Immunology and Infection

Bestemmelse af regulerende T celle Subsets i Murine Thymus, pancreas afdrypning lymfeknude og milten ved hjælp af flowcytometri

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/58848

Zhengkang Luo¹, Lina Thorvaldson¹, Martin Blixt¹, Kailash Singh¹

¹Department of Medical Cell Biology, Uppsala University

Summary

Heri, præsenterer vi en protokol for at forberede enkelt celler fra murine thymus, bugspytkirtlen afløb lymfeknude og milt til yderligere undersøgelse disse celler ved hjælp af flowcytometri. Derudover blev denne protokol brugt til bestemmelse af delmængder af regulerende T-celler ved hjælp af flowcytometri.

Abstract

Vores immunsystem består af et antal og en række af immunceller herunder regulerende T celler (langsomme) celler. Langsomme celler kan opdeles i to delmængder, thymic afledte langsomme (tTreg) celler og perifert induceret langsomme (pTreg) celler. De er til stede i forskellige organer i vores krop og kan være kendetegnet ved særlige markører, såsom Helios og Neuropilin 1. Det er blevet rapporteret, at tTreg celler er funktionelt mere undertrykkende end pTreg celler. Derfor er det vigtigt at bestemme andelen af både tTreg og pTreg celler, når undersøger heterogene cellepopulationer. Heri, indsamlet vi thymic kirtler, pancreas afdrypning lymfeknuder og milt fra normoglycemic ikke-fede diabetisk mus at skelne tTreg celler fra pTreg celler ved hjælp af flowcytometri. Vi forberedt manuelt enkelt celle suspensioner fra disse organer. Fluorokrom konjugeret overflade CD4, CD8, CD25, og Neuropilin 1 antistoffer blev brugt til at plette cellerne. De blev holdt i køleskabet natten over. Den næste dag, blev cellerne farves med fluorokrom konjugeret intracellulære Foxp3 og Helios antistoffer. Disse markører blev anvendt til at karakterisere de to delmængder af langsomme celler. Denne protokol viser en enkel men praktisk måde at forberede enkelt celler fra murine thymus, pancreas afdrypning lymfeknude og milt og bruge dem til efterfølgende flow cytometric analyse.

Introduction

Regulerende T (langsomme) celler er afgørende for homeostase af immunsystemet. Langsomme celler defineres af udtryk for overflade antigener CD4 og CD25 og transskription faktor forkhead boks P3 (Foxp3)¹^,²^,³. Sakaguchi et al. først viste at CD25 udtrykkes constitutively på T suppressor cellerne i mus⁴, som gav en banebrydende observation til identifikation af langsomme menneskeceller. Langsomme celler spiller en central rolle i immuntolerance ved at udøve en suppressiv evne via en række mekanismer, herunder cytolysis gennem udskillelsen af granzymes til at inducere apoptose, cytokin forbrug og hæmning gennem udtryk for cytotoksisk T-lymfocytter antigen 4⁵. Derudover kan de udskiller hæmmende cytokiner såsom omdanne vækst faktor beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) og IL-35⁵. Langsomme celler kan naturligvis være afledt af thymus, i hvilket tilfælde de er udpeget thymic afledte langsomme (tTreg) celler, eller de kan være fremkaldt i perifere organer i denne sag er kaldet perifert induceret langsomme (pTreg) celler.

Helios, et medlem af familien Ikaros transskription faktor var rapporteret til at være en markør for at skelne mellem tTreg celler og pTreg celler⁶. Senere, rapporterede to andre grupper, at Neuropilin 1 (Nrp1), en semaphorin III receptor, kunne tjene som en overflade markør for tTreg celler under visse betingelser⁷^,⁸. Ikke desto mindre har Singh et al. vist, at Helios er et bedre markør i denne sammenhæng i naive mus⁹.

Delmængder af langsomme celler spiller en central rolle i opretholdelsen af homøostase i immunsystemet og beskyttelse mod autoimmunitet og infektion. Derfor er det vigtigt at bestemme de tal og proportioner af disse befolkningsgrupper i både lymfoide og ikke-lymfoide væv. For at opnå dette, skal man forberede enkelt celle suspensioner fra disse organer. Et antal protokoller er beskrevet eller anvendt i tidligere undersøgelser. Hovedsagelig, har automatiske dissociators været anvendt i tidligere offentliggjorte rapporter¹⁰^,¹¹. Ved hjælp af automatiske dissociators er praktisk og tidsbesparende, men det er en dyr procedure. Derfor har vi brugt en manuel metode for at forberede enkelt celle suspensioner fra murine thymic kirtler, milt og bugspytkirtlen afdrypning lymfeknuder (PDLNs) fra normoglycemic ikke-fede diabetisk (Nik) mus og isolerede enkelte celler fra disse organer. Denne metode har været brugt i vores tidligere undersøgelser og vi fandt, at den manuelle metode til forberedelse af enkelt cellesuspension er så effektiv som automatisk dissociator metode⁹^,¹²^,¹³^,¹⁴. Desuden, vi brugt flowcytometri for at bestemme andelen af CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ langsomme celler og delmængder af langsomme celler tTreg og pTreg celler. TTreg og pTreg cellerne var kendetegnet ved hjælp af Helios og Nrp1 som markører for tTreg celle. Således, vores resultater viser, at den manuelle metode til forberedelse af de enkelte celler fungerer effektivt og forberedt enkelt celle suspensioner kan yderligere bruges til undersøgelser, flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den lokale Dyreetik ved Uppsala Universitet vedtaget af dyreforsøg.

1. høst organer fra dyr

Ofre mus af cervikal dislokation.
Placer thymic kirtler og milt i 20 mL scintillationshætteglas eller 15 mL konisk rør fyldt med 5 mL af Hanks´ afbalanceret saltopløsning (HBSS). Sted PDLNs i 1.5 mL micro rør fyldt med 1 mL af RPMI 1640. Bruge hele thymus og milt, og alle PDLNs.
Bemærk: Organer bør opbevares på is i hele proceduren, og investigator skal prøve at være hurtig samtidig med at forberede enkelt celle suspensioner, især når håndtering thymic væv, da thymic immunceller kan hurtigt nedbrydes ved høje temperaturer.

2. enkelt celle Isolation fra Thymus og milt

Grundigt klemme thymus og milt med et par pincet til at frigive de immunceller. Kassér den resterende thymic og milt kapsel.
Overføre cellesuspension til en 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C til at danne en pellet. Supernatanten.
For at lyse røde blodlegemer, resuspend cellesuspension i 5 mL 0,2 M NH₄Cl og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Vend rør hovedet forsigtigt hver 2 min. tilføje 5 mL af HBSS i slutningen af inkubation at stoppe lysering.
Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i ca. 5 mL HBSS. Fylde rørene med HBSS.
Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i ca. 5 mL HBSS. Fylde rørene med HBSS.
Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i i 5 mL HBSS til thymus og 10 mL for milt.
Overførsel 1 mL af thymic cellesuspension og 500 µL af milt cellesuspension til 5 mL runde nederste rør med celle si caps. Anvende cellesuspension til celle si caps.
Bemærk: En 35 µm nylon mesh er indarbejdet i fælles landbrugspolitik. Ca 5-10 millioner celler blev indsamlet i hver tube.

3. enkelt celle Isolation fra PDLN

Placer en steril 250 µm metalnet over en 15 mL konisk slange i en rack. Skyl trådnet med 1 mL af RPMI.
Overføre lymfeknuder til den metalnet og male dem gennem den trådnet med en pincet. Anvende 1 mL af RPMI på metalnet til at skylle cellerne ind i røret. Gentag 3 gange mere og fjerne trådnet.
Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i ca. 5 mL RPMI. Fylde rørene med RPMI.
Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i ca. 5 mL RPMI. Fylde rørene med RPMI.
Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i 2 mL af RPMI. Overførsel 2 mL af cellesuspension til 5 mL rund bund rør med celle si caps. Anvende cellesuspension til celle si caps.

4. flowcytometri

Centrifugeres celle suspensioner fra thymus, PDLN og milten ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Pletten celler med de følgende overfladen antistoffer i 100 µL af flowcytometri farvning buffer (FACS buffer): 0,75 µg/100 µL FITC-konjugeret CD4 antistof, 0,60 µg/100 µL APC-H7-konjugeret CD8 antistof, 0,30 µg/100 µL PE-konjugeret CD25 antistof, 5 µL (1:20) APC-konjugeret Nrp1 antistof. Inkuber rør i isbad i 40 min.
Tilføje 200 µL af FACS buffer til hver tube. Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten. Gentage en gang mere.
Fix og permeabilize celler ved resuspending celle pellet i 500 µL af Permeabilization fiksation Buffer (PFB).
Bemærk: PFB fremstilles ved at blande 1 del af fiksering/Permeabilization koncentrat med 3 dele af fiksering/Permeabilization fortyndingsmiddel.
Holde rør i køleskab ved 4 ° C natten over.
Bemærk: En 1 h inkubation virker også.
Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i 500 µL af Permeabilization vask Buffer (PWB). Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Bemærk: PWB fremstilles ved at fortynde Permeabilization Buffer (10 x) til 1:10 med destilleret vand.
Pletten celler med de følgende intracellulære antistoffer i 100 µL af PWB: 0,30 µg/100 µL PE-Cy7-konjugeret Foxp3 antistof, 4 µL (1:25) PacificBlue-konjugeret Helios antistof. Inkuber rør på køl i 1 time.
Tilføje 500 µL af PWB til hvert rør. Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i 500 µL af PWB. Centrifugeres rør ved 433 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
Resuspenderes celle i 300 µL af FACS buffer.
Analysere celler på et flow Flowcytometret.
Gate enkelt cellerne baseret på Side Scatter-området, højde og bredde, og fremad Scatter-området, højde og bredde. Køre en million hændelser for analyse.
Eksportere FCS filer af eksperimenter og analysere dem ved hjælp af en flow flowcytometri analyzer software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undersøge udtrykket af Nrp1 og Helios på tTreg og pTreg celler, vi forberedt enkelt celler fra thymic kirtler, PDLNs og milt af normoglycemic hilsen mus og farvede dem med langsomme celle markører CD4, CD25, Foxp3, Helios og Nrp1 for flow cytometric analyse. Resultaterne blev analyseret som vist i den repræsentative gating strategier (figur 1). Vi fandt, at andelen af Helios⁺ celler blandt CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ langsomme celler var højere end i Nrp1⁺ celler i alle tre organer (figur 2A). Mere end 80% af de langsomme celler i thymus udtrykt Helios, der var højere end i PDLN og milt (figur 2A). Andelen af Nrp1⁺ celler blandt Helios⁺ langsomme celler var højere i PDLN end i thymus og milt (figur 2B). Fleste af Nrp1⁺ langsomme celler også udtrykt Helios og proportioner af Helios⁺ celler blandt Nrp1⁺langsomme celler i thymus og milt var højere end i PDLN (figur 2 c). Sammen, viser disse resultater, at Helios er et bedre markør til at opdage tTreg celler end Nrp1.

Figur 1: repræsentative gating strategier for flowcytometri. De levende enkelt celler var gated baseret på FSC og SSC. Derefter, celler blev yderligere låge til CD4 og CD8 udtryk. CD4⁺CD8^- celler blev yderligere gated for udtryk for CD25. Næste, CD4⁺CD8^-CD25⁺ celler var gated for Foxp3 udtryk. CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ langsomme celler var gated for Nrp1 eller Helios udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: udtryk for Nrp1 og Helios i langsomme celler i thymus, PDLN og milten. Fire 8 uger gamle ikke-diabetikere NOD mus blev ofret. Enkelt celler blev udarbejdet fra thymic kirtler, PDLNs og milt. Cellerne blev derefter farves med fluorokrom konjugerede antistoffer for flow cytometric analyse. (A) procentsatserne for Nrp1⁺ og Helios⁺ celler blandt CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ langsomme celler. (B) procentsatserne for Nrp1⁺ celler blandt Helios⁺ langsomme celler. (C) procentdelene af Helios⁺ celler blandt Nrp1⁺ langsomme celler. Resultaterne udtrykkes som middel ± SEM. ***p < 0,001. En-vejs ANOVA efterfulgt af Tukeys flere sammenligninger (A, B og C) og uparret t-test (A) blev udført. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse, vi isoleret enkelt celler fra thymic kirtler, PDLNs og milt af NOD mus, og undersøgte udtryk af Helios og Nrp1 i CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ langsomme celler ved hjælp af flowcytometri. I den nuværende undersøgelse, blev der brugt NOD mus, som er en murine model af type 1 diabetes. I en tidligere undersøgelse, har vi brugt vildtype mus stammer CD-1 og C57BL/6 mus til at undersøge, om Helios eller Nrp1 er en bedre markør for at skelne tTreg celler fra pTreg celler. I denne undersøgelse brugte vi en lignende protokol til at bestemme delmængder af langsomme celler i naive mus⁹. Vi fandt, at Helios er et bedre markør i denne sammenhæng. Derfor, heri vi brugte normoglycemic hilsen mus til at bekræfte vores tidligere konstatering i denne model og fundet, at resultaterne var i overensstemmelse med vores tidligere resultater¹⁰. Denne protokol giver en effektiv, men økonomisk måde at forberede enkelt celler og derefter bruge dem til flow cytometric analyse. Der er flere publicerede protokoller som enkelt celler er udarbejdet ved hjælp af en automatisk dissociator¹¹^,¹². I stedet for ved hjælp af en dissociator ved klemme thymic kirtler og milt manuelt og kasserer den resterende kapsel, kan vi undgå tilstedeværelsen af fibrøst væv i cellesuspension og sørg for cellesuspension hovedsageligt består af immunceller og rød blodlegemer. Derefter brugte vi NH₄Cl til lyse røde blodlegemer. Lysis varighed kan forlænges for et par minutter, hvis organer er større end den normale størrelse. Men lysis varighed bør ikke udvides alt for meget, ellers vil også være mængden immunceller. Det er vigtigt at lade cellesuspension gå gennem en fælles landbrugspolitik med celle si (eller andre tilsvarende celle filtre), til at forhindre tilstopning problemer under flowcytometri.

Arbejder i mørke anbefales når du arbejder med fluorokrom konjugerede antistoffer til at undgå længere udsættelse for lys. Vi Inkuber celler på isen for ekstracellulære og intracellulær farvning. Inkuberingen kan også gøres ved stuetemperatur til at tillade en hurtigere binding af antistoffer, men der er en risiko for uspecifik bindende.

Nogle intracellulære markører kræver stort antal celler til at give god signaler i flowcytometri. I betragtning af den lille størrelse af PDLNs, kræver slibning dem på et metalnet mere pleje at tillade en maksimal frigivelse af immunceller. Indsamling af mere PDLNs er også en måde at øge celle nummer. En anden begrænsning af denne protokol er at cellerne er fast og permeabilized for cytometric analyse, således de ikke kan bruges til efterfølgende funktionelle studier. Magnetisk sortering er en mulighed for at tillade funktionelle studier, hvis kun celleoverflademarkører er af interesse.

Denne protokol er blevet anvendt i andre musemodeller af autoimmunitet og kræft¹³^,¹⁴. Enkelt celle forberedelse er en grundlæggende, men nyttig teknik til at bestemme de karakteristiske træk af immunceller i forskellige immun organer. Ved hjælp af denne metode til enkelt celle forberedelse kan medføre nekrose, som kan resultere i faldende de samlede antal celler. Den spektrale overlapning af traditionelle flowcytometri begrænser antallet af markører, der kan registreres på samme tid. Derfor er flere paneler og store mængder af celler forpligtet til at erhverve et samlet immun profil. I fremtiden, kan dette løses ved udviklingen af masse flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Den foreliggende undersøgelse blev støttet økonomisk af det svenske Forskningsråd, EXODIAB, den svenske Diabetes Foundation, svenske barn Diabetes fond, SEB Diabetesfonden og O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Forfatterne vil gerne tak Per-Ola Carlsson og Stellan Sandler for deres støtte og diskussioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOD mice			In-house breading
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH₄Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
Disposable scintillation vials	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analysis software	Inivai Technologies	Flowlogic