Summary
여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.
Abstract
규제 T 세포 (Treg) 세포 등 면역 세포의 다양 한 숫자와 우리의 면역 체계에 의하여 이루어져 있다. Treg 세포는 두 개의 하위 집합, thymic 파생된 Treg (tTreg) 세포와 주변 유도 Treg (pTreg) 셀으로 나눌 수 있습니다. 그들은 우리의 신체의 다른 장기에 존재 하 고 헬 리오스 Neuropilin 1 등 특정 마커에 의해 구별 될 수 있다. TTreg 세포는 pTreg 셀 보다 기능적으로 더 진압으로 보고 되었습니다. 따라서, 그것은 다른 유형의 세포 인구를 조사할 때 tTreg와 pTreg 세포의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 수집 thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프절과 spleens cytometry를 사용 하 여 pTreg 세포에서 tTreg 셀을 구별 normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 쥐에서. 우리는 수동으로 단일 셀 정지가이 기관에서 준비. 형광 색소 활용 된 표면 CD4, CD8, CD25, 그리고 Neuropilin 1 항 체는 세포 얼룩 사용 되었다. 그들은 하룻밤 냉장고에 보관 했다. 다음 날, 세포 형광 색소 활용 된 세포내 Foxp3와 헬 리오스 항 체와 얼룩이 있었다. 이러한 마커는 Treg 세포의 두 하위 집합 하 사용 되었다. 이 프로토콜에서는 murine thymus, 림프절, 비장을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하 고 이후의 흐름 cytometric 분석을 위해 그들을 사용 하는 간단 하지만 실용적인 방법을 보여 줍니다.
Introduction
규정 (Treg) T 세포는 면역 시스템의 항상 성에 대 한 중요 합니다. Treg 세포 표면 항 원 c d 4의 식와 CD25, 및 녹음 방송 요인 forkhead 상자 P3 (Foxp3)1,2,3에 의해 정의 됩니다. 사 카 구치 외. 먼저 CD25 constitutively 쥐4, 인간 Treg 세포의 식별에 대 한 선구적인 관찰을 제공 하는 T 억제기 세포에 표현 된 보여주었다. Treg 세포 apoptosis, cytokine 소비 및 세포 독성의 표현을 통해 억제를 유도 하는 granzymes의 분 비를 통해 cytolysis를 포함 하 여 메커니즘의 다양 한 통해 진압 능력을 발휘 하 여 면역 관용에 중심 역할을 담당 T-림프 구 항 45. 또한, 그들은 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 인터 루 킨-10 (IL-10) 및 IL-355등 억제 cytokines를 분 비 수 있습니다. Treg 세포 자연스럽 게 파생 될 수 있다, thymus에서 thymic 파생된 Treg (tTreg) 셀, 지정 되어 어떤 경우에 또는 케이스 주변 유도 Treg (pTreg) 셀 이라고 그 주변 기관에서 유도 될 수 있다.
헬 리오스, Ikaros 녹음 방송 요인 가족의 일원이 tTreg 세포 사이 구별을 위한 마커 이기 위하여 보고 되었다 그리고 pTreg 세포6. 나중에, 다른 두 그룹 Neuropilin 1 (Nrp1), semaphorin III 수용 체 특정 조건7,8에서 tTreg 세포에 대 한 표면 표식으로 될 수 있는 보고. 그럼에도 불구 하 고, 싱 외. 헬 리오스는 순진한 마우스9에서 이런이 맥락에서 더 나은 표식으로 나타났습니다.
Treg 세포의 하위 집합 및 면역 및 감염에 대 한 보호 면역 체계의 항상성 유지에 중추적인 역할. 따라서, 그것은 숫자와 림프 및 비 림프 조직에 이러한 인구의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 이를 위해, 하나의 단일 셀이이 기관에서 정지를 준비 하고있다. 여러 프로토콜 설명 또는 이전 연구에서 사용 된 있다. 주로, 자동 dissociators 이전 게시 된 보고서10,11에 사용 되었습니다. 자동 dissociators를 사용 하는 편리 하 고 시간 절약, 하지만 그것은 비싼 절차. 따라서, normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 (끄 덕) 쥐, 및이 기관에서 격리 된 단일 셀에서 murine thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프 노드 (PDLNs) 및 spleens 단일 셀 정지를 준비 하는 수동 방법을 사용 했습니다. 이 방법은 우리의 이전 연구에서 사용 되었습니다 그리고 우리는 단일 세포 현 탁 액을 준비 하기 위한 수동 방법 자동 dissociator 방법9,12,,1314만큼 효율적 이다 발견. 또한, 우리는 CD4의 비율을 확인 하려면 cytometry 사용+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포와 Treg 하위 집합 tTreg 및 pTreg 세포 세포. TTreg 및 pTreg 세포 tTreg 세포에 대 한 표식으로 헬 리오스와 Nrp1를 사용 하 여 구분 했다. 따라서, 우리의 결과 단일 셀을 준비 하기 위한 수동 방법 효율적으로 작동 하 고 준비 된 단일 셀 정지 추가 연구 cytometry 사용 하 여 사용 될 수 있습니다 나타냅니다.
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Protocol
웁살라 대학에서 로컬 동물 윤리 위원회 동물 실험 승인.
1. 동물에서 장기 수확
- 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 희생.
- Thymic 샘 놓고 20 mL 섬광 튜브 또는 15 mL 원뿔 튜브 Hanks´의 5 mL로 가득 spleens 균형 소금물 (HBSS). 1.5 mL 마이크로 튜브 RPMI 1640의 1 mL로 가득에서 장소 PDLNs. 전체 thymus, 비장, 그리고 모든 PDLNs를 사용 합니다.
참고: 기관 절차에 걸쳐 얼음에 보관 해야 하 고 탐정 thymic 면역 세포 높은 온도에서 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 이후 thymic 조직을 처리 하는 경우에 특히 단일 셀 정지를 준비 하는 동안 빠른 수 하려고 한다.
2. 단일 셀 별개로 Thymus, 비장
- 철저 하 게 짠 다 thymus, 비장 면역 세포를 분리 하는 핀셋 한 켤레. 나머지 thymic 및 비장 캡슐을 삭제 합니다.
- 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 펠 릿을 형성 하기 위하여 4 ° C에서 5 분에 대 한 433 x g 에서 원심 분리기를 전송 합니다. 폐기는 상쾌한.
- 붉은 혈액 세포를 lyse 세포 현 탁 액 0.2 M NH4Cl의 5 mL에 resuspend 하 고 10 분 반전 튜브 거꾸로 부드럽게 매 2 분 추가 5 mL는 세포를 중지 하는 외피의 끝에 HBSS의 대 한 상 온에서 품 어.
- 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- HBSS 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. HBSS로 튜브를 채우십시오.
- 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- HBSS 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. HBSS로 튜브를 채우십시오.
- 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- Thymus 위한 HBSS의 5 mL와 10 mL 비장에 대 한에 셀 펠 릿을 resuspend.
- Thymic 셀 서 스 펜 션의 1 mL 및 비장 세포 현 탁 액 5 ml의 500 µ L 라운드 셀 스 트레이너 모자 하단 튜브. 셀 스 트레이너 모자에 세포 현 탁 액을 적용 합니다.
참고: 35 µ m 나일론 메쉬 모자에 통합 됩니다. 약 5-10 백만 셀 각 튜브에 수집 되었다.
3. 단일 셀 별개로 PDLN
- 15 mL 원뿔 튜브 랙에 살 균 250 µ m 금속 메시를 놓습니다. 메쉬 RPMI의 1 mL와 린스.
- 금속 메쉬를 림프 노드를 전송 하 고 핀셋의 쌍을 사용 하 여 메시를 통해 그들을 갈기. 튜브에 세포를 금속 메쉬에 RPMI의 1 mL를 적용 합니다. 3 번 더 반복 하 고 메시를 제거 합니다.
- 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- RPMI의 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 튜브를 RPMI 채우십시오.
- 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- RPMI의 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 튜브를 RPMI 채우십시오.
- 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- 2 ml RPMI의 셀 펠 릿을 resuspend. 이전 셀 서 스 펜 션의 2 mL 5 mL 라운드 셀 스 트레이너 모자 하단 튜브. 셀 스 트레이너 모자에 세포 현 탁 액을 적용 합니다.
4. Cytometry
- Thymus, PDLN 및 4 ° c.에서 5 분에 대 한 433 x g 에서 비장 세포 정지 원심 폐기는 상쾌한.
- Cytometry 버퍼 (버퍼 FACS) 얼룩의 100 µ L에 다음 표면 항 체와 세포 얼룩: 0.75 µ g/100 µ L CD4 FITC 활용 된 항 체, 0.60 µ g/100 µ L APC H7 활용 된 CD8 항 체, 0.30 µ g/100 µ L CD25 PE 활용 된 항 체, 5 µ L (1: 20) APC 활용 된 Nrp1 항 체입니다. 40 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.
- 각 튜브를 FACS 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한. 한 번 더 반복 합니다.
- 수정 하 고 500 µ L Permeabilization 고정 버퍼 (PFB)의에서 셀 펠 릿을 resuspending 하 여 세포를 permeabilize.
참고: PFB는 고정/Permeabilization 고정/Permeabilization 희석제의 3 부분으로 집중의 1 부분을 혼합 하 여 준비 된다. - 하룻밤에 4 ° C 냉장고에 튜브를 유지.
참고: 1 시간 보육도 작동합니다. - 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- 500 µ L Permeabilization 세척 버퍼 (PWB)의에서 셀 펠 릿을 resuspend. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
참고: PWB Permeabilization diluting 준비한 증류수에 1:10 (10 배)를 버퍼. - PWB의 100 µ L에 다음 세포내 항 체와 세포 얼룩: 0.30 µ g/100 µ L Foxp3 PE Cy7 활용 된 항 체, 4 µ L (1: 25) 헬 리오스 PacificBlue 활용 된 항 체. 1 시간에 대 한 얼음에 튜브를 품 어.
- 각 튜브를 PWB의 500 µ L를 추가 합니다. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- PWB의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
- FACS 버퍼의 300 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 에 교류 cytometer 세포 분석.
- 측면 살포 지역, 높이 폭, 그리고 앞으로 피해 지역, 높이 너비에 따라 단일 셀 게이트 분석에 대 한 1 백만 이벤트를 실행 합니다.
- 실험의 FCS 파일 내보내고 흐름 cytometry 분석기 소프트웨어를 사용 하 여 분석.
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Representative Results
Nrp1 및 tTreg 및 pTreg 세포에 헬 리오스의 식을 조사, 우리 thymic 동맥, PDLNs 및 normoglycemic 끄 덕 임 쥐의 spleens에서에서 단일 셀을 준비 하 고 흐름 cytometric 위한 Treg 세포 마커 CD4, CD25, Foxp3, 헬 리오스와 Nrp1으로 그들을 물 분석입니다. 결과 전략 (그림 1) 게이팅 담당자와 같이 분석 되었다. 우리는 CD4 중 헬 리오스+ 세포의 비율을 발견+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포는 Nrp1 이상+ 모든 3 개의 기관 (그림 2A)에서 세포. Thymus Treg 세포의 80% 이상이 표현 헬 리오스, PDLN 및 비장 (그림 2A)에서 보다 높은 했다. Nrp1의 비율+ 헬 리오스+ Treg 세포 중 세포 thymus, 비장 (그림 2B)에 보다는 PDLN에서 높았다. 대부분의 Nrp1+ Treg 세포 표현된 헬 리오스와 Nrp1 사이에서 헬 리오스+ 세포의 비율 또한+Treg 세포 thymus 및 비장 PDLN (그림 2C) 보다 높았다. 함께, 이러한 결과 헬 리오스 Nrp1 보다 tTreg 셀을 검출 하는 더 나은 표식 임을 나타냅니다.
그림 1: 게이팅 cytometry 전략 대표. 라이브 단일 셀 FSC 그리고 SSC에 따라 문이 있었다. 다음, 세포 c d 4와 CD8 식 문이 추가 되었다. CD4+CD8- 셀 CD25의 표현에 대 한 문이 추가 되었다. 다음, CD4+CD8-CD25+ 세포 Foxp3 표현에 대 한 문이 있었다. CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포 Nrp1 또는 헬 리오스 식 문이 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Nrp1 및 PDLN, thymus, 비장 Treg 세포 헬 리오스의 식. 4 8 주 오래 된 비 당뇨병 끄 덕 임 쥐 희생 했다. 단일 셀 thymic 동맥, PDLNs 및 spleens에서 준비 되었다. 셀 흐름 cytometric 분석을 위한 형광 색소 활용 된 항 체와 함께 다음 얼룩이 했다. (A) Nrp1의 비율+ 헬 리오스+ 중 CD4 세포와+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포. (B) Nrp1의 비율+ + 헬 리오스 Treg 세포 중 세포. (C) Nrp1 중 헬 리오스+ 의 백분율 셀+ Treg 세포. 결과 ± SEM. 수단으로 표현 * * *p < 0.001. Tukey의 다중 비교 (A, B 및 C) 뒤 일방통행 ANOVA와 짝이 없는 t-테스트 (A) 수행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서 우리는 thymic 동맥, PDLNs 및 끄 덕 임 쥐의 spleens에서 단일 셀을 절연 하 고 헬 리오스와 CD4에 Nrp1의 식을 조사+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 세포 cytometry 사용 하 여. 현재 연구는 타입-1 당뇨병의 murine 모델은 끄 덕 임 쥐가 사용 되었다. 이전 연구에서 우리는 헬 리오스 또는 Nrp1 tTreg pTreg 세포에서 세포를 구별을 위한 더 나은 표식 인지를 조사 하는 야생 타입 마우스 CD-1 긴장과 C57BL/6 마우스를 이용 했다. 그 연구에 우리 순진한 마우스9Treg 세포의 하위 집합을 결정 하기 위해 비슷한 프로토콜 사용. 우리 헬 리오스가이 맥락에서 더 나은 마커 발견. 따라서, 여기에 우리가이 모델에 우리의 이전 발견을 확인 하 여 결과10우리의 이전 결과 일치 했다 발견 normoglycemic 끄 덕 임 쥐 사용. 이 프로토콜에는 단일 세포를 준비 하 고 이후 흐름 cytometric 분석을 위해 그들을 사용 하는 효율적이 고 경제적인 방법을 제공 합니다. 있는 단일 셀 준비가 자동 dissociator11,12를 사용 하 여 여러 게시 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. dissociator를 사용 하 여 수동으로 thymic 샘과 spleens 압박 하 고 나머지 캡슐을 삭제 하 여, 대신 우리가 세포 현 탁 액에 섬유 조직의 존재를 피할 수 있고 세포 현 탁 액은 주로 면역 세포와 레드의 구성 확인 혈액 세포입니다. 우리는 붉은 혈액 세포를 lyse 데 NH4Cl를 사용 됩니다. 세포의 기간 장기 정상적인 크기 보다 큰 경우 몇 분 더 확장할 수 있다. 그러나, 세포의 용 해 시간 너무 많이 확장 하지 해야, 그렇지 않으면 면역 세포는 또한 lysed 것입니다. 그것은 세포 현 탁 액 cytometry 동안 셀 스 트레이너 (또는 다른 동등한 셀 필터), 덩어리 문제를 방지 하려면 모자를 통과 하 게 해야 합니다.
어둠 속에서 일 하는 것이 좋습니다 형광 색소 활용 된 항 체를 작업할 때 빛을 긴 노출을 피하기 위해. 우리는 얼음 세포 외 및 세포내 얼룩에 대 한 셀을 품 어. 외피는 또한 항 체의 빠른 바인딩 수 있도록 실내 온도에서 할 수 있습니다 하지만 불특정 바인딩의 위험이 있다.
일부 세포 마커 cytometry에 좋은 신호를 주고 세포의 많은 필요 합니다. PDLNs의 작은 크기를 감안할 때, 면역 세포의 최대한 릴리스 수 있도록 더 많은 주의 해야 합니다 금속 메쉬에 그들을 연 삭. 더 많은 PDLNs를 수집 셀 번호를 증가 하는 방법 이기도 합니다. 이 프로토콜의 또 다른 한계는 셀 고정 및 흐름 cytometric 분석에 대 한 permeabilized, 따라서 그들은 후속 기능 연구에 사용할 수 없습니다. 자기 정렬 경우에 표면 마커는 관심의 기능 연구를 허용 하는 옵션입니다.
이 프로토콜은 면역, 암13,14의 다른 마우스 모델에 적용 되었다. 단일 셀 준비 다른 면역 기관 면역 세포의 특성을 결정 하는 기본적인 하지만 유용한 기술입니다. 이 메서드를 사용 하 여 단일 셀 준비를 위해 괴 사 세포의 총 수를 감소 발생할 수 있습니다 발생할 수 있습니다. 전통적인 cytometry의 스펙트럼 중첩 마커를 동시에 검출 될 수 있는 수를 제한 합니다. 따라서, 여러 패널 및 셀의 큰 숫자는 전반적 면역 프로필을 취득 해야 합니다. 미래에,이 대량 cytometry의 개발에 의해 극복할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
현재 연구는 스웨덴 연구 위원회, EXODIAB, 스웨덴 당뇨병 재단, 스웨덴 어린이 당뇨병 펀드, 셉 Diabetesfonden 및 O.E. 그리고 Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse에 의해 재정적으로 지원 되었다. 저자 또한 감사 당-올라요 Carlsson Stellan 샌들러 그들의 지원 및 토론에 대 한 같은 것 이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
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