Summary
Qui, presentiamo un protocollo per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza per studiare ulteriormente queste cellule mediante citometria a flusso. Inoltre, questo protocollo è stato utilizzato per determinare le sottopopolazioni di cellule T regolatorie mediante citometria a flusso.
Abstract
Il nostro sistema immunitario è costituito da un numero e una varietà di cellule immuni compreso le cellule T regolatorie (Treg) di cellule. Le cellule Treg possono essere diviso in due sottoinsiemi, cellule Treg (tTreg) derivate timiche e marginalmente indotto le cellule Treg (pTreg). Sono presenti in diversi organi del nostro corpo e possono essere distinti dagli indicatori specifici, quali Helios e Neuropiline 1. È stato segnalato che le cellule tTreg sono funzionalmente più soppressive rispetto alle cellule pTreg. Pertanto, è importante determinare la proporzione di cellule tTreg e pTreg durante l'analisi di popolazioni eterogenee delle cellule. Nel presente documento, abbiamo raccolto ghiandole del timo, linfonodi drenanti pancreatici e milze dai topi diabetici non obesi normoglicemici di distinguere le cellule di tTreg dalle cellule pTreg mediante citometria a flusso. Abbiamo preparato manualmente sospensioni di cellule singole da questi organi. Fluorocromo coniugato superficie CD4, CD8, CD25 e Neuropiline 1 anticorpi sono stati utilizzati per colorare le cellule. Erano tenute in frigorifero durante la notte. Il giorno successivo, le cellule sono state macchiate con fluorocromo coniugato anticorpi intracellulari di Foxp3 e Helios. Questi indicatori sono stati usati per caratterizzare i due sottoinsiemi di cellule Treg. Questo protocollo viene illustrato un modo semplice ma pratico per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza e utilizzarli per l'analisi citofluorimetrica.
Introduction
Cellule regolarici di T (Treg) sono critiche per l'omeostasi del sistema immunitario. Le cellule Treg sono definite dall'espressione di antigeni di superficie CD4 e CD25 e la trascrizione fattore forkhead box P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. in primo luogo ha mostrato che CD25 è costitutivamente espresso sulle cellule del soppressore di T in topi4, che ha fornito un'osservazione pionieristica per l'identificazione di cellule Treg umane. Le cellule Treg svolgono un ruolo centrale nella tolleranza immunitaria esercitando una soppressiva capacità attraverso una varietà di meccanismi, tra cui citolisi attraverso la secrezione di granzimi per indurre apoptosi, consumo di citochina e inibizione attraverso l'espressione di citotossici T-linfociti antigene 45. Inoltre, essi possono secernere citochine inibitorie come trasformazione di fattore di crescita beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) e IL-355. Le cellule Treg naturalmente possono essere derivate dal timo, nel qual caso sono designati timica derivate cellule Treg (tTreg), o può essere indotta negli organi periferici, nel cui caso sono chiamati marginalmente indotto le cellule Treg (pTreg).
Helios, un membro della famiglia di fattore di trascrizione Ikaros, è stato segnalato per essere un indicatore per la distinzione tra cellule tTreg e cellule pTreg6. Più tardi, altri due gruppi ha riferito che Neuropiline 1 (Nrp1), un recettore III semaforine, potrebbe servire come un indicatore della superficie per le cellule di tTreg sotto certe condizioni7,8. Tuttavia, Singh et al hanno dimostrato che l'Helios è un migliore indicatore in questo contesto ingenuo topi9.
I sottoinsiemi di cellule Treg giocano un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi del sistema immunitario e nella protezione contro l'autoimmunità e infezione. Pertanto, è importante determinare i numeri e le proporzioni di queste popolazioni nei tessuti non linfoidi e linfoidi. Per raggiungere questo obiettivo, bisogna preparare sospensioni singola cella da questi organi. Diversi protocolli sono stati descritti o utilizzato negli studi precedenti. Principalmente, Dissociatori automatici sono stati utilizzati in rapporti precedentemente pubblicati10,11. Utilizzo automatici Dissociatori è conveniente e risparmio di tempo, ma è una procedura costosa. Di conseguenza, abbiamo utilizzato un metodo manuale per preparare sospensioni di cellule singole da murini ghiandole del timo, linfonodi drenanti del pancreas (PDLNs) e milze di topi diabetici non obesi (NOD) di normoglycemic e cellule singole isolate da questi organi. Questo metodo è stato utilizzato nei nostri studi precedenti e abbiamo trovato che il metodo manuale per la preparazione di sospensione unicellulare è efficiente come dissociatore automatico metodo9,12,13,14. Inoltre, abbiamo utilizzato la citometria a flusso per determinare le proporzioni di CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg le cellule e i sottoinsiemi di Treg cells in tTreg e pTreg. Le cellule tTreg e pTreg sono stati distinti con Helios e Nrp1 come marcatori per tTreg cella. Quindi, i nostri risultati indicano che il metodo manuale per la preparazione di singole cellule funziona in modo efficiente e le sospensioni preparate singola cella possono essere ulteriormente utilizzate per gli studi mediante citometria a flusso.
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Protocol
Il Comitato di etica animale locale all'Università di Uppsala ha approvato esperimenti sugli animali.
1. gli organi da animali di raccolta
- Sacrificare i topi da dislocazione cervicale.
- Posizionare le ghiandole del timo e milze in 20 mL scintillazione fiale o provette coniche da 15 mL riempite con 5 mL di Hanks´ soluzione salina (HBSS) equilibrata. Posto PDLNs in microprovette da 1,5 mL riempite con 1 mL di RPMI 1640. Utilizzare intero timo e milza e tutti i PDLNs.
Nota: Organi dovrebbero essere tenuti su ghiaccio durante tutta la procedura e l'investigatore dovrebbe cercare di essere veloci durante la preparazione di sospensioni di cellule singole, soprattutto quando si gestisce il tessuto timico poiché timiche cellule del sistema immunitario possono essere rapidamente degradate ad alte temperature.
2. singola cella isolamento da timo e la milza
- Spremere bene il timo e la milza con un paio di pinzette per rilasciare le cellule immunitarie. Scartare la restante capsula timica e splenica.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 433 x g per 5 min a 4 ° C per formare una pallina. Scartare il surnatante.
- Per lisare le cellule del sangue rosso, Risospendere la sospensione cellulare in 5 mL di 0,2 M NH4Cl e incubare a temperatura ambiente per 10 min. invertire i tubi capovolta delicatamente ogni 2 minuti aggiungere 5 mL di HBSS alla fine dell'incubazione per interrompere la lisi.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di HBSS. Riempire le provette con HBSS.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di HBSS. Riempire le provette con HBSS.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di HBSS per Timo e 10 mL per la milza.
- Trasferimento 1 mL della sospensione delle cellule timiche e 500 µ l della sospensione delle cellule spleniche di 5ml rotondo fondo tubi con tappi filtro cella. Applicare la sospensione cellulare i tappi filtro cella.
Nota: Una rete di nylon 35 µm è incorporata nella PAC. Circa 5 milioni di cellule sono stati raccolti in ciascun tubo.
3. singola cella isolamento da PDLN
- Posiziona una maglia di metallo 250 µm sterile in una provetta conica da 15 mL in un rack. Sciacquare la mesh con 1 mL di RPMI.
- Trasferire i linfonodi per la rete metallica e li pestava attraverso la mesh usando un paio di pinzette. Applicare 1 mL di RPMI sulla maglia metallica per svuotare le cellule nel tubo. Ripetere 3 volte e rimuovere la mesh.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di RPMI. Riempire le provette con RPMI.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di RPMI. Riempire le provette con RPMI.
- Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di RPMI. Trasferimento 2 mL di sospensione cellulare a 5 mL rotondo fondo tubi con tappi filtro cella. Applicare la sospensione cellulare i tappi filtro cella.
4. flusso Cytometry
- Centrifugare le sospensioni delle cellule da timo, PDLN e milza a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Macchia le celle con i seguenti anticorpi di superficie in 100 µ l di citometria a flusso macchiatura buffer (buffer di FACS): 0,75 µ g/100 µ l coniugato FITC CD4 anticorpo, 0,60 anticorpo coniugato APC-H7 CD8 µ g/100 µ l, 0.30 µ g/100 µ l CD25 PE-coniugato anticorpo, 5 µ l (01:20) Anticorpo Nrp1 coniugato APC. Incubare le provette in ghiaccio per 40 min.
- Aggiungere 200 µ l di tampone di FACS in ogni provetta. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Ripetere un'altra volta.
- Difficoltà e permeabilize le cellule da risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di permeabilizzazione fissazione Buffer (PFB).
Nota: PFB è preparata mescolando 1 parte di fissazione/Permeabilization concentrato con 3 parti di fissazione/Permeabilization diluente. - Mantenere le provette in frigorifero a 4 ° C durante la notte.
Nota: Un'incubazione di 1 h funziona anche. - Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di Buffer di lavaggio di permeabilizzazione (PWB). Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
Nota: PWB si prepara diluendo Permeabilization Buffer (10x) a 01:10 in acqua distillata. - Macchia le celle con i seguenti anticorpi intracellulari in 100 µ l di PWB: 0,30 µ g/100 µ l Foxp3 PE-Cy7-coniugato anticorpo, anticorpo coniugato PacificBlue Helios 4 µ l (01:25). Incubare le provette in ghiaccio per 1h.
- Aggiungere 500 µ l di PWB in ogni provetta. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di PWB. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare a 300 µ l di tampone di FACS.
- Analizzare le cellule su un citometro a flusso.
- Le singole cellule basate su zona Side Scatter, altezza e larghezza e Forward Scatter-Area, altezza e larghezza del cancello. Eseguire 1 milione gli eventi per l'analisi.
- Esportare i file FCS di esperimenti e analizzarli utilizzando un software analizzatore di citometria a flusso.
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Representative Results
Per studiare l'espressione di Nrp1 e Helios sulle cellule tTreg e pTreg, abbiamo preparato le celluli dalle ghiandole del timo, PDLNs e milze di topi NOD normoglicemici e li macchiato con gli indicatori delle cellule Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios e Nrp1 per flusso cytometric analisi. I risultati sono stati analizzati come mostrato nel rappresentante gating strategie (Figura 1). Abbiamo trovato che la proporzione di cellule di Helios+ tra CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellule era superiore a quella di Nrp1+ cellule in tutti e tre gli organi (Figura 2A). Più dell'80% delle cellule Treg nel timo espresso Helios, che era superiore al PDLN e la milza (Figura 2A). La proporzione di Nrp1+ le cellule Treg Helios+ è stata superiore nel PDLN quelli nel timo e milza (Figura 2B). La maggior parte dei Nrp1+ Treg cellule anche espressa Helios e le proporzioni delle cellule di Helios+ fra Nrp1+cellule Treg nel timo e milza erano superiori che in PDLN (Figura 2). Insieme, questi risultati indicano che la Helios è un migliore indicatore per rilevare le cellule di tTreg di Nrp1.
Figura 1: rappresentante gating strategie per citometria a flusso. Le singole cellule dal vivo erano gated basato su FSC e SSC. Quindi, le cellule sono stati ulteriormente gated per espressione di CD4 e CD8. CD4+CD8– cellule erano ulteriormente all'ingresso per l'espressione di CD25. Avanti, CD4+CD8–CD25+ cellule erano gated per l'espressione di Foxp3. CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellule erano gated per espressione Nrp1 o Helios. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: l'espressione di Nrp1 e Helios in cellule t regolatorie nel timo, milza e PDLN. Quattro 8 settimana-vecchi topi NOD non-diabetico sono stati sacrificati. Singole cellule sono state preparate dalle ghiandole del timo, PDLNs e milze. Le cellule poi sono state macchiate con gli anticorpi fluorocromo coniugato per analisi cytometric di flusso. (A) le percentuali di Nrp1+ e Helios+ cellule tra CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellule. (B) le percentuali di Nrp1+ cellule fra le cellule Treg Helios+ . (C) le percentuali di Helios+ cellule tra Nrp1+ Treg cellule. I risultati sono espressi come mezzi ± SEM. * * *p < 0,001. One-way ANOVA seguita da confronti multipli di Tukey (A, B e C) e (A) spaiato t-test sono stati eseguiti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo isolato cellule singole ghiandole del timo, PDLNs e milze di topi NOD e studiato l'espressione di Helios e Nrp1 in CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellule mediante citometria a flusso. Nel presente studio, sono stati utilizzati topi NOD, che è un modello murino di diabete di tipo 1. In uno studio precedente, abbiamo utilizzato il CD-1 diversi ceppi di topi wild-type e topi C57BL/6 di indagare se Helios o Nrp1 è un migliore indicatore per distinguere le cellule di tTreg dalle cellule pTreg. In quello studio, abbiamo usato un protocollo simile per determinare i sottoinsiemi di cellule Treg in ingenuo topi9. Abbiamo trovato che Helios è un migliore indicatore in questo contesto. Pertanto, qui abbiamo usato topi NOD normoglycemic per confermare la nostra precedente accertamento in questo modello e ha trovato che i risultati erano coerenti con i nostri precedenti risultati10. Questo protocollo consente di preparare singole cellule e successivamente utilizzarli per l'analisi cytometric di flusso in modo efficiente, ma economico. Esistono diversi protocolli pubblicati in cui singole cellule vengono preparate utilizzando un dissociatore automatico11,12. Invece di utilizzare un dissociatore, comprimendo le ghiandole del timo e milze manualmente e scartando la capsula rimanente, possiamo evitare la presenza di tessuto fibroso in una sospensione cellulare e assicurarsi che la sospensione cellulare è composta principalmente di rosso e cellule del sistema immunitario cellule del sangue. Allora abbiamo usato NH4Cl per lisare le cellule di anima rosse. La durata della lisi può essere esteso per un paio di minuti se gli organi sono più grandi rispetto alla dimensione normale. Tuttavia, la durata di lisi non dovrebbe essere troppo esteso, altrimenti le cellule immuni anche saranno lisate. È importante lasciare la sospensione cellulare andare attraverso un tappo con filtro cella (o altri filtri cella equivalente), per evitare problemi di intasamento durante la citometria a flusso.
Lavora nel buio è consigliato quando si lavora con gli anticorpi fluorocromo coniugato per evitare più lunga esposizione alla luce. Noi incubare le cellule sul ghiaccio per la colorazione intracellulare ed extracellulare. L'incubazione può avvenire anche a temperatura ambiente per permettere un più veloce legame degli anticorpi, ma c'è un rischio di associazione non specifico.
Alcuni marcatori intracellulari richiedono un numero elevato di cellule per dare buoni segnali in citometria a flusso. Date le piccole dimensioni della PDLNs, molatura loro su una rete metallica richiede più attenzione per consentire un rilascio massimo di cellule immunitarie. Raccogliendo più PDLNs è anche un modo per aumentare il numero di cellulare. Un'altra limitazione di questo protocollo è che le cellule sono fissi e permeabilized per analisi cytometric di flusso, quindi non possono essere utilizzati per studi funzionali successivi. L'ordinamento magnetico è un'opzione per permettere gli studi funzionali, se solo gli indicatori di superficie sono di interesse.
Questo protocollo è stato applicato in altri modelli murini di autoimmunità e cancro13,14. Preparazione di singola cellula è una tecnica semplice, ma utile per determinare le caratteristiche delle cellule immuni negli organi immuni differenti. Utilizzando questo metodo per la preparazione di singola cellula potrebbe causare necrosi, che può provocare la diminuzione del numero totale di cellule. La sovrapposizione spettrale di citometria a flusso tradizionale limita il numero di marcatori che possono essere rilevati contemporaneamente. Pertanto, è necessario per acquisire un profilo nel complesso immune diversi pannelli e gran numero di cellule. In futuro, questo può essere superato dallo sviluppo di massa cytometry.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio svedese della ricerca, EXODIAB, la Fondazione svedese per il diabete, fondo di diabete bambino svedese, SEB Diabetesfonden e O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autori vorrebbero anche grazie Per-Ola Carlsson e Stellan Sandler per loro supporti e discussioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
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