Summary
Adjunto, presentamos un protocolo para preparar las células de ratón timo, páncreas drena a ganglios linfáticos y el bazo a un estudio más profundo estas células mediante citometría de flujo. Además, este protocolo se utiliza para determinar los subconjuntos de células T reguladoras mediante citometría de flujo.
Abstract
Nuestro sistema inmunológico consiste en una cantidad y variedad de células inmunes, incluyendo las células T reguladoras (Treg) de células. Las células TReg pueden dividirse en dos subconjuntos, las células Treg (tTreg) derivadas tímicas y periférica inducida por las células Treg (pTreg). Están presentes en diversos órganos de nuestro cuerpo y pueden distinguirse por marcadores específicos, como Helios y la neuropilina 1. Se ha reportado que las células tTreg son funcionalmente más represivas que las células pTreg. Por lo tanto, es importante determinar la proporción de células tTreg y pTreg la investigación de poblaciones celulares heterogéneas. En este documento, recogimos las glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos y bazos de normoglucémicos ratones diabéticos no obesos para distinguir las células de tTreg de pTreg las células mediante citometría de flujo. Preparamos manualmente suspensiones de la célula de estos órganos. Fluorocromo había conjugado de superficie CD4, CD8, CD25, y anticuerpos de la neuropilina 1 fueron utilizados para teñir las células. Se guardaron en el refrigerador durante la noche. Al día siguiente, las células se tiñeron con fluorocromo conjugado con anticuerpos intracelulares de Foxp3 y Helios. Estos marcadores fueron usados para caracterizar los dos subconjuntos de células Treg. Este protocolo muestra una forma sencilla pero práctica para preparar las células de timo murino, drenaje de ganglios linfáticos y el bazo páncreas y utilizarlos para análisis cytometric del flujo posterior.
Introduction
Las células reguladoras T (Treg) son críticas para la homeostasis del sistema inmune. Las células TReg se definen por la expresión de antígenos de superficie CD4 y CD25 y el factor de transcripción forkhead de caja P3 (Foxp3)2,1,3. Sakaguchi et al demostró primero que CD25 se expresa constitutivamente en las células supresoras de T en ratones4, que proporciona una observación pionera para la identificación de las células Treg humanas. Las células TReg desempeñan un papel central en la tolerancia inmunológica ejerciendo una capacidad represiva a través de una variedad de mecanismos, incluyendo citólisis a través de la secreción de granzymes para inducir apoptosis, consumo de citoquinas y la inhibición a través de la expresión de citotóxicos Linfocitos T antígeno 45. Además, pueden secretar citoquinas inhibitorias como transformación de factor de crecimiento beta (TGF-β), interleucina-10 (IL-10) y IL-355. Las células TReg pueden naturalmente derivar el timo, en cuyo caso se señalan las células Treg (tTreg) derivadas tímicas, o puede ser inducidas en los órganos periféricos en que caso se llaman periférica inducida por las células Treg (pTreg).
Helios, un miembro de la familia de factores de transcripción Ikaros, fue divulgado para ser un marcador para distinguir entre las células tTreg y células de pTreg6. Más tarde, otros dos grupos informaron que la neuropilina 1 (Nrp1), un receptor III semaphorin, podría servir como un marcador de superficie para tTreg las células bajo ciertas condiciones7,8. Sin embargo, Singh et al han demostrado que Helios es un mejor marcador en este contexto en ingenuo ratones9.
Los subconjuntos de células Treg juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune y en la protección contra la infección y autoinmunidad. Por lo tanto, es importante determinar los números y proporciones de estas poblaciones en los tejidos linfoides y no linfoides. Para lograr esto, uno tiene que preparar suspensiones de la célula de estos órganos. Un número de protocolos ha sido descrito o utilizados en estudios anteriores. Principalmente, se han utilizado automáticas disociadores en informes previamente publicados10,11. Utilizando disociadores automáticas es conveniente y ahorro de tiempo, pero es un procedimiento costoso. Por lo tanto, hemos utilizado un método manual para preparar suspensiones de la célula de murinas glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos (PDLNs) y bazos de ratones de (cabeceo) diabéticos no obesos normoglucémicos y aislado las células de estos órganos. Este método se ha utilizado en nuestros anteriores estudios y se encontró que el método manual para la preparación de la suspensión de células individuales es tan eficiente como disociador automático método9,12,13,14. Además, hemos utilizado la citometría de flujo para determinar las proporciones de CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células y los subconjuntos de Treg células tTreg y pTreg. Las células tTreg y pTreg fueron distinguidas con Helios y Nrp1 como marcadores para células de tTreg. Por lo tanto, nuestros resultados indican que el método manual para la preparación de las células funciona eficientemente y las suspensiones preparadas unicelular pueden utilizarse además para estudios mediante citometría de flujo.
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Protocol
El Comité local de ética animal en Universidad de Uppsala aprobó la experimentación animal.
1. recolección de órganos de animales
- Los ratones de sacrificio mediante dislocación cervical.
- Coloque las glándulas timo y bazo en viales de centelleo de 20 mL o en tubos cónicos de 15 mL con 5 mL de Hanks´ equilibrada solución de sal (HBSS). PDLNs lugar en micro tubos de 1,5 mL con 1 mL de RPMI 1640. Utilice todo timo y bazo y el PDLNs.
Nota: Órganos deben conservarse en hielo durante todo el procedimiento y el investigador debe tratar de ser rápido y preparar suspensiones de la célula, especialmente cuando la manipulación de tejido tímico pues tímicas células inmunes pueden ser degradadas rápidamente a altas temperaturas.
2. célula aislamiento de timo y bazo
- Apriete bien el timo y el bazo con un par de pinzas para liberar las células inmunes. Deseche la cápsula restante del timo y bazo.
- Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 433 x g durante 5 min a 4 ° C para formar un pellet. Deseche el sobrenadante.
- Para lisar los glóbulos rojos, suspender la suspensión de células en 5 mL de 0.2 M de NH4Cl e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos invertir los tubos boca abajo suavemente cada 2 minutos añadir 5 mL de HBSS al final de la incubación para detener la lisis.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de HBSS. Llene los tubos con HBSS.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de HBSS. Llene los tubos con HBSS.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 5 mL de la HBSS para timo y 10 mL para el bazo.
- Transferencia 1 mL de la suspensión de células tímicas y 500 μl de la suspensión de células esplénicas a 5 mL alrededor de tubos con tapas de filtro de la célula. Aplicar la suspensión de células a las tapas de filtro de la célula.
Nota: Una malla de nylon de 35 μm se incorpora en la tapa. Aproximadamente 5 millones células se colectaron en cada tubo.
3. célula aislamiento de PDLN
- Colocar una malla metálica de 250 μm estéril en un tubo cónico de 15 mL en una parrilla. Lavar la malla con 1 mL de RPMI.
- Transferencia de los nodos de linfa a la malla metálica y moler a través de la malla utilizando un par de pinzas. Aplicar 1 mL de RPMI en la malla metálica para limpiar las células en el tubo. Repetir 3 veces más y sacar la malla.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de RPMI. Llene los tubos con RPMI.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de RPMI. Llene los tubos con RPMI.
- Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 2 mL de RPMI. Transferencia 2 mL de la suspensión de células a 5 mL alrededor de tubos con tapas de filtro de la célula. Aplicar la suspensión de células a las tapas de filtro de la célula.
4. citometría de flujo
- Centrifugue las suspensiones de células de timo, PDLN y bazo en 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Las células con los siguientes anticuerpos superficie en 100 μl de citometría de flujo tampón (tampón FACS) la coloración de la mancha: 0.75 anticuerpo μg/100 μl CD4 FITC conjugado, 0,60 CD8 APC H7 conjugado anticuerpos de μg/100 μl, anticuerpo 0.30 μg/100 μl CD25 conjugado con PE, 5 μl (1:20) Anticuerpo conjugado con APC de Nrp1. Incubar los tubos en hielo durante 40 minutos.
- Añadir 200 μL de tampón FACS a cada tubo. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Repetir una vez más.
- Fijar y permeabilizar las células por Resuspender el pellet celular en 500 μl de tampón de fijación permeabilización (PFB).
Nota: PFB se prepara mezclando 1 parte de fijación/permeabilización concentrado con 3 partes de diluyente de fijación/permeabilización. - Mantener los tubos en la nevera a 4 ° C durante la noche.
Nota: También funciona una incubación de 1 h. - Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 500 μl de tampón de lavado permeabilización (PWB). Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
Nota: PLP se prepara diluyendo permeabilización Buffer (10 x) a 1:10 en agua destilada. - Las células con los siguientes anticuerpos intracelulares en 100 μl de PLP de la mancha: 0,30 anticuerpo μg/100 μl de conjugado con PE Cy7 Foxp3, 4 μL (1:25) Helios PacificBlue-conjugado anticuerpo. Incubar los tubos en hielo durante 1 hora.
- Añadir 500 μl de PLP a cada tubo. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 500 μl de PLP. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 300 μL de tampón FACS.
- Analizar las células en un citómetro de flujo.
- Las células basadas en el área de dispersión lateral, altura y anchura y Forward Scatter-área, altura y anchura de la puerta. Ejecutar eventos 1 millón para el análisis.
- Exportar los archivos FCS de experimentos y analizarlos utilizando un software de analizador de citometría de flujo.
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Representative Results
Para investigar la expresión de Nrp1 y Helios en células tTreg y pTreg, preparamos las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones del cabeceo de normoglucémicos y teñido con los marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios y Nrp1 para citometría de flujo Análisis. Los resultados fueron analizados como se muestra en el representante gating estrategias (figura 1). Encontramos que la proporción de células de Helios+ entre CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células era mayor que la de Nrp1+ de las células en todos los tres órganos (figura 2A). Más del 80% de las células Treg en el timo expresó Helios, que era más alto que en el PDLN y el bazo (figura 2A). La proporción de Nrp1+ células entre las células Treg Helios+ fue mayor en el PDLN que en el timo y el bazo (figura 2B). La mayoría de Nrp1+ Treg células también Helios expresada y las proporciones de células de Helios+ entre Nrp1+las células de Treg en el timo y el bazo eran mayor que en el PDLN (figura 2). Juntos, estos resultados indican que Helios es un mejor marcador para detectar células tTreg que Nrp1.
Figura 1: Representante gating estrategias para citometría de flujo. Las células vivas fueron cerradas partiendo de FSC y SSC. Luego, las células fueron más cerradas para la expresión de CD4 y CD8. CD4+CD8 células– más fueron bloqueadas para la expresión de CD25. Siguiente, CD4+CD8–CD25+ las células fueron bloqueadas para la expresión de Foxp3. CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células fueron bloqueadas para la expresión Nrp1 o Helios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la expresión de Nrp1 y Helios en células Treg en el timo, el PDLN y el bazo. Cuatro 8 semanas de edad se sacrificaron ratones del cabeceo de no diabéticos. Se prepararon las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos. Las células luego se tiñeron con fluorocromo conjugado anticuerpos para análisis cytometric del flujo. (A) los porcentajes de Nrp1+ y Helios+ células entre CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células. (B) los porcentajes de Nrp1 de células entre las células Treg Helios+ + . (C) los porcentajes de Helios+ células entre Nrp1+ Treg células. Los resultados se expresan como medios ± SEM. ***p < 0.001. ANOVA de una vía seguido de comparaciones múltiples de Tukey (A, B y C) y se realizaron pruebas de t impares (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, aislado de las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones NOD e investigado la expresión de Helios y Nrp1 en CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células mediante citometría de flujo. En el presente estudio, se utilizaron ratones NOD, que es un modelo murino de diabetes tipo 1. En un estudio anterior, hemos utilizado el cepas tipo salvaje ratón CD-1 y ratones C57BL/6 investigar si Helios o Nrp1 es un mejor marcador para distinguir las células tTreg de células pTreg. En ese estudio, se utilizó un protocolo similar para determinar los subconjuntos de células Treg en el ingenuo ratones9. Encontramos que Helios es un mejor marcador en este contexto. Por lo tanto, en este documento utilizamos ratones del cabeceo de normoglucémicos para confirmar nuestro hallazgo anterior en este modelo y encontró que los resultados eran constantes con nuestros anteriores resultados10. Este protocolo proporciona una manera eficiente, sin embargo económica para preparar las células y posteriormente utilizarlos para análisis cytometric del flujo. Existen varios protocolos publicados en los que las células se preparan usando un disociador automático11,12. En lugar de utilizar un disociador, exprimir las glándulas timo y bazo manualmente y desechando la cápsula restante, podemos evitar la presencia de tejido fibroso en la suspensión de células y asegúrese de que la suspensión de células se compone principalmente de rojo y las células inmunes células de la sangre. Entonces solíamos NH4Cl para lisar los glóbulos rojos. La duración de la lisis puede prolongarse unos minutos más si los órganos son más grandes que el tamaño normal. Sin embargo, la duración de lisis no debe extenderse demasiado, de lo contrario las células inmunes también ser lisis. Es importante dejar la suspensión de células a través de una tapa con colador celular (u otros filtros de la célula equivalente), para evitar problemas de obstrucción durante el flujo cytometry.
Trabajando en la oscuridad se recomienda cuando se trabaja con fluorocromo conjugado anticuerpos para evitar una exposición más larga a la luz. Incuban las células en hielo para la tinción intracelular y extracelular. También se puede hacer la incubación a temperatura ambiente para permitir a un enlace más rápido de los anticuerpos, pero existe el riesgo de atascamiento no específico.
Algunos marcadores intracelulares requieren grandes cantidades de células a dar buenas señales en citometría de flujo. Dado el pequeño tamaño de PDLNs, moler en una malla metálica requiere más cuidado para permitir una máxima liberación de las células inmunes. Recoger más PDLNs es también una manera de aumentar el número de celular. Otra limitación de este protocolo es que las células son fijos y permeabilized por análisis cytometric del flujo, así no se puede utilizar para posteriores estudios funcionales. Clasificación magnética es una opción para permitir estudios funcionales Si sólo son marcadores de la superficie de interés.
Este protocolo se ha aplicado en otros modelos de ratón de autoinmunidad y cáncer13,14. Preparación de la célula es una técnica básica pero útil para determinar las características de las células inmunes en diferentes órganos inmunes. Usando este método para la preparación de la célula puede causar necrosis, que puede resultar en disminución del número total de células. El solapamiento espectral de citometría de flujo tradicional limita el número de marcadores que se pueden detectar al mismo tiempo. Por lo tanto, varios paneles y gran número de células se necesitan para adquirir un perfil inmune general. En el futuro, esto se puede solucionar por el desarrollo de citometría de masas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El presente estudio fue apoyado financieramente por el Consejo de investigación sueco, EXODIAB, la Fundación sueca de la Diabetes, el sueco niño Diabetes fondo, SEB Diabetesfonden y O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autores también quisieran gracias por Ola Carlsson y Stellan Sandler por sus soportes y discusiones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
