Summary
במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.
Abstract
המערכת החיסונית שלנו מורכב מספר ומגוון של תאים חיסוניים כולל הרגולציה ותאי T תאים (Treg). Treg תאים מתחלקים שתי קבוצות משנה, תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי ותאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה. הם נמצאים איברים שונים של הגוף שלנו, ניתן להבחין באמצעות סמנים ספציפיים, כגון הליוס ו- Neuropilin 1. בעבר דווח כי תאים tTreg הם באופן פונקציונלי יותר מדכא מאשר תאים pTreg. לכן, חשוב לקבוע את הפרופורציה של תאים הן tTreg והן pTreg, כאשר חוקרים אוכלוסיות הטרוגניות תא. במסמך זה, אספנו הרתי בלוטות לימפה המנקזים הלבלב, טחולים מ normoglycemic בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים להבחין tTreg תאים מתאי pTreg באמצעות cytometry זרימה. הכנו באופן ידני את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. Fluorochrome מצומדת CD4 משטח, CD8, CD25, נוגדנים Neuropilin 1 שימשו כדי להכתים את התאים. הם נשמרו במקרר למשך הלילה. ביום הבא, התאים היו מוכתמים נוגדנים Foxp3 ואת הליוס תאיים fluorochrome מצומדת. סמנים אלה שימשו כדי לאפיין את שתי קבוצות משנה של תאים Treg. פרוטוקול זה מדגים דרך פשוטה אך מעשית כדי להכין תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול, להשתמש בהם עבור ניתוח cytometric תזרים עוקבות.
Introduction
הרגולציה ותאי T (Treg) הם קריטיים עבור הומאוסטזיס של מערכת החיסון. Treg תאים מוגדרים על-ידי הביטוי של פני השטח אנטיגנים CD4 ו CD25 ולאחר שעתוק מקדם forkhead P3 תיבת (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. קודם הראה כי CD25 מתבטאת צורונים על תאי T משתיק קול עכברים4, אשר סיפקה תצפית חלוצית לצורך זיהוי תאים אנושיים Treg. תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי סובלנות המערכת החיסונית מצידה בעל יכולת מדכאים באמצעות מגוון של מנגנונים, כולל cytolysis באמצעות ההפרשה של granzymes כדי לגרום אפופטוזיס, צריכת ציטוקין וניגוד דרך הביטוי של ציטוטוקסיות לימפוציטים-T אנטיגן 45. בנוסף, הם יכולים להפריש ציטוקינים מעכבות כגון הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β), אינטרלויקין-10 (IL-10) ו- IL-355. Treg תאים באופן טבעי הנגזרות התימוס, ובמקרה הזה והם מיועדים תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי, או שהם יכולה להיגרם באיברים ההיקפיים באותו מקרה נקראים תאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה.
הליוס, חבר של משפחת פקטור שעתוק Ikaros, דווח כדי להיות סמן להבחנה בין תאים tTreg, pTreg תאים6. מאוחר יותר, שתי קבוצות אחרות דיווחו כי Neuropilin 1 (Nrp1), קולטן השלישי semaphorin, יכול לשמש כסמן משטח של תאים tTreg תחת תנאים מסוימים,7,8. למרות זאת, סינג ואח הראו כי הליוס הוא סמן טוב יותר בהקשר זה נאיבי עכברים9.
קבוצות משנה של תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי שמירה על הומאוסטזיס מערכת החיסון, הגנה מפני מחלת חיסון עצמי ולדלקת. לכן, חשוב לקבוע את המספרים ואת הפרופורציות של אוכלוסיות אלה ברקמות הלימפה והן הלא-הלימפה. כדי להשיג זאת, יש להכין את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. מספר פרוטוקולים המתוארים או בשימוש במחקרים קודמים. בעיקר, dissociators אוטומטי שימשו דוחות שפורסמו בעבר10,11. שימוש dissociators אוטומטי הוא נוח והוא חסכון בזמן, אבל זה הליך יקר. לכן, השתמשנו בשיטה ידנית כדי להכין המתלים תא בודד מאתר בלוטות הרתי, הלבלב ניקוז הלימפה (PDLNs), טחולים normoglycemic (הנד) שאינו שמנים בעכברים סוכרתיים, תאים בודדים מבודדת מן האיברים האלה. בשיטה זו נעשה שימוש במחקרים קודמים שלנו ומצאנו כי השיטה הידנית להכנת התליה תא בודד הוא יעיל כמו dissociator אוטומטי שיטה9,12,13,14. יתר על כן, השתמשנו cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים, תת-קבוצות של Treg תאים תאים tTreg ו- pTreg. התאים tTreg ו- pTreg היו מכובדים באמצעות הליוס Nrp1 כסמני תא tTreg. לכן, התוצאות שלנו עולה כי השיטה הידנית עבור הכנת את התאים לעבוד בצורה יעילה המתלים מוכן תא בודד יכול לשמש עוד יותר עבור מחקרים באמצעות cytometry זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת האתיקה בעלי חיים מקומיים באוניברסיטת אופסלה אישרה את הניסויים בבעלי חיים.
1. קצירת איברים מבעלי חיים
- להקריב את העכברים מאת נקע בצוואר הרחם.
- מקום בלוטות הרתי ומאוזנת טחולים בקבוקונים נצנוץ 20 mL או 15 מ"ל צינורות חרוט מלא עם 5 מ של Hanks´ תמיסת מלח (HBSS). המקום PDLNs 1.5 mL מיקרו צינורות מלאים 1 מ"ל של RPMI 1640. השתמש התימוס כל הטחול, ואני את כל PDLNs.
הערה: איברים יש לשמור על קרח לאורך כל ההליך, החוקר צריך לנסות להיות מהיר תוך כדי הכנת המתלים תא בודד, במיוחד כאשר טיפול רקמות הרתי מאז תאים חיסוניים הרתי יכול להיות מושפל במהירות בטמפרטורות גבוהות.
2. ותא בידוד של בלוטת התימוס וה טחול
- מחצי ביסודיות את בלוטת התימוס וה טחול עם זוג מספריים כדי לשחרר את התאים החיסוניים. למחוק את הקפסולה הרתי, הטחול הנותרים.
- העברת התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 433 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי ליצור גלולה. למחוק את תגובת שיקוע.
- כדי lyse כדוריות דם אדומות, resuspend התליה תא ב 5 מ של 0.2 מ' NH4קלרנית, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות היפוך הצינורות upside מטה בעדינות כל 2 דק הוסף 5 מ של HBSS בסוף הדגירה כדי לעצור את פירוק.
- Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא כ 5 מ של HBSS. למלא את הצינורות HBSS.
- Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא כ 5 מ של HBSS. למלא את הצינורות HBSS.
- Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא ב 5 מ של HBSS עבור התימוס, 10 מ של הטחול.
- 1 מ"ל של התליה תא הרתי והעברת µL 500 של התליה תא הטחול 5 מ ל עגול התחתון צינורות עם תא מסננת כמוסות. החל התליה תא את הפקקים מסננת של התא.
הערה: רשת ניילון מיקרומטר 35 הוא שולב הכיפה. כ 5-10 מיליון תאים נאספו כל צינור.
3. תא ותא בידוד מ- PDLN
- מיקום רשת מתכת מיקרומטר 250 סטרילי מעל צינור חרוטי 15 מ"ל בארון תקשורת. יש לשטוף את רשת השינוי עם 1 מ"ל של RPMI.
- להעביר את בלוטות הלימפה מתכת רשת שינוי, לטחון אותם דרך הרשת בעזרת זוג מספריים. החל מ 1 ל RPMI על מתכת רשת שינוי כדי לשטוף את התאים לתוך הצינור. חזרה 3 פעמים יותר ולהסיר את רשת השינוי.
- Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא כ 5 מ של RPMI. למלא את הצינורות RPMI.
- Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא כ 5 מ של RPMI. למלא את הצינורות RPMI.
- Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא ב- 2 מ של RPMI. העברת 2 מ"ל של התליה תא 5 מ ל עגול התחתון צינורות עם תא מסננת כמוסות. החל התליה תא את הפקקים מסננת של התא.
4. דנ
- Centrifuge את המתלים תאים התימוס, PDLN, טחול ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- כתם התאים עם נוגדנים השטח הבאים ב- 100 µL של cytometry זרימה מכתים מאגר (FACS מאגר): 0.75 נוגדן µg/100 µL FITC מצומדת CD4, 0.60 נוגדן CD8 APC-H7-מצומדת µL µg/100, µg/100 0.30 µL מצומדת PE CD25 נוגדן, 5 µL (1:20) נוגדנים Nrp1 מצומדת-APC. דגירה הצינורות על קרח למשך 40 דקות.
- להוסיף 200 µL FACS מאגר כל שפופרת. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. אני חוזר עוד פעם אחת.
- לתקן, permeabilize את התאים על ידי resuspending בגדר תא ב- 500 µL של המאגר קיבוע Permeabilization (PFB).
הערה: PFB מוכן על ידי ערבוב חלק 1 של קיבעון/Permeabilization להתרכז בשלושה חלקים של קיבעון/Permeabilization Diluent. - להשאיר את הצינורות במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: דגירה 1 h עובד גם. - Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של Permeabilization שטיפה מאגר (PWB). Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
הערה: PWB מוכן על ידי דילול Permeabilization מאגר (10 x) 1:10 במים מזוקקים. - כתם התאים עם נוגדנים תאיים הבאים ב- 100 µL של PWB: 0.30 נוגדן µg/100 µL PE-Cy7-מצומדת Foxp3, נוגדן PacificBlue מצומדת הליוס µL 4 (1:25). דגירה הצינורות על קרח לשעה.
- להוסיף 500 µL של PWB כל שפופרת. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של PWB. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר תא ב- 300 µL מאגר FACS.
- לנתח את התאים על cytometer זרימה.
- שער של תאים בודדים בהתבסס על הצד פיזור-אזור, גובה, רוחב, ו קדימה פיזור-אזור, גובה ורוחב. הפעל מיליון אירועים לניתוח.
- ייצוא קבצים FCS ניסויים ולנתח אותם באמצעות תוכנה מנתח cytometry זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לחקור את הביטוי של Nrp1, הליוס על תאים tTreg ו- pTreg, אנו מוכנים תאים בודדים מן בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים normoglycemic הנד עכברים, מוכתם אותם Treg תא הסמנים CD4, CD25, Foxp3, הליוס ו Nrp1 עבור זרימה cytometric ניתוח. התוצאות נותחו כפי שמוצג עם הנציג של gating אסטרטגיות (איור 1). מצאנו כי היחס של הליוס+ תאים בין CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים היה גבוה מזה של Nrp1+ תאי כל שלושת האיברים (איור 2 א). יותר מ- 80% של תאים Treg התימוס הביע הליוס, אשר היה גבוה יותר מאשר PDLN, הטחול (איור 2 א). חלקם של Nrp1+ תאים בין תאים הליוס+ Treg היה גבוה יותר PDLN מאלה התימוס, הטחול (איור 2B). רוב Nrp1+ Treg תאים גם ביטוי הליוס, את הפרופורציות של הליוס+ תאים בין Nrp1+Treg תאים התימוס, הטחול היו גבוהים יותר מאשר ב- PDLN (איור 2C). יחד, תוצאות אלה מציינים כי הליוס הוא סמן טוב יותר כדי לזהות תאים tTreg מאשר Nrp1.
איור 1: נציג gating אסטרטגיות עבור cytometry זרימה. התאים בשידור חי היו פיקוח בהתבסס על FSC האס. לאחר מכן, תאים היו פיקוח נוסף לביטוי CD4 ו CD8. CD4+CD8 תאים– היו עוד יותר מגודרת עבור הביטוי של CD25. . הבא בתור, CD4+CD8–CD25+ התאים היו מגודרת לביטוי Foxp3. CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg התאים היו מגודרת עבור ביטוי Nrp1 או הליוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הביטוי של Nrp1 והליוס Treg תאים התימוס, PDLN, טחול. בת שבוע 8 ארבעה עכברים הנהון שאינו חולה סוכרת הוקרבו תאים בודדים הוכנו מן בלוטות הרתי, PDLNs טחולים. התאים היו אז מוכתמים fluorochrome מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה. (א) אחוזי Nrp1+ הליוס+ תאי CD4 בין+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים. (B) אחוזי Nrp1+ תאים בין תאים הליוס+ Treg. (ג) האחוזים של הליוס+ תאים בין Nrp1+ Treg תאים. תוצאות באים לידי ביטוי כפי שאומר ± ב- SEM. * * *p < 0.001. חד-כיווני אנובה ואחריו השוואות מרובות של Tukey (A, B ו- C), t אינטראקצית-(א) הבדיקות בוצעו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, אנחנו מבודדים תאים בודדים בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים של עכברים הנהון, חקרה את הביטוי של הליוס, Nrp1 ב CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים באמצעות cytometry זרימה. במחקר הנוכחי, הנהון עכברים שימשו, אשר הוא מודל מאתר של סוכרת מסוג 1. במחקר הקודם, השתמשנו פראי סוג העכבר זנים CD-1 ועכברים C57BL/6 לחקור אם הליוס או Nrp1 הוא סמן טוב יותר להבחנה בין tTreg תאים מתאי pTreg. במחקר הזה, השתמשנו פרוטוקול דומה כדי לקבוע תת-קבוצות של תאים Treg תמים עכברים9. מצאנו כי הליוס הוא סמן טוב יותר בהקשר זה. לכן, במסמך זה השתמשנו normoglycemic הנד עכברים כדי לאשר שלנו ממצא קודמות במודל זה ומצא כי התוצאות היו עקביים עם תוצאות קודמות שלנו10. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה, חסכונית עדיין כדי להכין תאים בודדים, ולאחר מכן להשתמש בהם עבור ניתוח תזרים cytometric. ישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו שבו תאים בודדים מוכנות באמצעות11,dissociator אוטומטי12. במקום להשתמש של dissociator, מאת לסחוט את בלוטות הרתי ואת טחולים ידנית ומחיקת הקפסולה הנותרים, אנו יכולים למנוע הנוכחות של סיבי רקמת ההשעיה תא ולוודא שהתליה תא מורכבת בעיקר של תאים חיסוניים ואדום תאי דם. ואז היינו NH4Cl lyse כדוריות דם אדומות. ניתן להאריך משך הזמן של פירוק במשך עוד כמה דקות אם האיברים גדולים יותר מגודלה הרגיל. אולם, צריך המשך פירוק לא להאריך יותר מדי, אחרת תאים חיסוניים גם להיות lysed. חשוב לתת התליה תא לעבור כובע עם מסננת תא (או מסננים תא שווי ערך אחרים), כדי למנוע בעיות להדביק במהלך cytometry זרימה.
עובד בחושך מומלץ בעת עבודה עם נוגדנים fluorochrome מצומדת כדי למנוע חשיפה ארוך יותר לאור. אנחנו תדגור התאים על קרח חוץ-תאית, תאיים מכתים הדגירה יכולה להיעשות גם בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר איגוד מהירה יותר של נוגדנים, אבל יש סיכון של איגוד לא ספציפי.
סמני תאיים מסוימים מחייבים מספרים גדולים של תאים לתת אותות טוב cytometry זרימה. לאור גודלו הקטן של PDLNs, טוחן אותם על רשת מתכת מחייב טיפול נוסף כדי לאפשר שחרור מקסימלי של תאים חיסוניים. איסוף PDLNs יותר היא גם דרך להגדיל את מספר התאים. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה הוא כי התאים הם תיקנו permeabilized לניתוח cytometric זרימה, ולכן הם אינם יכולים לשמש עבור מחקרים מאוחרים יותר פונקציונלי. מיון מגנטי הוא אופציה כדי לאפשר מחקרים פונקציונלי אם רק סמני פני השטח הם עניין.
פרוטוקול זה הוחל במודלים אחרים של העכבר של מחלת חיסון עצמי, סרטן13,14. הכנה תא בודד היא טכניקה בסיסית אבל שימושי כדי לקבוע את המאפיינים של תאים חיסוניים באיברים חיסוניים שונים. בשיטה זו הכנה תא בודד עלול לגרום נמק, והתוצאה עשויה להיות הקטנת המספר הכולל של תאים. החפיפה ספקטרלי של cytometry זרימה המסורתית מגבילה את מספר סמנים שניתן לאתר בו זמנית. לכן, מספר פאנלים, מספר גדול של תאים נדרשים לרכוש פרופיל החיסונית באופן כללי. בעתיד, זה ניתן להתגבר על ידי הפיתוח של cytometry המוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחקר הנוכחי נתמך כלכלית על ידי המועצה למחקר השבדי, EXODIAB, קרן סוכרת שוודית, קרן סוכרת ילד שבדי, סאב Diabetesfonden רוצה שתיכנס לשם ו Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. המחברים גם רוצה תודה לכל-אולה Carlsson, סטלאן סנדלר שלהם תומך ודיונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
