Immunology and Infection

Определение нормативных Т-клеток подмножеств в мышиных вилочковой железы, поджелудочной железы, дренаж лимфатических узлов и селезенки, с помощью проточной цитометрии

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/58848

Zhengkang Luo¹, Lina Thorvaldson¹, Martin Blixt¹, Kailash Singh¹

¹Department of Medical Cell Biology, Uppsala University

Summary

Здесь мы представляем протокол подготовить отдельные ячейки из мышиных вилочковой железы, поджелудочной дренаж лимфатических узлов и селезенки для дальнейшего изучения этих клеток с помощью проточной цитометрии. Кроме того этот протокол был использован для определения подмножества регулирующих Т-клеток с помощью проточной цитометрии.

Abstract

Наша иммунная система состоит из числа и разнообразия иммунных клеток, включая нормативные Т-клетки (Treg) клетки. TREG клетки можно разделить на два подмножества, тимуса производных Treg (tTreg) клеток и периферически индуцированных Treg (pTreg) клеток. Они присутствуют в различных органов нашего тела и можно отличить по конкретным маркеров, например Гелиос и Нейропилины 1. Сообщается, что tTreg клетки функционально более подавляющей, чем pTreg клетки. Таким образом важно определить долю tTreg и pTreg клеток при расследовании гетерогенных клеточных популяций. Здесь мы собрали тимуса желез, поджелудочной крылом лимфатических узлов и селезенки от normoglycemic-ожирением диабетических мышей, чтобы отличить tTreg клеток из pTreg клеток с помощью проточной цитометрии. Мы вручную подготовили одну ячейку суспензий от деятельности этих органов. Флюрохром конъюгированных поверхности CD4, CD8, CD25, и 1 Нейропилины антитела были использованы для запятнать клетки. Они хранились в холодильнике всю ночь. На следующий день клетки окрашивали флюрохром конъюгированных внутриклеточных Foxp3 и Гелиос антител. Эти маркеры использовались для характеризуют два подмножества Treg клеток. Этот протокол демонстрирует простой, но практический способ подготовить отдельные ячейки из мышиных вилочковой железы, поджелудочной дренаж лимфатических узлов и селезенки и использовать их для анализа гранулярных последующих потоков.

Introduction

Регуляторных клеток T (Treg) являются критическими для гомеостаза иммунной системы. TREG клетки определяются выражением поверхностных антигенов CD4 и CD25 и транскрипционным фактором forkhead поле P3 (Foxp3)¹^,²^,³. Сакагути et al. впервые показал, что CD25 выражается конститутивно на Т-супрессорной клетки мышей⁴, который предусматривает новаторские наблюдения для выявления клеток человека Treg. TREG клетки играют центральную роль в иммунной толерантности, оказав подавляющие способность через различные механизмы, включая цитолиза через секрецию granzymes навести apoptosis, цитокин потребления и ингибирование через выражение цитотоксических T-лимфоцитов антигеном 4⁵. Кроме того они могут выделяют ингибирующее цитокины такие преобразования фактор роста бета (TGF-β), интерлейкин-10 (IL-10) и Ил-35⁵. TREG клетки естественным образом могут быть получены из тимуса, в этом случае они обозначаются тимуса производных Treg (tTreg) клеток, или они могут быть вызваны в периферических органов в этом случае называются периферически индуцированных Treg (pTreg) клеток.

Helios, членом семьи фактор транскрипции Ikaros, было сообщено быть маркера для разграничения между tTreg клеток и pTreg клетки⁶. Позднее две другие группы сообщили, что Нейропилины 1 (Nrp1), semaphorin III-рецептор, может служить поверхности маркера для tTreg клеток при определенных условиях⁷^,⁸. Тем не менее Singh et al. показали, что Helios является маркер лучше в этом контексте в наивной мышей⁹.

Подмножества Treg клетки играют ключевую роль в поддержании гомеостаза иммунной системы и защиты от аутоиммунные заболевания и инфекции. Таким образом важно определить количество и долю этих групп населения в лимфоидных и не лимфоидной ткани. Для достижения этой цели, надо подготовить одну ячейку суспензий от деятельности этих органов. Ряд протоколов были описаны или используемых в ходе предыдущих исследований. Главным образом автоматическая Диссоциаторы были использованы в ранее опубликованных докладов¹⁰^,¹¹. Использование автоматического Диссоциаторы удобно и экономия времени, но она является дорогостоящей процедурой. Таким образом мы использовали ручной метод для подготовки единого клеточных суспензий из мышиных тимуса желез, поджелудочной крылом лимфатические узлы (PDLNs) и селезенки от normoglycemic-ожирением диабетических мышей (НОД) и изолированных клеток одного из этих органов. Этот метод был использован в наших предыдущих исследований, и мы обнаружили, что ручной метод для подготовки одну ячейку подвеска так эффективно, как автоматическая диссоциатором метод⁹^,¹²^,^,¹³¹⁴. Кроме того, мы использовали проточной цитометрии для определения соотношения CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg клетки и подмножества Treg клеток tTreg и pTreg клеток. TTreg и pTreg клетки были отделены с помощью Гелиос и Nrp1 как маркеры для tTreg клеток. Таким образом наши результаты показывают, что ручной метод для подготовки единого клетки работать эффективно и суспензий подготовленный одной ячейки могут в дальнейшем использоваться для исследования с использованием проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Комитет местных животных этики Уппсальского университета одобрил эксперименты на животных.

1. заготовка органов от животных

Пожертвуйте мышей шейки матки дислокации.
Место вилочковой железы железы и селезенки во флаконах сцинтилляционные 20 мл или 15 мл конические трубы заполнены с 5 мл Hanks´ сбалансированного солевого раствора (HBSS). Место PDLNs в 1,5 мл микро труб, заполненных с 1 мл раствора RPMI 1640. Используйте весь вилочковой железы и селезенки и все PDLNs.
Примечание: Органы должны храниться на льду на протяжении всей процедуры, и следователь должен стараться быть быстро при подготовке единого клеточных суспензий, особенно при обработке ткани тимуса, поскольку тимуса иммунные клетки могут быть быстро деградации при высоких температурах.

2. одну ячейку изоляции от вилочковой железы и селезенки

Тщательно выжмите с парой пинцетов выпустить иммунные клетки вилочковой железы и селезенки. Отменить оставшиеся капсула селезенки и вилочковой железы.
Суспензию клеток передавать 15 мл Конические трубки и центрифуги на 433 x g 5 минут при температуре 4 ° C сформировать лепешки. Выбросите супернатант.
Чтобы лизировать красных кровяных клеток, Ресуспензируйте суспензию клеток в 5 мл 0,2 М NH₄Cl и инкубации при комнатной температуре за 10 мин инвертировать трубы вниз осторожно каждые 2 мин добавить 5 мл HBSS в конце инкубации остановить lysis.
Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в приблизительно 5 мл HBSS. Заполните трубы с HBSS.
Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в приблизительно 5 мл HBSS. Заполните трубы с HBSS.
Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл HBSS тимуса и 10 мл для селезенки.
Передача 1 мл суспензии клеток тимуса и 500 мкл суспензии селезеночной клеток до 5 мл вокруг нижней трубы с ячейки сита шапки. Применить суспензию клеток к крышкам ситечко клеток.
Примечание: 35 мкм нейлоновая сетка включена в крышку. Приблизительно 5-10 миллионов клеток были собраны в каждой тюбике.

3. одной ячейки изоляции от PDLN

Место стерильным 250 мкм металлической сетки над 15 мл конические пробки в стойку. Промойте сетку с 1 мл раствора RPMI.
Передача на лимфатические узлы в металлической сетки и растереть их через сетку, используя пинцет. Примените 1 мл RPMI на металлические сетки для сброса клетки в трубу. Повторите 3 раза и удалить сетку.
Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в приблизительно 5 мл RPMI. Заполните трубы с RPMI.
Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в приблизительно 5 мл RPMI. Заполните трубы с RPMI.
Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл RPMI. Передача 2 мл суспензии клеток 5 мл вокруг нижней трубы с ячейки сита шапки. Применить суспензию клеток к крышкам ситечко клеток.

4. проточной цитометрии

Центрифуга для клеточных суспензий из тимуса, PDLN и селезенки на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Запятнать клетки с ниже поверхности антител в 100 мкл проточной цитометрии окрашивание (FACS буферу): 0,75 мкг/100 мкл CD4, FITC-конъюгированных антител, 0,60 мкг/100 мкл CD8 APC-H7-конъюгированных антител, 0.30 мкг/100 мкл CD25 PE-конъюгированных антител, 5 мкл (1:20) APC-конъюгированных антител Nrp1. Инкубируйте трубы на льду на 40 мин.
Добавьте 200 мкл буфера СУИМ в каждую пробирку. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант. Повторите еще раз.
Исправить и разрушения клеток, resuspending клетки Пелле в 500 мкл Permeabilization фиксации буфера (БМЗ).
Примечание: PFB готовят путем смешивания 1 часть фиксации/Permeabilization концентрат с 3-х частях разбавителя фиксации/Permeabilization.
Держите трубы в холодильнике при температуре 4 ° C на ночь.
Примечание: 1 ч инкубации также работает.
Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл буфера мытья Permeabilization (ПРБ). Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Примечание: PWB готовится путем разбавления Permeabilization буфера (10 x) до 1:10 в дистиллированной воде.
Запятнать клетки с следующих внутриклеточных антител в 100 мкл PWB: 0.30 мкг/100 мкл Foxp3 PE-Cy7-конъюгированных антител, антитело проспряганное PacificBlue Helios 4 мкл (1:25). Инкубируйте трубы на льду за 1 час.
Добавьте 500 мкл PWB каждой трубы. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл ПРБ. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
Ресуспензируйте Пелле клеток в 300 мкл буфера СУИМ.
Анализ на проточный цитометр ячейки.
Ворота одной ячейки, основанные на Scatter-Сиде, высота и ширина и вперед Scatter-площади, высоты и ширины. Запустите один миллион событий для анализа.
Экспортируйте файлы FCS экспериментов и анализировать их с помощью программного обеспечения цитометрии анализатор потока.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Исследовать выражение Nrp1 и Helios на tTreg и pTreg клетки, мы подготовили отдельные ячейки из тимуса желез, PDLNs и селезенки мышей КИВНУЛ normoglycemic и окрашивали маркеры Treg клеток CD4, CD25, Foxp3, Гелиос и Nrp1 для потока гранулярных анализ. Были проанализированы результаты, как показано в представитель стробирования стратегии (рис. 1). Мы обнаружили, что доля Helios⁺ клетки среди CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg клетки был выше, чем у Nrp1⁺ клеток во всех трех органах (рис. 2A). Более чем 80% клеток Treg в тимусе выразил Helios, которая была выше, чем в PDLN и селезенки (рис. 2A). Доля Nrp1⁺ клетки среди клеток Treg Helios⁺ была в PDLN выше, чем в вилочковой железы и селезенки (рис. 2B). Большинство Nrp1⁺ Treg клетки также выразил Гелиос и пропорции клеток Helios⁺ среди Nrp1⁺Treg клетки в вилочковой железы и селезенки были выше, чем в PDLN (рис. 2 c). Вместе эти результаты показывают, что Helios является лучше маркер, чтобы обнаружить, что клетки tTreg чем Nrp1.

Рисунок 1: представитель стробирования стратегии для проточной цитометрии. Один живой клетки были закрытого на основе FSC и SSC. Затем клетки были далее закрытого CD4 и CD8 выражения. CD4⁺CD8^– клетки были далее условного выражения CD25. Далее, CD4⁺CD8^–CD25⁺ клетки были условного выражения Foxp3. CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg клетки были воротами для Nrp1 или Helios выражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: выражение Nrp1 и Helios в Treg клетки тимуса, PDLN и селезенке. Четыре 8 недели старый не диабетиков NOD мышей были принесены в жертву. Отдельные клетки были подготовлены из тимуса желез, PDLNs и селезенки. Клетки окрашивали затем флюрохром конъюгированных антител для анализа гранулярных потока. (A) доля Nrp1⁺ и среди CD4-клеток Helios⁺ ⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg клетки. (B) проценты Nrp1⁺ клетки среди Treg Helios⁺ клеток. (C) проценты Helios⁺ клетки среди Nrp1⁺ Treg клетки. Результаты выражаются как средства ± SEM. ***p < 0,001. Односторонний дисперсионный анализ, последовали несколько сравнений в Тьюки (A, B и C) и непарных t тесты (A) были выполнены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании, мы изолированы единичных клеток железы тимуса, PDLNs и селезенки мышей КИВНУЛ и расследование выражение Гелиос и Nrp1 в CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg клеток с помощью проточной цитометрии. В настоящем исследовании были использованы NOD мышей, который является моделью мышиных диабета 1 типа. В предыдущем исследовании мы использовали мыши штаммов дикого типа CD-1 и мышей C57BL/6 расследовать ли Helios или Nrp1 — лучше маркер для разграничения tTreg клеток из pTreg клеток. В этом исследовании мы использовали аналогичный протокол для определения подмножества Treg клеток в наивной мышей⁹. Мы обнаружили, что Helios является маркер лучше в этом контексте. Таким образом здесь мы использовали normoglycemic КИВНУЛ мышей для подтверждения наших предыдущих вывод в этой модели и обнаружил, что результаты согласуются с наших предыдущих результатов¹⁰. Этот протокол обеспечивает эффективный, но экономичный способ подготовить отдельные ячейки и впоследствии использовать их для анализа потока гранулярных. Есть несколько опубликованных протоколов, в которых отдельные клетки готовятся с использованием автоматического диссоциатором¹¹^,¹². Вместо диссоциатором, сжимая вилочковой железы железы и селезенки вручную и отбрасывания оставшихся капсула, мы можем избежать присутствие фиброзной ткани в суспензию клеток и убедитесь, что суспензию клеток в основном состоит из иммунных клеток и красный клетки крови. Затем мы использовали NH₄Cl для лизируют красных кровяных клеток. Продолжительность лизис может быть продлено на несколько минут, если органы больше нормального размера. Однако лизис продолжительность не должен продлеваться слишком много, иначе иммунные клетки также будут лизированы. Важно позволить суспензию клеток пройти через шапку с ячейки фильтра (или других эквивалентных ячейки фильтры), для предотвращения проблем забивают в проточной цитометрии.

В потемках рекомендуется при работе с флюрохром конъюгированных антител, чтобы избежать длительного воздействия света. Мы инкубации клеток на льду для внеклеточные и внутриклеточных пятнать. Инкубации также может быть сделано при комнатной температуре, чтобы быстрее связывание антител, но есть риск неспецифических привязки.

Некоторых внутриклеточных маркеров требуется большое количество клеток, чтобы дать хорошие сигналы в проточной цитометрии. Учитывая небольшой размер PDLNs, шлифовка их на металлические сетки требует больше заботы, чтобы позволить максимального выхода иммунных клеток. Сбор более PDLNs способ также является увеличение количества клеток. Другое ограничение этого протокола, что зафиксированы и permeabilized для анализа потока гранулярных клеток, таким образом они не могут использоваться для последующего функциональных исследований. Магнитная Сортировка — это параметр, чтобы разрешить функциональные исследования, если только поверхностных маркеров представляют интерес.

Этот протокол был применен в других моделях мыши аутоиммунных заболеваний и рака¹³^,¹⁴. Подготовка одной клетки — это простые, но полезные метод для определения характеристик иммунных клеток в различных иммунных органов. Использование этого метода для приготовления одной ячейки может вызвать некроз, которая может привести к снижению общего числа клеток. Спектрального наложения традиционных проточной цитометрии ограничивает количество маркеров, которые могут быть обнаружены в то же время. Таким образом приобрести общей иммунной профиль требуются несколько панелей и большое количество клеток. В будущем это могут быть преодолены путем развития массового цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Настоящее исследование финансово поддержали Шведский исследовательский совет, EXODIAB, Шведский фонд диабета, Шведский фонд детского диабета, SEB Diabetesfonden и о.е. och Эдла Johanssons vetenskapliga stiftelse. Авторы хотели бы также Спасибо Пер-Ола Карлссон и Стеллан Sandler за их поддерживает и дискуссий.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOD mice			In-house breading
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH₄Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
Disposable scintillation vials	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analysis software	Inivai Technologies	Flowlogic