Summary
在此, 我们提出了一个方案, 以准备单细胞从小鼠胸腺, 胰腺引流淋巴结和脾脏, 进一步研究这些细胞使用流式细胞仪。此外, 该协议还用于使用流式细胞仪确定调节 t 细胞的子集。
Abstract
我们的免疫系统由多种免疫细胞组成, 包括调节 t 细胞 (treg)。树状细胞可分为胸腺衍生的特雷格 (treg) 细胞和外周诱导的 treg (treg) 细胞。它们存在于我们身体的不同器官中, 可以通过特定的标记来区分, 如 helios 和 neuspilin 1。据报道, ttreg 细胞在功能上比 ptreg 细胞更具有抑制作用。因此, 在研究异质细胞群时, 确定 ttreg 和 ptreg 细胞的比例是很重要的。在此, 我们收集胸腺腺体, 胰腺引流淋巴结和脾脏从正常血糖非肥胖糖尿病小鼠, 以区分 ttreg 细胞和皮纹细胞流式细胞检查。我们手动准备了这些器官的单个细胞悬浮液。采用氟铬共轭表面 cd4、cd8、cd25 和神经皮素1抗体对细胞进行染色。他们被关押在冰箱里过夜。第二天, 细胞被污染的氟铬共轭细胞内 fffp3 和 helios 抗体。这些标记被用来描述特雷格细胞的两个子集。该方案演示了一种简单而实用的方法来制备来自小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏的单细胞, 并将其用于随后的流式细胞仪分析。
Introduction
调节 t (treg) 细胞对免疫系统的稳态是至关重要的。树状细胞是由表面抗原 cd4 和 cd25 的表达和转录因子叉头盒 p3 (foxp3)1,2,3的表达定义的。sakaguchi 等人首先表明, cd25 在小鼠4的 t 抑制细胞上有本构表达, 为人类树状细胞的鉴定提供了开拓性的观察。树状细胞在免疫耐受中发挥着核心作用, 通过各种机制施加抑制能力, 包括通过分泌粒酶进行细胞分裂, 诱导细胞凋亡, 细胞因子消耗和抑制通过细胞毒性的表达t 淋巴细胞抗原 45。此外, 它们还能分泌抑制细胞因子, 如转化生长因子β (tgf-β)、白细胞介素-10 (il-10) 和 il-355。树状细胞可以自然地从胸腺中提取, 在这种情况下, 它们被指定为胸腺衍生的 treg (treg) 细胞, 或者它们可以在外周器官中诱导, 在这种情况下被称为外周诱导的 treg (ptreg) 细胞。
helios 是 icaros 转录因子家族的成员, 据报道, 他是区分 ttreg 细胞和 ptreg 细胞6的标志。后来, 另外两个组报告说, 神经皮素 1 (nrp1), 一个信号素 iii 受体, 可以作为 ttreg 细胞的表面标记在一定条件下7,8。然而, singh 等人已经表明, 在这种情况下, helios 是一个更好的标记在天真的老鼠9。
特雷格细胞的亚群在维持免疫系统的稳态和防止自身免疫和感染方面发挥着关键作用。因此, 重要的是要确定这些人群在淋巴组织和非淋巴组织中的数量和比例。要做到这一点, 就必须准备从这些器官中获得单细胞悬浮液。在以前的研究中描述或使用了一些协议。主要是在以前发表的报告10、11 中使用了自动分离器。使用自动解拿是方便和节省时间, 但它是一个昂贵的程序。因此, 我们使用人工方法制备单细胞悬浮液从小鼠胸腺, 胰腺引流淋巴结 (pdln) 和脾脏从正常血糖非肥胖糖尿病 (nod) 小鼠, 以及从这些器官孤立的单个细胞。该方法已在以往的研究中得到应用, 我们发现人工制备单细胞悬浮液的方法与自动分离器方法9、12、13、14一样有效。此外, 我们使用流式细胞仪来确定 cd4+cd8-cd25 + fffp3+ treg 细胞的比例以及 treg 细胞 ttreg 和 treg 细胞的子集.利用 helios 和 nrp1 作为 ttreg 细胞的标记, 对 ttreg 和 treg 细胞进行了区分。因此, 我们的研究结果表明, 制备单细胞的人工方法确实有效地工作, 制备的单细胞悬浮液可进一步用于流式细胞仪的研究。
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Protocol
乌普萨拉大学当地动物伦理委员会批准了这些动物实验。
1. 从动物身上收集器官
- 用颈椎脱位来牺牲小鼠。
- 将胸腺腺体和脾脏放置在20毫升闪烁小瓶或15毫升的锥形管中, 其中填充5毫升的 hanks ' s 平衡盐溶液 (hbss)。将 pdln 放入充满 1 ml rpmi 1640 的 1.5 ml 微管中。使用整个胸腺和脾脏, 以及所有的 pdln。
请注意:器官应保持在冰上整个过程中, 调查人员应尽量快速准备单个细胞悬浮液, 特别是在处理胸腺组织, 因为胸腺免疫细胞可以在高温下迅速退化。
2. 胸腺和脾脏的单细胞分离
- 用一双推子彻底挤压胸腺和脾脏, 释放免疫细胞。丢弃剩余的胸腺和脾胶囊。
- 在433下, 将细胞悬浮液转移到 433 x g 的15毫升锥形管和离心机中 5分钟, 形成颗粒。放弃上清液。
- 为了使红细胞裂解, 在 0.2 mnh4 cl的5 毫升中重新悬浮细胞悬浮液, 并在室温下孵育 10分钟. 每2分钟轻轻倒置一次管, 在孵育结束时加入5毫升的 hbss 以阻止裂解。
- 在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在 hbss 约5毫升的情况下对细胞颗粒进行再利用。用 hbss 填充试管。
- 在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在 hbss 约5毫升的情况下对细胞颗粒进行再利用。用 hbss 填充试管。
- 在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在 hbss 5 毫升和脾脏10毫升中重新选择细胞颗粒。
- 将胸腺细胞悬浮液的1毫升和脾脏细胞悬浮液的500μl 转移到5毫升的圆底管上, 并带有细胞过滤器盖。将细胞悬浮液涂在细胞过滤器盖上。
请注意:在瓶盖中加入了35μm 的尼龙网。每管收集大约500万至 1 000万个细胞。
3. pdln 中的单细胞分离
- 将无菌250微米的金属网放在15毫升锥形管的机架上。用 rpmi 的1毫升冲洗网格。
- 将淋巴结转移到金属网中, 并使用一对推子将其通过金属网进行研磨。在金属网上涂1毫升 rpmi, 将细胞冲洗到试管中。再重复 3次, 然后取出网格。
- 在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在 rpmi 约5毫升的情况下重新使用细胞颗粒。用 rpmi 填充管道。
- 在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在 rpmi 约5毫升的情况下重新使用细胞颗粒。用 rpmi 填充管道。
- 在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在 rpmi 的2毫升中重新使用细胞颗粒。将细胞悬浮液的2毫升转移到带有电池过滤器盖的5毫升圆底管。将细胞悬浮液涂在细胞过滤器盖上。
4. 流式细胞仪
- 在433条件下, 以 433 x g 离心胸腺、pdln 和脾脏的细胞悬浮液5分钟。放弃上清液。
- 在100μl 流式细胞仪染色缓冲液 (facs 缓冲液) 中使用以下表面抗体对细胞进行染色: 0.75μg/100μl fitc 共轭 cd4 抗体, 0.60μg/100μl apc-h7 共轭 cd8 抗体, 0.30μg/100μl p-共轭 cd25 抗体, 5μl (1:20)apc 共轭 nrp1 抗体。在冰上加根40分钟。
- 在每个管中添加200μl 的流式细胞仪缓冲液。在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。再重复一次。
- 通过在500μl 的渗透固定缓冲 (pfb) 中重新悬浮细胞颗粒来固定和渗透细胞。
请注意:pfb 是通过将1份固定/渗透浓缩物与3个部分的固定-渗透稀释剂混合制备而制备的。 - 将冰箱中的管子保持在4°c 过夜。
请注意:1小时的孵化也是有效的。 - 在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在500μl 的渗透洗涤缓冲器 (pwb) 中重新填充细胞颗粒。在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
请注意:pwb 是通过在蒸馏水中稀释渗透不稳定不稳定不稳定不变 (10倍) 到1:10 制备的。 - 在100μl 的 pwb:0.30 g/100μl 聚-cy7 共轭 ffp3 抗体中使用以下细胞内抗体染色细胞, 4μl (1:25) 太平洋共联 helios 抗体。在冰上加根1小时的输卵管。
- 在每个管中加入500μl 的 pwb。在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在500μl 的 pwb 中重新填充细胞颗粒。在433条件下, 以 433 x g离心管5分钟。放弃上清液。
- 在 facs 缓冲液300μl 中重新填充细胞颗粒。
- 分析流式细胞仪上的细胞。
- 根据侧面散射区域、高度和宽度以及向前散射区域、高度和宽度来启动单个单元。运行100万个事件进行分析。
- 导出实验的 fcs 文件, 并使用流式细胞仪分析仪软件对其进行分析。
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Representative Results
目的探讨 nrp1 和 helios 在 ttreg 和 treg 细胞上的表达, 我们从正常血糖 nod 小鼠的胸腺腺体、pdln 和脾脏中制备了单个细胞, 并用特雷格细胞标记 cd4、cd25、fffp3、helios 和 nrp1 对它们进行流式细胞测定染色分析。如具有代表性的门控策略所示, 对结果进行了分析 (图 1)。我们发现, 在 cd4+cd8-cd8+ fffp3+ treg 细胞中, 所有三个器官中 helios+细胞的比例都高于 nrp1+细胞 (图 2a)。胸腺中80% 以上的树状细胞表达了 helios, 高于 pdln 和脾脏 (图 2a)。nrp1+细胞在 pdln中的比例高于胸腺和脾脏 (图 2b)。大多数 nrp1+ treg 细胞也表达了 helios, 胸腺和脾脏 nrp1+treg细胞中 helios + 细胞的比例高于 pdln (图 2c)。这些结果表明, 与 nrp1 相比, helios 是检测 ttreg 细胞的更好标记。
图 1: 流式细胞术的代表性门控策略.活单细胞是在 fsc 和 ssc 的基础上门控的。然后, 细胞进一步被门控为 cd4 和 cd8 表达。cd4+cd8细胞进一步被门控为 cd25 的表达。接下来, 为 foxp3表达的 cd4+ cd8-cd25+ 细胞门控。cd4+cd8-cd8-cd25 + foxp3+ treg 细胞被门控为 nrp1 或 helios 表达.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: nrp1 和 helios 在胸腺、pdln 和脾脏特雷格细胞中的表达.4个8周大的非糖尿病 nod 小鼠被牺牲。从胸腺腺体、pdln 和脾脏中制备了单细胞。然后用荧光铬共轭抗体对细胞进行染色, 以便进行流式细胞仪分析。(a) nrp1 + 和 helios+细胞在 cd4 + cd8-cd25 + fffp3 + treg 细胞中的百分比. (b) nrp1 + 细胞在 helios+ treg细胞中的百分比。(c) helios+细胞在 nrp1+ treg 细胞中的百分比。结果表示为手段±sem * ** p < 0.001。单向方差分析, 其次是图基的多重比较 (a、b 和 c) 和未配对 t 检验 (a)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在本研究中, 我们从 nod 小鼠胸腺、pdln 和脾脏中分离出单个细胞, 并利用流式细胞仪研究 cd4 + cd8-cd25 + Nrp1+treg 细胞中 helios 和 nrp1的表达.在本研究中, 使用了 nod 小鼠, 这是1型糖尿病的小鼠模型。在之前的一项研究中, 我们使用野生型小鼠株 cd-1 和 c57bl6 小鼠来研究 helios 或 nrp1 是否是区分 ttreg 细胞和 ptreg 细胞的更好标记。在这项研究中, 我们使用了类似的协议来确定天真的老鼠9中特雷格细胞的子集。我们发现, 在这种情况下, 赫利俄斯是一个更好的标记。因此, 在这里我们使用正常血糖 nod 小鼠来证实我们先前在这个模型中的发现, 并发现结果与我们之前的结果10一致。该协议提供了一种高效但经济的方法来制备单个细胞, 并随后将其用于流式细胞仪分析。有几个已发布的协议, 其中单个细胞是使用自动分离器11,12制备的。我们可以避免细胞悬浮液中存在纤维组织, 并确保细胞悬浮液主要由免疫细胞和红色组成, 而不是使用分离器, 通过手动挤压胸腺和脾脏, 丢弃剩余的胶囊, 并确保细胞悬浮液主要由免疫细胞和红色组成血细胞。然后我们用 nh4 cl 裂解红血球.如果器官大于正常大小, 裂解的持续时间可以再延长几分钟。然而, 裂解的持续时间不应该延长太多, 否则免疫细胞也会被裂解。重要的是要让细胞悬浮液通过一个盖与细胞过滤器 (或其他等效细胞过滤器), 以防止堵塞问题在流式细胞术中。
建议在黑暗中工作时使用氟铬共轭抗体, 以避免更长时间暴露在光线下。我们在冰上孵育细胞, 进行细胞外染色和细胞内染色。孵育也可以在室温下进行, 以便更快地结合抗体, 但存在不特异性结合的风险。
一些细胞内标记需要大量的细胞在流式细胞仪中提供良好的信号。考虑到 pdln 的体积小, 在金属网上研磨它们需要更多的注意, 以便最大限度地释放免疫细胞。收集更多的 pdln 也是增加单元格数量的一种方法。该协议的另一个局限性是, 细胞是固定的, 渗透流式细胞分析, 因此不能用于后续的功能研究。磁分选是一种选项, 允许功能研究, 如果只有表面标记的兴趣。
该协议已应用于其他小鼠自身免疫和癌症 13,14模型。单细胞制备是确定不同免疫器官免疫细胞特性的基本但有用的技术。使用这种方法制备单细胞可能会导致坏死, 从而减少细胞总数。传统流式细胞仪的光谱重叠限制了可同时检测到的标记的数量。因此, 需要几个面板和大量的细胞来获得一个整体的免疫轮廓。在未来, 这可以通过大规模细胞学的发展来克服。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究报告得到瑞典研究理事会、exodiab、瑞典糖尿病基金会、瑞典儿童糖尿病基金、seb diabetesfonden 和 o. e. och edla johansson vetenskapliga stiftelse 的资助。作者还要感谢 per-o拉·卡尔松和 stellan sandler 的支持和讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
