Nrp1 indikatorer for tTreg celle. Dermed indikerer våre resultater at den manuelle metoden for å forberede enkeltceller fungerer effektivt og forberedt enkeltcelle karantener kan brukes videre til studier med flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den lokale dyr etiske komiteen ved Uppsala universitet godkjent dyreforsøkene.
1. høsting organer fra dyr
- Ofre mus for cervical forvridning.
- Plasser thymic kjertler og spleens i 20 mL scintillation ampuller eller 15 mL konisk rør fylt med 5 mL av Hanks´ balansert salt løsning (HBSS). Plass PDLNs i 1,5 mL mikro rør fylt med 1 mL av RPMI 1640. Bruk hele thymus og milten, og alle PDLNs.
Merk: Organer bør holdes på is hele prosedyren og etterforskeren bør prøve å være rask klargjøring enkeltcelle suspensjoner, spesielt når du håndterer thymic vev siden thymic immunceller raskt kan reduseres ved høye temperaturer.
2. én celle isolasjon fra Thymus og milt
- Grundig klem thymus og milt med et par pinsett å løslate immunceller. Forkaste gjenværende thymic og splenic kapselen.
- Overføre celle suspensjon til en 15 mL konisk rør og sentrifuge 433 x g for 5 min på 4 ° C til pellets. Kast nedbryting.
- For å lyse røde blod celler, resuspend celle suspensjon i 5 mL 0,2 M NH4Cl og ruge ved romtemperatur for 10 min. Inverter rør opp ned forsiktig hver 2 min. legge 5 mL av HBSS på slutten av inkubering å stoppe lyse.
- Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet på ca 5 mL av HBSS. Fyll rør med HBSS.
- Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet på ca 5 mL av HBSS. Fyll rør med HBSS.
- Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 5 mL av HBSS for thymus og 10 mL for milten.
- Overføring 1 mL av thymic celle suspensjon og 500 µL av splenic celle suspensjon til 5 mL rundt bunnen rør med cellen sil caps. Bruke celle suspensjon celle sil caps.
Merk: En 35 µm nylon maske er innebygd i lokket. Ca 5-10 millioner celler ble samlet i hver retning.
3. enkeltcelle isolasjon fra PDLN
- Plass et sterilt 250 µm metallnett over en 15 mL konisk rør i et rack. Skyll mesh med 1 mL av RPMI.
- Overføre lymfeknutene til metall maske og male dem gjennom nettet med en pinsett. Bruk 1 mL av RPMI metallnett å spyle cellene inn i røret. Gjenta 3 ganger og fjerne mesh.
- Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet på ca 5 mL av RPMI. Fyll rør med RPMI.
- Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet på ca 5 mL av RPMI. Fyll rør med RPMI.
- Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 2 mL RPMI. Overføring 2 mL celle suspensjon til 5 mL rundt bunnen rør med cellen sil caps. Bruke celle suspensjon celle sil caps.
4. flowcytometri
- Virvel av cellen suspensjon fra thymus, PDLN og milt 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Stain cellene med følgende overflaten antistoffer i 100 µL av flowcytometri flekker buffer (FACS buffer): 0,75 µg/100 µL FITC-konjugerte CD4 antistoff, 0,60 µg/100 µL APC-H7-konjugerte CD8 antistoff, 0,30 µg/100 µL CD25 PE-konjugerte antistoffer, 5 µL (1:20) APC-konjugerte Nrp1 antistoff. Inkuber rørene på is 40 min.
- Legge til 200 µL FACS bufferen i hver retning. Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting. Gjenta én gang.
- Fastsette og permeabilize celler av resuspending celle pellet i 500 µL av Permeabilization fiksering Buffer (PFB).
Merk: PFB forberedt ved å blande 1 del av fiksering/Permeabilization konsentrere med 3 deler av fiksering/Permeabilization fortynner. - Holde rørene i kjøleskapet i 4 ° C over natten.
Merk: En 1t inkubasjon fungerer også. - Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 500 µL av Permeabilization vaske bufferen (PWB). Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
Merk: PWB er utarbeidet av fortynne Permeabilization Buffer (10 x) til 1:10 i destillert vann. - Stain cellene med følgende intracellulær antistoffer i 100 µL av PWB: 0,30 µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-konjugerte antistoffer, 4 µL (1:25) PacificBlue-konjugerte Helios antistoff. Inkuber rørene på is 1t.
- Legg til 500 µL av PWB i hver retning. Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 500 µL av PWB. Sentrifuge rør 433 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 300 µL FACS bufferen.
- Analysere cellene i en flyt cytometer.
- Gate enkeltceller basert på Side Scatter-området, høyde og bredde, og frem Scatter-området, høyde og bredde. Kjøre en million hendelser for analyse.
- Eksporterer de FCS eksperimenter og analysere dem ved hjelp av en flyt cytometri analyserer programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøke uttrykk for Nrp1 og Helios på tTreg og pTreg celler, vi forberedt enkeltceller fra thymic kjertler, PDLNs og spleens normoglycemic NIKK mus og farget dem med Treg celle markører CD4, CD25, Foxp3, Helios og Nrp1 for flyt cytometric analyse. Resultatene ble analysert som vist i representant gating strategier (figur 1). Vi fant ut at andelen av Helios+ celler blant CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg celler var høyere enn Nrp1+ celler i alle tre organer (figur 2A). Mer enn 80% av Treg cellene i thymus uttrykt Helios, som var høyere enn i PDLN og milt (figur 2A). Andelen Nrp1+ celler blant Helios+ Treg celler var høyere i PDLN enn i thymus og milt (figur 2B). Fleste Nrp1+ Treg cellene også uttrykt Helios, og andelen Helios+ celler blant Nrp1+Treg celler i thymus og milt var høyere enn i PDLN (figur 2C). Sammen indikerer disse resultatene at Helios er en bedre å oppdage tTreg celler enn Nrp1.
Figur 1: representant gating strategier for flowcytometri. De live enkeltceller var gated basert på FSC og SSC. Deretter ble celler ytterligere gated CD4 og CD8 uttrykk. CD4+CD8- celler ble ytterligere gated for uttrykk for CD25. Neste, CD4+CD8-CD25+ celler var gated Foxp3 uttrykk. CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg celler var gated for Nrp1 eller Helios. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: uttrykk for Nrp1 og Helios i Treg celler i thymus, PDLN og milt. Fire 8 uke gamle ikke-diabetikere NIKK mus ble ofret. Enkeltceller var forberedt fra thymic kjertler, PDLNs og spleens. Cellene ble deretter farget med fluorochrome konjugerte antistoffer for flyt cytometric analyse. (A) prosentandelene av Nrp1+ og Helios+ cellene blant CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg celler. (B) prosentandelene av Nrp1+ celler blant Helios+ Treg celler. (C) prosentandelene av Helios+ celler blant Nrp1+ Treg celler. Resultatene er uttrykt som betyr ± SEM. ***p < 0,001. Enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys flere sammenligninger (A, B og C) og kortet t-tester (A) ble utført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien vi isolert enkeltceller fra thymic kjertler, PDLNs og spleens av NIKK mus, og undersøkt uttrykk for Helios og Nrp1 i CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg celler ved hjelp av flowcytometri. Studien, ble NOD mus brukt, som er en murine modell av type 1 diabetes. I en tidligere studie, har vi brukt vill type musen stammer CD-1 og C57BL/6 mus for å undersøke om Helios eller Nrp1 er en bedre indikator for å skille tTreg celler fra pTreg celler. I denne studien brukt vi en lignende protokoll for å bestemme delsettene Treg celler i naiv mus9. Vi fant at Helios er en bedre i denne sammenheng. Derfor brukte her vi normoglycemic NIKK mus å bekrefte vår tidligere funn i denne modellen og fant at resultatene var forenlig med våre tidligere resultater10. Denne protokollen gir en effektiv og ennå økonomisk måte å forberede enkeltceller og deretter bruke dem til flyt cytometric analyse. Det er flere publiserte protokoller som enkeltceller lages av en automatisk dissociator11,12. Istedenfor å bruke en dissociator, klemme den thymic kjertler og spleens manuelt og forkaste gjenværende kapselen, kan vi unngå tilstedeværelsen av bindevev i cellen suspensjon og sikre celle suspensjon består hovedsakelig av immunceller og rød blod celler. Vi brukte deretter NH4Cl til lyse røde blodlegemer. Varigheten av lysis kan utvides i noen minutter hvis organer er større enn den normale størrelsen. Men hele lysis skal ikke forlenges for mye, ellers immunceller vil også være lysed. Det er viktig å la celle suspensjon gå gjennom en lue med cellen sil (eller andre tilsvarende cellen filtre), å forhindre tette problemer under flowcytometri.
Jobbe i mørket anbefales når du arbeider med fluorochrome konjugerte antistoffer å unngå lengre eksponering for lys. Vi ruge cellene på is ekstracellulære og intracellulære flekker. Inkubasjon kan også gjøres ved romtemperatur å tillate en raskere binding av antistoffer, men det er en risiko uspesifikke bindingen.
Noen intracellulær markører krever stort antall celler å gi gode signalene i flowcytometri. Gitt den lille størrelsen på PDLNs, krever sliping dem på et metallnett mer forsiktig å tillate en maksimal utgivelse av immunceller. Samle flere PDLNs er også en måte å øke cellen. En annen begrensning av denne protokollen er at cellene er fast og permeabilized for flyt cytometric analyse, derfor de ikke brukes for funksjonell studier. Magnetisk sortering er et alternativ å tillate funksjonelle studier hvis bare overflate markører er av interesse.
Denne protokollen er brukt i andre musen modeller av autoimmunitet og kreft13,14. Enkelt celle forberedelse er en grunnleggende, men nyttige teknikk for å angi kjennetegn ved immunceller i ulike immun organer. Benytter denne metoden for enkeltcelle forberedelse, kan det føre til nekrose, som kan resultere i redusert antall celler. Spectral overlappingen av tradisjonelle flowcytometri begrenser antall indikatorer som kan oppdages på samme tid. Flere paneler og stort antall celler er derfor nødvendig å erverve en samlet immun profil. I fremtiden, kan dette bli overvunnet av utviklingen av masse cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Studien ble støttet økonomisk av svenske Forskningsrådet, EXODIAB, den svenske Diabetes Foundation, svenske barn Diabetes fondet, se Diabetesfonden og O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Forfatterne vil også takk Per-Ola Carlsson og Stellan Sandler for deres støtte og diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
