Summary
Häri, presenterar vi ett protokoll för att förbereda enstaka celler från murina tymus, pankreas dränerande lymfkörtel och mjälte fortsätta att undersöka dessa celler med hjälp av flödescytometri. Dessutom var detta protokoll används för att bestämma delmängder av regulatoriska T-celler med hjälp av flödescytometri.
Abstract
Vårt immunförsvar består av ett antal och mängd immunceller inklusive regulatoriska T-celler (Treg) celler. Treg-celler kan delas in i två undergrupper, thymic härledda Treg (tTreg) och perifert inducerade Treg (pTreg) celler. De finns i olika organ i vår kropp och kan särskiljas genom specifika markörer, såsom Helios och Neuropilin 1. Det har rapporterats att tTreg celler är funktionellt mer repressiv än pTreg celler. Det är därför viktigt att bestämma hur stor andel av både tTreg och pTreg celler när du undersöker heterogena cellpopulationer. Häri, samlat vi thymic körtlar, bukspottskörteln dränerande lymfkörtlar och mjälte från normoglycemic icke-feta diabetiska möss att skilja tTreg celler från pTreg celler med hjälp av flödescytometri. Vi förberett manuellt enda cellsuspensioner från dessa organ. Fluorokrom konjugerat ytan CD4, CD8, CD25, och Neuropilin 1 antikroppar användes för att färga cellerna. De hålls i kylen över natten. Nästa dag var cellerna färgas med fluorokrom konjugerat intracellulära Foxp3 och Helios antikroppar. Dessa markörer har använts för att karakterisera två delmängder av Treg-celler. Detta protokoll visar enkla men praktiska sätt att förbereda enstaka celler från murina tymus, pankreas dränerande lymfkörtel och mjälte och använda dem för efterföljande flöde flödescytometrisk analys.
Introduction
Regulatoriska T (Treg)-celler är kritiska för homeostas av immunsystemet. Treg-celler definieras av uttrycket av ytantigener CD4 CD25 och transkription faktorn forkhead box P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. visade först att CD25 konstitutivt uttrycks på T suppressor celler i möss4, som gav en banbrytande observation för identifiering av mänskliga Treg-celler. Treg-celler spelar en central roll i immuntolerans genom att utöva en suppressiv förmåga via olika mekanismer, inklusive cytolys genom utsöndring av granzymes att inducera apoptos, cytokin konsumtion och hämning genom uttrycket av cytotoxiska T-lymfocyter antigen 45. Dessutom kan de utsöndra inhibitoriska cytokiner såsom omvandla tillväxt factor-beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) och IL-355. Treg-celler kan naturligtvis härledas från tymus, i vilket fall de designeras thymic härledda Treg (tTreg)-celler, eller de kan induceras i perifera organ i detta fall kallas perifert inducerade Treg (pTreg) celler.
Helios, en medlem av familjen Ikaros transkription faktorn, rapporterades vara en markör för att skilja mellan tTreg celler och pTreg celler6. Två andra grupper rapporterade senare, att Neuropilin 1 (Nrp1), en semaphorin III-receptorn, kan tjäna som en surface markör för tTreg celler under vissa villkor7,8. Singh et al. har dock visat att Helios är en bättre markör i detta sammanhang i naiva möss9.
Delmängder av Treg-celler spelar en nyckelroll i att upprätthålla homeostas av immunsystemet och i skydd mot autoimmunitet och infektion. Det är därför viktigt att fastställa antal och proportioner av dessa populationer i både lymfoida och icke-lymfoida vävnader. För att uppnå detta, måste man förbereda enda cellsuspensioner från dessa organ. Ett antal protokoll har beskrivit eller används i tidigare studier. Främst, har automatiska dissociators använts i tidigare publicerade rapporter10,11. Använda automatisk dissociators är bekvämt och tidsbesparande, men det är ett dyrt förfarande. Därför har vi använt en manuell metod för att förbereda enda cellsuspensioner från murina thymic körtlar, bukspottskörteln dränerande lymfkörtlar (PDLNs) och mjälte från normoglycemic icke-feta diabetiker (nicka) möss och isolerade enstaka celler från dessa organ. Denna metod har använts i våra tidigare studier och vi fann att den manuella metoden för att förbereda enda cellsuspension är lika effektiva som automatisk dissociator metod9,12,13,14. Dessutom använde vi flödescytometri för att bestämma andelen CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg-celler och delmängder av Treg-celler tTreg och pTreg celler. TTreg och pTreg celler var distingerade med Helios och Nrp1 som markörer för tTreg cell. Våra resultat tyder således, att den manuella metoden för att förbereda de enda cellerna fungerar effektivt och de beredda enda cellsuspensioner kan användas vidare för studier med hjälp av flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lokala djur etikkommittén vid Uppsala universitet godkända i djurförsök.
1. skörd organ från djur
- Offra möss av cervikal Dislokation.
- Placera thymic körtlar och mjälte i 20 mL injektionsflaskor av scintillation eller 15 mL koniska rör fyllda med 5 mL av Hanks´ balanserad saltlösning (HBSS). Plats PDLNs i 1,5 mL mikro rör fyllda med 1 mL RPMI 1640. Använd hela bräss och mjälte, och alla PDLNs.
Obs: Organ bör hållas på is under hela förfarandet och utredaren bör försöka vara snabb samtidigt förbereda enda cellsuspensioner, särskilt vid hantering thymic vävnad eftersom thymic immunceller kan brytas ned snabbt vid höga temperaturer.
2. enstaka Cell isolering från Thymus och mjälte
- Grundligt pressa den bräss och mjälte med en pincett att släppa immuncellerna. Kassera återstående thymic och mjälten kapseln.
- Överföra cellsuspensionen till en 15 mL koniska rör och centrifugera vid 433 x g i 5 minuter vid 4 ° C att bilda en pellet. Kassera supernatanten.
- För att lysera röda blodkroppar, omsuspendera cellsuspensionen i 5 mL 0,2 M NH4Cl och inkubera vid rumstemperatur för 10 min. Vänd rören uppochner försiktigt varje 2 min. Tillsätt 5 mL av HBSS i slutet av inkubering att stoppa Lys.
- Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i cirka 5 mL HBSS. Fyll rören med HBSS.
- Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i cirka 5 mL HBSS. Fyll rören med HBSS.
- Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i i HBSS för thymus 5 mL och 10 mL för mjälte.
- Överför 1 mL thymic cellsuspensionen och 500 µL av mjälten cellsuspensionen till 5 mL runda botten rör med cell sil lock. Cellsuspensionen gälla cell sil mössor.
Obs: En 35 µm nylon mesh införlivas i den gemensamma jordbrukspolitiken. Cirka 5-10 miljoner celler samlades i varje rör.
3. enda Cell isolering från PDLN
- Placera en steril 250 µm metallnät över en 15 mL konisk slang i ett rack. Skölj mesh med 1 mL RPMI.
- Överföra lymfkörtlarna till metallnät och mal dem genom maskorna med hjälp av ett par pincett. Applicera 1 mL RPMI på den metallnät att spola cellerna i röret. Upprepa 3 gånger och ta bort mesh.
- Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i cirka 5 mL RPMI. Fyll rören med RPMI.
- Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i cirka 5 mL RPMI. Fyll rören med RPMI.
- Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 2 mL RPMI. Överföring 2 mL cellsuspension till 5 mL runda botten rör med cell sil lock. Cellsuspensionen gälla cell sil mössor.
4. flödescytometri
- Centrifugera cellsuspensioner från thymus, PDLN och mjälte vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Färga celler med följande ytan antikroppar i 100 µL av flödescytometri färgning buffert (FACS buffert): 0,75 µg/100 µL CD4 FITC-konjugerad antikropp, 0.60 µg/100 µL CD8 APC-H7-konjugerad antikropp, 0.30 µg/100 µL CD25 PE-konjugerad antikropp, 5 µL (1:20) APC-konjugerad Nrp1 antikropp. Inkubera rören på is för 40 min.
- Tillsätt 200 µL FACS buffert i varje rör. Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten. Upprepa en gång.
- Fixa och permeabilize cellerna av omblandning cellpelleten i 500 µL av permeabilisering fixering buffert (PFB).
Obs: PFB är beredd genom att blanda 1 del fixering/permeabilisering koncentrat med 3 delar av fixering/permeabilisering spädningsvätska. - Hålla rören i kylen vid 4 ° C över natten.
Obs: En 1 h inkubation fungerar också. - Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 500 µL av permeabilisering tvätt buffert (PWB). Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
Obs: PWB bereds genom att permeabilisering buffert (10 x) 1:10 i destillerat vatten. - Färga celler med följande intracellulära antikroppar i 100 µL av PWB: 0.30 µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-konjugerad antikropp, 4 µL (1:25) Helios PacificBlue-konjugerad antikropp. Inkubera rören på is för 1 h.
- Tillsätt 500 µL PWB i varje rör. Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 500 µL av PWB. Centrifugera rören vid 433 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 300 µL av FACS buffert.
- Analysera cellerna på en flödescytometer.
- Utfärda utegångsförbud för de enstaka celler baserat på Side Scatter-Area, höjd och bredd, och framåt Scatter-området, höjd och bredd. Kör en miljon händelser för analys.
- Exportera FCS filer av experiment och analysera dem med hjälp av ett flöde flödescytometri analyzer programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka uttrycket av Nrp1 och Helios på tTreg och pTreg celler, vi förberedda enstaka celler från thymic körtlar, PDLNs och mjälte normoglycemic nicka möss och målat dem med de Treg cell markörerna CD4, CD25, Foxp3, Helios och Nrp1 för flöde flödescytometrisk analys. Resultaten analyserades som visas i den representativa gating strategier (figur 1). Vi fann att andelen bland CD4 celler på Helios+ +CD8–CD25+Foxp3+ Treg celler var högre än för Nrp1+ celler i alla tre organ (figur 2A). Mer än 80% av de Treg-cellerna i brässen uttryckte Helios, som var högre än i PDLN och mjälte (figur 2A). Andelen Nrp1+ celler bland Helios+ Treg-celler var högre i PDLN än de i thymus och mjälte (figur 2B). Majoriteten av Nrp1+ Treg-celler också uttryckt Helios och proportionerna av Helios+ celler bland Nrp1+Treg-celler i tymus och mjälten var högre än i PDLN (figur 2 c). Tillsammans, indikerar dessa resultat att Helios är en bättre markör för att upptäcka tTreg celler än Nrp1.
Figur 1: representativa gating strategier för flödescytometri. De levande enstaka cellerna var gated baserat på FSC och SSC. Cellerna var sedan ytterligare gated för CD4 och CD8 uttryck. CD4+CD8– celler var ytterligare gated av uttryck för CD25. Nästa, CD4+CD8–CD25+ celler var gated för Foxp3 uttryck. CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg celler var gated för Nrp1 eller Helios uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: uttryck för Nrp1 och Helios i Treg-celler i tymus, PDLN och mjälte. Fyra 8 veckor gamla icke-diabetiker nicka möss offrades. Enstaka celler var beredda från thymic körtlar, PDLNs och mjälte. Cellerna var sedan färgas med fluorokrom konjugerade antikroppar för flöde flödescytometrisk analys. (A) procentsatserna för Nrp1+ och Helios+ celler bland CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg celler. (B) andelen Nrp1+ celler bland Helios+ Treg-celler. (C) procentsatserna av Helios+ celler bland Nrp1+ Treg celler. Resultaten uttrycks som betyder ± SEM. ***p < 0,001. Envägs ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelser (A, B och C) och oparat t-test (A) utfördes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie vi isolerade enstaka celler från thymic körtlar, PDLNs och mjälte nicka möss, och undersökt uttrycket av Helios och Nrp1 i CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg-celler med hjälp av flödescytometri. I den aktuella studien användes nicka möss, som är en murin modell av typ 1-diabetes. I en tidigare studie har vi använt vildtyp mus stammar CD-1 och C57BL/6 möss för att undersöka om Helios eller Nrp1 är en bättre markör för att skilja tTreg celler från pTreg celler. I denna studie använde vi en liknande protokoll för att bestämma delmängder av Treg-celler i naiva möss9. Vi fann att Helios är en bättre markör i detta sammanhang. Därför använde häri vi normoglycemic nicka möss att bekräfta vår tidigare slutsats i denna modell och fann att resultaten överensstämde med vår tidigare resultat10. Detta protokoll ger en effektiv, ännu ekonomiskt sätt att förbereda enstaka celler och sedan använda dem för flöde flödescytometrisk analys. I området i närheten finns det flera publicerade protokoll som enstaka celler är förberedda med hjälp av en automatisk dissociator11,12. Istället för att använda en dissociator, genom att klämma den thymic körtlar och mjälte manuellt och kasta återstående kapseln, kan vi undvika förekomst av fibrös vävnad i cellsuspensionen och kontrollera cellsuspensionen består huvudsakligen av immunceller och röd blodkroppar. Vi använde då NH4Cl för att lysera röda blodkroppar. Varaktigheten av Lys kan förlängas för ytterligare några minuter om organ är större än normal storlek. Men Lys varaktighet inte bör utvidgas för mycket, annars immunceller kommer också vara lyserat. Det är viktigt att låta cellsuspensionen gå igenom en mössa med cell sil (eller andra motsvarande cell filter), att förhindra täppa problem under flödescytometri.
Arbetar i mörkret rekommenderas när du arbetar med fluorokrom konjugerade antikroppar att undvika längre exponering för ljus. Vi Inkubera cellerna på is för extracellulära och intracellulära färgning. Inkubationstiden kan också göras i rumstemperatur att tillåta en snabbare bindning av antikroppar, men det finns en risk för ospecifik bindning.
Vissa intracellulära markörer kräver stort antal celler för att ge bra signaler i flödescytometri. Med tanke på den ringa storleken av PDLNs, kräver slipning dem på ett metallnät mer vård att tillåta en maximal release av immunceller. Samla mer PDLNs är också ett sätt att öka antalet cell. En annan begränsning i detta protokoll är att cellerna är fast och permeabilized för flöde flödescytometrisk analys, således de kan inte användas för efterföljande funktionella studier. Magnetiska sortering är ett alternativ att tillåta funktionella studier om bara yta markörer är av intresse.
Detta protokoll har tillämpats i andra musmodeller av autoimmunitet och cancer13,14. Enstaka cell förberedelser är en grundläggande men användbar teknik för att fastställa egenskaperna hos immunceller i olika immun organ. Med den här metoden för enstaka cell förberedelse kan orsaka nekros, vilket kan resultera i minskade det totala antalet celler. Spektral överlappningen av traditionella flödescytometri begränsar antalet markörer som kan detekteras på samma gång. Därför krävs flera paneler och stort antal celler att förvärva en övergripande immun profil. I framtiden kan detta lösas genom utveckling av massa flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Föreliggande studie stöddes ekonomiskt av Vetenskapsrådet, EXODIAB, Diabetes stiftelsen, svenska barn Diabetes fonden, SEB Diabetesfonden och O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Författarna vill även tack Per-Ola Carlsson och Stellan Sandler för deras stöd och diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
