Summary
Ici, nous présentons un protocole visant à préparer les cellules individuelles de thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate afin d’étudier ces cellules à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce protocole a été utilisé pour la détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs utilisant l’écoulement cytometry.
Abstract
Notre système immunitaire se compose d’un nombre et une variété de cellules immunitaires, dont les lymphocytes T régulateurs de cellules (Treg). Les cellules Treg peuvent être divisés en deux sous-ensembles, les cellules Treg (tTreg) dérivées du thymus et accessoirement induite par les cellules Treg (pTreg). Elles sont présentes dans les différents organes de notre corps et se distingués par des marqueurs spécifiques, tels que Hélios et Neuropiline 1. Il a été signalé que les cellules tTreg sont fonctionnellement plus répressive que les cellules pTreg. Par conséquent, il est important de déterminer la proportion des cellules tTreg et pTreg dans les enquêtes sur les populations de cellules hétérogènes. Ici, nous avons recueilli glandes du thymus, ganglions lymphatiques de drainage pancréatiques et rate de normoglycémiques souris diabétiques non obèses pour distinguer les cellules de tTreg de pTreg des cellules à l’aide de cytométrie en flux. Nous avons préparé manuellement des suspensions de cellules simples de ces organes. Fluorochrome conjuguées de surface CD4, CD8, CD25 et Neuropiline 1 anticorps ont été utilisés pour colorer les cellules. Ils étaient conservés dans le réfrigérateur pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été colorées avec les anticorps de Foxp3 et Helios intracellulaires fluorochrome conjugué. Ces marqueurs ont été utilisées pour caractériser les deux sous-ensembles de cellules Treg. Ce protocole montre un moyen simple mais pratique pour préparer des cellules individuelles de thymus murin, drainage des ganglions lymphatiques et la rate pancréas et utilisez-les pour cytométrie ultérieures.
Introduction
Les lymphocytes T (Treg) régulateurs sont critiques pour l’homéostasie du système immunitaire. Les cellules Treg sont définies par l’expression des antigènes de surface CD4 et CD25 et le facteur de transcription forkhead boîte P3 (Foxp3)1,2,3. Tout d’abord, Sakaguchi et coll. ont montré que CD25 est constitutivement exprimé sur les cellules T suppresseur souris4, qui prévoit une observation pionnier pour l’identification des cellules Treg humaines. Les cellules Treg jouent un rôle central dans la tolérance immunitaire, en exerçant une capacité suppressive par l’intermédiaire de divers mécanismes, y compris une cytolyse par le biais de la sécrétion de granzymes pour induire l’apoptose, la consommation de cytokine et l’inhibition par le biais de l’expression des cytotoxiques Lymphocytes T antigène 45. En outre, ils peuvent sécréter des cytokines inhibitrices comme transformant le facteur de croissance bêta (TGF-β), interleukine-10 (IL-10) et IL-355. Les cellules Treg peuvent naturellement être dérivés du thymus, auquel cas ils sont désignés les cellules Treg (tTreg) dérivées du thymus, ou ils peuvent être induites dans les organes périphériques, dans ce cas sont appelés périphériquement induite par les cellules Treg (pTreg).
PTreg cellules6et Helios, un membre de la famille de facteur de transcription Ikaros, a été signalé comme un marqueur pour distinguer les cellules tTreg. Plus tard, deux autres groupes ont déclaré que Neuropiline 1 (Nrp1), un récepteur III sémaphorines, pourrait servir de marqueur de surface pour tTreg cellules sous certaines conditions,7,8. Néanmoins, Singh et coll. ont montré que les Helios est un meilleur marqueur dans ce contexte de souris naïves9.
Les sous-ensembles de cellules Treg jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie du système immunitaire et dans la protection contre l’auto-immunité et l’infection. Par conséquent, il est important de déterminer le nombre et la proportion de ces populations dans les tissus lymphoïdes et non lymphoïdes. Pour y parvenir, il faut préparer des suspensions de cellules simples de ces organes. Un certain nombre de protocoles ont été décrit ou utilisé dans des études antérieures. Principalement, dissociators automatiques ont été utilisées dans des rapports publiés antérieurement10,11. L’utilisation de dissociators automatiques est pratique et gain de temps, mais c’est une procédure coûteuse. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode manuelle pour préparer des suspensions cellulaires unique des glandes du thymus murins, les ganglions lymphatiques de drainage pancréatiques (PDLNs) et les rates de normoglycémiques non-obèses diabétiques (NOD) souris et isolé des cellules individuelles de ces organes. Cette méthode a été utilisée dans nos études précédentes et nous avons trouvé que la méthode manuelle pour préparer la suspension cellulaire unique est aussi efficace que dissociator automatique méthode9,12,13,14. En outre, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour déterminer les proportions de CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules et les sous-ensembles de Treg cellules tTreg et pTreg. Les cellules tTreg et pTreg ont été distingués au moyen de Helios et Nrp1 comme marqueurs de cellule tTreg. Par conséquent, nos résultats indiquent que la méthode manuelle pour préparer les cellules individuelles ne fonctionne efficacement et les suspensions préparée seule cellule permet davantage d’études utilisant l’écoulement cytometry.
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Protocol
Le comité local d’éthique animale à l’Université d’Uppsala a approuvé l’expérimentation animale.
1. récolte d’organes d’animaux
- Sacrifier les souris par dislocation cervicale.
- Placez du thymus glandes et rate en flacons de 20 mL à scintillation ou tubes coniques 15 mL contenant 5 mL de Hanks´ équilibré de solution saline (HBSS). PDLNs lieu de micro-tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de milieu RPMI 1640. Utilisez le thymus entier et rate et tous les PDLNs.
Remarque : Organes devraient être gardés sur glace tout au long de la procédure et l’enquêteur doit essayer d’être rapide lors de la préparation des suspensions de cellules simples, surtout lors de la manipulation des tissus thymique puisque les cellules immunitaires du thymus peuvent être rapidement dégradées à des températures élevées.
2. seule cellule isolement du Thymus et la rate
- Serrez soigneusement le thymus et la rate avec une paire de pincettes pour libérer les cellules immunitaires. Jeter la capsule du thymus et de la rate restante.
- Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C pour former une boulette. Jeter le surnageant.
- Pour lyser les globules rouges, les remettre en suspension la suspension cellulaire dans 5 mL de 0,2 M NH4Cl et incuber à température ambiante pendant 10 min. inverser les tubes envers doucement chaque 2 min. ajouter 5 mL de HBSS à la fin de l’incubation pour arrêter la lyse.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de HBSS. Remplissez les tubes avec HBSS.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de HBSS. Remplissez les tubes avec HBSS.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 5 mL de HBSS pour thymus et 10 mL pour la rate.
- Transférer 1 mL de la suspension de cellules thymiques et 500 µL de la suspension de cellules spléniques à 5 mL autour des tubes du bas avec des bouchons de tamis cellulaire. Appliquer la suspension cellulaire sur les bouchons de tamis cellulaire.
Remarque : Une maille en nylon de 35 µm est incorporée dans le bouchon. Environ 5 millions de cellules ont été prélevés dans chaque tube.
3. seule cellule isolement de PDLN
- Placer un grillage métallique de 250 µm stérile sur un tube conique de 15 mL dans un rack. Rincer la maille avec 1 mL de milieu RPMI.
- Transférer les ganglions lymphatiques dans la maille en métal et moudre à travers les mailles à l’aide d’une paire de pincettes. Appliquer 1 mL de milieu RPMI sur le treillis métallique afin d’éliminer les cellules dans le tube. Répéter 3 fois plus et retirer le maillage.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de RPMI. Remplissez les tubes avec RPMI.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans environ 5 mL de RPMI. Remplissez les tubes avec RPMI.
- Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 2 mL de RPMI. Transfert 2 mL de la suspension cellulaire à 5 mL autour des tubes du bas avec des bouchons de tamis cellulaire. Appliquer la suspension cellulaire sur les bouchons de tamis cellulaire.
4. cytométrie en flux
- Centrifuger les suspensions de cellules du thymus, PDLN et la rate à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Colorer les cellules avec les anticorps de surface suivants dans 100 µL de cytométrie en souillant la mémoire tampon (buffer FACS) : 0,75 anticorps µg/100 µL conjugué FITC CD4, de 0,60 µg/100 µL CD8 APC-H7-conjugués anticorps, anticorps 0,30 µg/100 µL conjugué PE CD25, 5 µL (01:20) APC-conjugués anticorps Nrp1. Incuber les tubes sur la glace pendant 40 min.
- Ajouter 200 µL de tampon de FACS dans chaque tube. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Répéter une fois de plus.
- Difficulté et permeabilize les cellules par resuspendant le culot cellulaire dans 500 µL de tampon de Fixation perméabilisation (PFB).
Remarque : PFB est préparé en mélangeant 1 partie de Fixation/perméabilisation concentré avec 3 parties de Fixation/perméabilisation diluant. - Garder les tubes au réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit.
Remarque : Une incubation de 1 h fonctionne également. - Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon de lavage perméabilisation (PTB). Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
Remarque : PWB est préparé en diluant la perméabilisation tampon (10 x) à 01:10 dans de l’eau distillée. - Colorer les cellules avec les anticorps intracellulaires suivants dans 100 µL de PWB : 0,30 anticorps µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-conjugués, anticorps conjugué PacificBlue Helios 4 µL (01:25). Incuber les tubes sur la glace pendant 1 h.
- Ajouter 500 µL de PWB dans chaque tube. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 500 µL de PWB. Centrifuger les tubes à 433 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 300 µL de tampon de FACS.
- Analyser les cellules sur un cytomètre en flux.
- Porte les cellules unique basés sur Scatter-zone latérale, hauteur et largeur et Forward Scatter-zone, hauteur et largeur. Organiser des événements 1 million pour l’analyse.
- Exporter les fichiers FCS d’expériences et les analyser à l’aide d’un logiciel d’analyseur de cytométrie en flux.
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Representative Results
Pour étudier l’expression des Nrp1 et Helios sur les cellules tTreg et pTreg, nous avons préparé des cellules individuelles de glandes thymiques, PDLNs et la rate des souris NOD normoglycémiques et eux colorées avec les marqueurs de cellules Treg CD4, CD25 et Foxp3, Helios Nrp1 pour la cytométrie en flux analyse. Les résultats ont été analysés comme le montre le représentant gating stratégies (Figure 1). Nous avons constaté que la proportion de cellules Helios+ parmi les CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules était supérieur à celui de Nrp1+ des cellules dans les trois organes (Figure 2 a). Plus de 80 % des cellules Treg dans le thymus exprimé Helios, qui était plus élevé que dans la PDLN et de la rate (Figure 2 a). La proportion des Nrp1+ cellules parmi les cellules Treg Helios+ était plus élevée chez le PDLN que celles dans le thymus et la rate (Figure 2 b). La majorité des Nrp1+ Treg cellules également exprimée Helios et les proportions des cellules Helios+ entre Nrp1+Treg cellules dans le thymus et la rate était plus élevée que dans le PDLN (Figure 2). Ensemble, ces résultats indiquent que les Helios est un meilleur marqueur pour détecter les cellules de tTreg que Nrp1.
Figure 1 : représentant gating stratégies pour cytométrie. Les cellules vivantes unique ont été bloquées issu des FSC et SSC. Puis, cellules étaient encore bloquées pour l’expression de CD4 et CD8. CD4+CD8– cellules étaient encore bloquées pour l’expression de CD25. Ensuite, CD4+CD8–CD25+ cellules ont été bloquées pour expression Foxp3. CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules ont été bloquées pour expression Nrp1 ou Helios. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : l’expression de Nrp1 et Helios dans le thymus, la PDLN et la rate, les cellules Treg. Quatre 8 semaines souris NOD non diabétiques ont été sacrifiés. Cellules individuelles ont été préparés des glandes du thymus, PDLNs et rate. Les cellules sont ensuite colorées avec les anticorps de fluorochrome conjugué pour cytométrie. (A) les pourcentages de Nrp1+ et parmi les CD4 des cellules de Helios+ +CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules. (B) les pourcentages de Nrp1 des cellules chez les cellules Treg Helios+ + . (C) les pourcentages de Helios+ cellules parmi Nrp1+ Treg cellules. Les résultats sont exprimés comme moyen ± SEM. ***p < 0,001. ANOVA à suivie de comparaisons multiples de Tukey (A, B et C) et t-tests appariés (A) ont été réalisés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons isolé des cellules individuelles de glandes thymiques, des PDLNs et des rates de souris NOD et examiné l’expression d’Hélios et Nrp1 CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellules à l’aide de cytométrie en flux. Dans la présente étude, des souris NOD ont été utilisés, qui est un modèle murin de diabète de type 1. Dans une étude précédente, nous avons utilisé le type sauvage souches de souris CD-1 et les souris C57BL/6 pour étudier si Helios ou Nrp1 est un meilleur marqueur pour distinguer les cellules tTreg des cellules pTreg. Dans cette étude, nous utilisons un protocole similaire pour déterminer les sous-ensembles de cellules Treg naïf souris9. Nous avons trouvé que Helios est un meilleur marqueur dans ce contexte. Par conséquent, dans les présentes, nous avons utilisé souris NOD normoglycémiques pour confirmer nos conclusions antérieures dans ce modèle et a constaté que les résultats étaient conformes à nos précédents résultats10. Ce protocole fournit un moyen efficace et économique encore à préparer les cellules individuelles et de les utiliser ultérieurement pour cytométrie. Il existe plusieurs protocoles publiés dans lequel les cellules individuelles sont préparés en utilisant un dissociator automatique11,12. Au lieu d’utiliser un dissociator, en serrant les glandes du thymus et la rate manuellement et en jetant la capsule restante, nous pouvons éviter la présence de tissu fibreux dans la suspension cellulaire et veillez à ce que la suspension cellulaire est principalement composée de rouge et de cellules immunitaires cellules sanguines. Nous avons ensuite utilisé NH4Cl à lyser les globules rouges. La durée de la lyse peut être prolongée pendant plus de quelques minutes si les organes sont plus grandes que la taille normale. Cependant, la durée de lyse ne devrait pas être étendue trop, sinon les cellules immunitaires seront également être lysées. Il est important de laisser la suspension cellulaire à passer par un cap avec la crépine de la cellule (ou d’autres filtres de cellules équivalentes), à prévenir les problèmes de colmatage lors de cytométrie en flux.
Travailler dans l’obscurité est recommandé lorsque vous travaillez avec des anticorps fluorochrome conjugué pour éviter une exposition plus longue à la lumière. Nous incuber les cellules sur la glace pour une coloration extracellulaires et intracellulaires. L’incubation peut aussi se faire à température ambiante pour permettre une liaison plus rapide des anticorps, mais il y a un risque de liaison non-spécifique.
Certains marqueurs intracellulaires nécessitent un grand nombre de cellules de donner des signaux positifs en cytométrie en flux. Étant donné la petite taille de PDLNs, leur rectification sur un treillis métallique nécessite plus de soins pour permettre une libération maximale de cellules immunitaires. Collecte de PDLNs plus, c’est aussi un moyen d’augmenter le nombre de cellules. Une autre limitation du présent protocole est que les cellules sont fixées et perméabilisées pour analyse en cytométrie en flux, donc elles ne peuvent servir pour des études fonctionnelles ultérieures. Tri magnétique est une option pour permettre des études fonctionnelles, si seulement les marqueurs de surface présentent un intérêt.
Ce protocole a été appliqué dans d’autres modèles de souris de l’autoimmunité et cancer13,14. Préparation de la cellule est une technique basique mais utile pour déterminer les caractéristiques des cellules immunitaires dans les différents organes du système immunitaire. Utilisant cette méthode pour la préparation de la cellule unique peut provoquer une nécrose, qui peut entraîner une diminution du nombre total de cellules. Le chevauchement spectral de cytométrie en flux traditionnel limite le nombre de marqueurs qui peuvent être détectés en même temps. Par conséquent, plusieurs panneaux et un grand nombre de cellules est tenu d’acquérir un profil immunitaire dans l’ensemble. À l’avenir, cela peut être surmonté par le développement de masse cytométrie en flux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La présente étude a été soutenue financièrement par le Conseil de recherche suédois, EXODIAB, la fondation suédoise de diabète, le fonds suédois pour les diabète enfant, SEB Diabetesfonden et O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Auteurs aimeraient aussi Merci Per-Ola Carlsson et Stellan Sandler pour leurs supports et leurs discussions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
