Summary
Neste documento, apresentamos um protocolo para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço para um estudo mais aprofundado destas células usando citometria de fluxo. Além disso, este protocolo foi utilizado para determinar os subconjuntos de pilhas de T reguladoras usando citometria de fluxo.
Abstract
Nosso sistema imunológico consiste de um número e variedade de células imunes, incluindo células de células (Treg) T reguladoras. Células TREG podem ser divididas em dois subconjuntos, tímicas células derivadas de Treg (tTreg) e perifericamente induzida por células Treg (pTreg). Eles estão presentes em diferentes órgãos do nosso corpo e podem ser diferenciados por marcadores específicos, tais como o Helios e Neuropilin 1. Relatou-se que as células tTreg são funcionalmente mais supressivas do que células pTreg. Portanto, é importante determinar a proporção de células tanto tTreg e pTreg na investigação de populações de células heterogêneas. Neste documento, coletamos glândulas do timo, pancreáticos drenagem de linfonodos e baço de normoglycemic não-obesos diabéticos ratos para distinguir células de tTreg de pTreg células usando citometria de fluxo. Estamos preparados manualmente suspensões única célula por estes órgãos. Conjugados a fluorocromo superfície CD4, CD8, CD25, e anticorpos Neuropilin 1 foram usados para manchar as células. Eles foram mantidos na geladeira durante a noite. No dia seguinte, as células foram coradas com anticorpos intracelulares de Foxp3 e Helios fluorocromo conjugado. Estes marcadores foram usados para caracterizar os dois subconjuntos de células Treg. Este protocolo demonstra uma maneira simples, mas prática para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço e usá-los para análise de subsequentes fluxo cytometric.
Introduction
Pilhas de T (Treg) reguladoras são essenciais para a homeostase do sistema imune. Células TREG são definidas pela expressão de antígenos de superfície CD4 e CD25 e transcrição fator forkhead caixa P3 (Foxp3)1,2,3. Primeiro, Sakaguchi et al mostrou que CD25 é constitutivamente expressa em células T supressor ratos4, que previa uma observação pioneira para a identificação de células Treg humanas. Células TREG desempenham um papel central na tolerância imunológica, exercendo uma capacidade supressora através de uma variedade de mecanismos, incluindo citólise através da secreção de granzymes para induzir apoptose, consumo de citocinas e inibição através da expressão de citotóxicos Linfócitos T antígeno 45. Além disso, eles podem secretam citocinas inibidoras como transformar o fator de crescimento beta (TGF-β), interleucina-10 (IL-10) e IL-355. Células TREG naturalmente podem ser derivadas de timo, caso em que eles são designados do Timo células derivadas de Treg (tTreg), ou eles podem ser induzidos nos órgãos periféricos, nesse caso são chamados perifericamente induzida por células Treg (pTreg).
Helios, um membro da família de factor de transcrição Ikaros, foi relatado para ser um marcador para distinguir entre as células tTreg células e e pTreg6. Mais tarde, dois outros grupos relataram que Neuropilin 1 (Nrp1), um receptor III semaphorin, poderia servir como um marcador de superfície para tTreg células sob determinadas condições de7,8. Não obstante, Singh et al demonstraram que o Helios é um marcador melhor neste contexto em ingênuo ratos9.
Os subconjuntos de células Treg desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase do sistema imune e na proteção contra a infecção e autoimunidade. Portanto, é importante determinar os números e proporções dessas populações nos tecidos linfoides e não linfoides. Para conseguir isso, é preciso preparar suspensões única célula por estes órgãos. Um número de protocolos foram descrito ou utilizado em estudos anteriores. Principalmente, dissociators automáticos têm sido utilizados em relatórios publicados anteriormente10,11. Usar o dissociators automáticos é conveniente e economia de tempo, mas é um procedimento caro. Portanto, usamos um método manual para preparar suspensões única célula de murino glândulas do timo, linfonodos pancreáticos (PDLNs) drenagem e baços de normoglycemic não-obesos diabéticos (ASSENTIMENTO) mouses e células únicas isoladas por estes órgãos. Este método tem sido utilizado em nossos estudos anteriores e descobrimos que o método manual para preparar a suspensão de célula única é tão eficiente quanto dissociador automático método9,12,13,14. Além disso, usamos a citometria de fluxo para determinar as proporções de CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células e subconjuntos de Treg células tTreg e pTreg. As células tTreg e pTreg foram distinguidas usando o Helios e Nrp1 como marcadores de células tTreg. Assim, nossos resultados indicam que o método manual para preparar as células única funciona eficientemente e as suspensões preparadas única célula podem ser ainda mais usadas para estudos utilizando citometria de fluxo.
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Protocol
Comitê local de ética animal na Universidade de Uppsala aprovado as experiências com animais.
1. colheita de órgãos de animais
- Sacrifica os ratos por deslocamento cervical.
- Coloque as glândulas do Timo e baços em frascos de 20ml cintilação ou tubos de 15ml cónico preenchidos com 5 mL de Hanks´ equilibrada solução salina (HBSS). Lugar PDLNs em micro tubos de 1,5 mL preenchidos com 1 mL de RPMI 1640. Use todo Timo e baço e todos os PDLNs.
Nota: Os órgãos devem ser mantidos no gelo durante todo o procedimento e o investigador deve tentar ser rápido ao preparar suspensões de célula única, especialmente ao manusear o tecido tímico, desde que as células imunes do Timo podem ser rapidamente degradadas em altas temperaturas.
2. única célula isolamento do Timo e baço
- Aperte completamente o Timo e o baço com um par de pinças para liberar as células do sistema imunológico. Descarte a restante cápsula do Timo e baço.
- Transferi a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar 433 x g por 5 min a 4 ° C, para formar um pellet. Desprezar o sobrenadante.
- Para lisar os glóbulos vermelhos, Ressuspender a suspensão de eritrócitos em 5 mL de 0,2 M NH4Cl e incubar a temperatura ambiente por 10 min. inverter os tubos de cabeça para baixo suavemente cada 2 min. Adicione 5 mL de HBSS, no final da incubação, para parar a Lise.
- Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em cerca de 5 mL de HBSS. Encha os tubos com HBSS.
- Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em cerca de 5 mL de HBSS. Encha os tubos com HBSS.
- Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 5 mL de HBSS por Timo e 10 mL para o baço.
- Transferência de 1 mL de suspensão de células do Timo e 500 µ l de suspensão de célula esplênica para 5 mL redonda tubos com tampas de filtro da célula. Aplica a suspensão de células para as tampas de filtro de célula.
Nota: Uma malha de nylon de 35 µm é incorporada a tampa. Cerca de 5 milhões de células foram coletadas em cada tubo.
3. única célula isolamento de PDLN
- Coloque uma malha de metal estéril 250 µm sobre um tubo cônico de 15 mL em um rack. Enxágue a malha com 1 mL de RPMI.
- Transferir os gânglios linfáticos para o engranzamento do metal e triturá-los através da malha usando um par de pinças. Aplique 1 mL de RPMI o engranzamento do metal para lavar as células dentro do tubo. Repetir 3 vezes mais e remover a malha.
- Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em cerca de 5 mL de RPMI. Encha os tubos com RPMI.
- Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em cerca de 5 mL de RPMI. Encha os tubos com RPMI.
- Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 2 mL de RPMI. Transferência de 2 mL de suspensão de células para 5 mL redonda tubos com tampas de filtro da célula. Aplica a suspensão de células para as tampas de filtro de célula.
4. fluxo Cytometry
- Centrifugar as suspensões de células do timo, PDLN e baço a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Manchar as células com as seguintes anticorpos superfície em 100 µ l de buffer (buffer de FACS) a coloração de citometria de fluxo: 0,75 anticorpo µ g/100 µ l CD4 FITC-conjugados, 0,60 anticorpo CD8 APC-H7-conjugados de µ g/100 µ l, 0,30 µ g/100 µ l CD25 PE-conjugado anticorpo, 5 µ l (01:20) APC-conjugado anticorpo Nrp1. Incube os tubos no gelo por 40 min.
- Adicione 200 µ l de tampão de FACS a cada tubo. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Repita mais uma vez.
- Corrigir e permeabilize as células por resuspending o centrifugado em 500 µ l de tampão de fixação de permeabilização (PFB).
Nota: PFB é preparada pela mistura de 1 parte de fixação/permeabilizacao se concentrar com 3 peças de fixação/permeabilização diluente. - Manter os tubos na geladeira a 4 ° C durante a noite.
Nota: Uma incubação de 1 h também funciona. - Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 500 µ l de tampão de lavagem permeabilização (PWB). Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
Nota: PWB é preparado pela diluição permeabilização Buffer (10x) a 01:10 em água destilada. - Manchar as células com as seguintes anticorpos intracelulares em 100 µ l do PWB: 0,30 anticorpo µ g/100 µ l Foxp3 PE-Cy7-conjugado, anticorpo conjugado PacificBlue Helios de 4 µ l (01:25). Incube os tubos no gelo por 1h.
- Adicione 500 µ l do PWB para cada tubo. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 500 µ l do PWB. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 300 µ l de tampão de FACS.
- Analise as células em um citômetro de fluxo.
- As células única baseadas na dispersão-área lateral, altura e largura e Forward Scatter-área, altura e largura da porta. Execute 1 milhão eventos para análise.
- Exportar os arquivos FCS de experiências e analisá-los usando um software de analisador de citometria de fluxo.
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Representative Results
Para investigar a expressão da Nrp1 e Helios em células tTreg e pTreg, nós preparados única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD de normoglycemic e manchadas-los com os marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios e Nrp1 para fluxo cytometric análise. Os resultados foram analisados conforme o representante gating estratégias (Figura 1). Descobrimos que a proporção de células de Helios+ entre CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células foi maior que a de Nrp1+ células em todos os três órgãos (Figura 2A). Mais de 80% das células Treg no timo expressou Helios, que era maior do que no PDLN e o baço (Figura 2A). A proporção de Nrp1+ células entre células Treg Helios+ foi maior no PDLN do que os do Timo e o baço (Figura 2B). A maioria dos Nrp1+ Treg também células expressa Helios e as proporções de células Helios+ entre Nrp1+Treg células no timo e baço foram maiores do que o PDLN (Figura 2). Juntos, esses resultados indicam que o Helios é um melhor marcador para detectar células tTreg do que Nrp1.
Figura 1: representante gating estratégias para citometria de fluxo. As células única ao vivo foram bloqueadas baseado no FSC e SSC. Então, as células foram ainda mais fechadas para expressão de CD4 e CD8. CD4+CD8– células foram ainda mais fechadas para a expressão de CD25. Em seguida, CD4+CD8–CD25+ células foram bloqueadas para a expressão de Foxp3. CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células foram bloqueadas para expressão Nrp1 ou Helios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A expressão de Nrp1 e Helios nas células Treg no timo, baço e PDLN. Quatro 8 semanas sacrificaram-se ratos do assentimento não-diabéticos. Células únicas foram preparadas a partir de glândulas do timo, PDLNs e baços. As células foram então coradas com fluorocromo conjugado anticorpos para análise de fluxo cytometric. (A) as percentagens de Nrp1+ + de Helios células entre CD4 e e+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células. (B) as percentagens de Nrp1+ células entre células Treg Helios+ . (C) as percentagens de Helios+ células entre Nrp1+ Treg células. Os resultados são expressos como média ± SEM. * * *p < 0,001. One-Way ANOVA seguido de comparações múltiplas de Tukey (A, B e C) e realizaram-se testes t não pareados (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, nós isolado única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD e investigou a expressão de Helios e Nrp1 em CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células usando citometria de fluxo. No presente estudo, foram utilizados camundongos NOD, que é um modelo murino de diabetes tipo 1. Em um estudo anterior, usamos as estirpes de tipo selvagem do mouse CD-1 e camundongos C57BL/6 para investigar se o Helios ou Nrp1 é um melhor marcador para distinguir células tTreg de células pTreg. Nesse estudo, usamos um protocolo similar para determinar os subconjuntos de células Treg no ingênuo ratos9. Nós achamos que o Helios é um melhor marcador neste contexto. Portanto, aqui usamos ratos do assentimento de normoglycemic para confirmar nossa constatação anterior neste modelo e constatou que os resultados foram consistentes com nossos anteriores resultados10. Este protocolo fornece uma forma eficiente de preparar células únicas e posteriormente usá-los para análise de fluxo cytometric ainda econômica. Existem vários protocolos publicados no qual células únicas são preparadas com uma automática dissociador11,12. Em vez de usar um dissociador, apertando as glândulas do Timo e baços manualmente e descartando a restante cápsula, podemos evitar a presença de tecido fibroso na suspensão de célula e certifique-se de que a suspensão celular é composta principalmente de vermelho e células do sistema imunológico células do sangue. Então fazíamos NH4Cl para lisar células vermelhas do sangue. A duração da lise pode ser estendida por mais alguns minutos, se os órgãos são maiores que o tamanho normal. No entanto, a duração de Lise não deve abranger demais, caso contrário as células imunes, também, ser lysed. É importante deixar a suspensão de eritrócitos a passar por uma tampa com filtro de célula (ou outros filtros de célula equivalente), para evitar problemas de entupimento durante citometria de fluxo.
Trabalhar no escuro é recomendado quando se trabalha com fluorocromo conjugado anticorpos para evitar maior exposição à luz. Nós incubar as células no gelo para coloracao intracelular e extracelular. A incubação também pode ser feita à temperatura ambiente para permitir uma ligação mais rápida de anticorpos, mas há um risco de vinculação inespecíficos.
Alguns marcadores intracelulares exigem um grande número de células para dar bons sinais em citometria de fluxo. Dado o pequeno tamanho do PDLNs, moagem-los em uma malha de metal requer mais cuidados para permitir uma liberação máxima das células do sistema imunológico. Coletar mais PDLNs também é uma maneira de aumentar o número de células. Outra limitação deste protocolo é que as células são fixos e permeabilizadas para análise de fluxo cytometric, assim não podem ser utilizados para estudos funcionais subsequentes. Separação magnética é uma opção para permitir estudos funcionais se apenas marcadores de superfície são de interesse.
Este protocolo foi aplicado em outros modelos de rato de auto-imunidade e câncer13,14. Preparação de célula única é uma técnica básica, mas útil para determinar as características de células do sistema imunológico em diferentes órgãos imunes. Usando esse método para preparação única célula pode causar necrose, que pode resultar na diminuição do número total de células. A sobreposição espectral de citometria de fluxo tradicional limita o número de marcadores que podem ser detectados ao mesmo tempo. Portanto, vários painéis e grandes números de células são necessários para adquirir um perfil geral imune. No futuro, isto pode ser superado pelo desenvolvimento de citometria de massa.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O presente estudo foi apoiado financeiramente pelo Conselho de pesquisa Sueco, EXODIAB, Fundação sueca de Diabetes, fundo de Diabetes criança sueca, SEB Diabetesfonden e O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Os autores também queria obrigado Per-Ola Carlsson e Stellan Sandler para seus suportes e discussões.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
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