Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Resumen

Adjunto, presentamos un protocolo para preparar las células de ratón timo, páncreas drena a ganglios linfáticos y el bazo a un estudio más profundo estas células mediante citometría de flujo. Además, este protocolo se utiliza para determinar los subconjuntos de células T reguladoras mediante citometría de flujo.

Resumen

Nuestro sistema inmunológico consiste en una cantidad y variedad de células inmunes, incluyendo las células T reguladoras (Treg) de células. Las células TReg pueden dividirse en dos subconjuntos, las células Treg (tTreg) derivadas tímicas y periférica inducida por las células Treg (pTreg). Están presentes en diversos órganos de nuestro cuerpo y pueden distinguirse por marcadores específicos, como Helios y la neuropilina 1. Se ha reportado que las células tTreg son funcionalmente más represivas que las células pTreg. Por lo tanto, es importante determinar la proporción de células tTreg y pTreg la investigación de poblaciones celulares heterogéneas. En este documento, recogimos las glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos y bazos de normoglucémicos ratones diabéticos no obesos para distinguir las células de tTreg de pTreg las células mediante citometría de flujo. Preparamos manualmente suspensiones de la célula de estos órganos. Fluorocromo había conjugado de superficie CD4, CD8, CD25, y anticuerpos de la neuropilina 1 fueron utilizados para teñir las células. Se guardaron en el refrigerador durante la noche. Al día siguiente, las células se tiñeron con fluorocromo conjugado con anticuerpos intracelulares de Foxp3 y Helios. Estos marcadores fueron usados para caracterizar los dos subconjuntos de células Treg. Este protocolo muestra una forma sencilla pero práctica para preparar las células de timo murino, drenaje de ganglios linfáticos y el bazo páncreas y utilizarlos para análisis cytometric del flujo posterior.

Introducción

Las células reguladoras T (Treg) son críticas para la homeostasis del sistema inmune. Las células TReg se definen por la expresión de antígenos de superficie CD4 y CD25 y el factor de transcripción forkhead de caja P3 (Foxp3)^2,1,3. Sakaguchi et al demostró primero que CD25 se expresa constitutivamente en las células supresoras de T en ratones⁴, que proporciona una observación pionera para la identificación de las células Treg humanas. Las células TReg desempeñan un papel central en la tolerancia inmunológica ejerciendo una capacidad represiva a través ....

Protocolo

El Comité local de ética animal en Universidad de Uppsala aprobó la experimentación animal.

1. recolección de órganos de animales

1. Los ratones de sacrificio mediante dislocación cervical.
2. Coloque las glándulas timo y bazo en viales de centelleo de 20 mL o en tubos cónicos de 15 mL con 5 mL de Hanks´ equilibrada solución de sal (HBSS). PDLNs lugar en micro tubos de 1,5 mL con 1 mL de RPMI 1640. Utilice todo timo y bazo y el PDLNs.
   Nota: Órganos deben conservarse en hielo durante todo el procedimiento y el investigador debe tratar de ser rápido y preparar suspensiones de la célula, especialmente cuando l....

Resultados

Para investigar la expresión de Nrp1 y Helios en células tTreg y pTreg, preparamos las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones del cabeceo de normoglucémicos y teñido con los marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios y Nrp1 para citometría de flujo Análisis. Los resultados fueron analizados como se muestra en el representante gating estrategias (figura 1). Encontramos que la proporción de células de Helios⁺ entre CD4^+.......

Discusión

En este estudio, aislado de las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones NOD e investigado la expresión de Helios y Nrp1 en CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg células mediante citometría de flujo. En el presente estudio, se utilizaron ratones NOD, que es un modelo murino de diabetes tipo 1. En un estudio anterior, hemos utilizado el cepas tipo salvaje ratón CD-1 y ratones C57BL/6 investigar si Helios o Nrp1 es un mejor marcador para distinguir las células tTreg de células .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones			Empanado interno
HBSS	Statens veterinä rmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Juego de tampones de tinción de factor de transcripción	ThermoFisher	00-5523-00	contiene concentrado de fijación/permeabilización, diluyente de fijación/permeabilización y tampón de permeabilización (10x)
tampón de tinción de citometría de flujo eBioscience	ThermoFisher	00-4222-26
Anticuerpo monoclonal CD4 (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
Anticuerpo monoclonal CD25 (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen  APC-H7 Rata anti-Ratón CD8a	BD Biosciences	560182
Neuropilin-1 de ratón Anticuerpo conjugado con APC	R& D Systems	FAB5994A
anticuerpo monoclonal FOXP3 (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-ratón/humano Anticuerpo Helios	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presión	CORNING	352235	A 35 µ m La malla de nailon está incorporada en el tapón a presión de doble posición
Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tubo 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Viales de centelleo desechables	WHEATON
Citometría de flujo	BD
Citómetro de flujo software de análisis	Inivai Technologies	Flowlogic

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