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Immunology and Infection

मूरीन थाइमस, अग्नाशय Draining लिम्फ नोड और प्लीहा प्रवाह cytometry का उपयोग में नियामक टी सेल सबसेट का निर्धारण

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/58848
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medical Cell Biology, Uppsala University

Summary

इस के साथ साथ, हम एक से अधिक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद murine थाइमस, अग्नाशय draining लिम्फ नोड और प्लीहा प्रवाह cytometry का उपयोग कर आगे इन कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग नियामक टी कोशिकाओं के उपसेटों को निर्धारित करने के लिए किया गया था जो फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करते हैं ।

Abstract

हमारे प्रतिरक्षा प्रणाली नियामक टी कोशिकाओं (treg) कोशिकाओं सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक संख्या और विविधता के होते हैं । treg कोशिकाओं को दो सबसेट में बांटा जा सकता है, thymic व्युत्पंन treg (ttreg) कोशिकाओं और पेरीफेली प्रेरित treg (ptreg) कोशिकाओं । वे हमारे शरीर के विभिंन अंगों में मौजूद है और इस तरह के helios और neuropilin 1 के रूप में विशिष्ट मार्कर, द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । यह बताया गया है कि ttreg कोशिकाओं ptreg कोशिकाओं की तुलना में कार्यात्मक रूप से अधिक suppressive हैं. इसलिए, विषम कोशिका आबादी की जांच करते समय दोनों ttreg और ptreg कोशिकाओं के अनुपात का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस के साथ साथ, हम thymic ग्रंथियों, अग्नाशय के draining लिम्फ नोड्स और spleens भारी normoglycemic गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह चूहों से ttreg कोशिकाओं को प्रवाह cytometry का उपयोग कर ptreg कोशिकाओं में भेद एकत्र । हम मैंयुअल रूप से इन अंगों से एकल सेल निलंबन तैयार । fluorochrome संयुग्मित सतह सीडी 4, सीडी 8, CD25, और neuropilin 1 एंटीबॉडी कोशिकाओं को दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया । उन्हें रात भर फ्रिज में रखा गया । अगले दिन, कोशिकाओं को फ्लोरोक्रोम संयुग्मित इंट्राकोशिलर Foxp3 और हेलिओस एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया । इन मार्करों treg कोशिकाओं के दो सबसेट की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करता है एक सरल लेकिन व्यावहारिक तरीके से एक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए मूरीन थाइमस, अग्नाशय draining लिम्फ नोड और प्लीहा और उन्हें बाद में प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए उपयोग.

Introduction

नियामक टी (treg) कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रणाली के homeostasis के लिए महत्वपूर्ण हैं । treg कोशिकाओं की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित कर रहे हैं सतह एंटीजन सीडी 4 और CD25, और प्रतिलेखन कारक forkhead बॉक्स P3 (Foxp3)1,2,3. सकाळगुची एट अल. पहले पता चला है कि CD25 के संवैधानिक रूप से4चूहों, जो मानव treg कोशिकाओं की पहचान के लिए एक अग्रणी अवलोकन प्रदान में टी दमन कोशिकाओं पर व्यक्त किया है । treg कोशिकाओं को प्रतिरक्षा सहिष्णुता में एक केंद्रीय भूमिका निभाते तंत्र की एक किस्म के माध्यम से एक suppressive क्षमता exerting, के माध्यम से cytolysis सहित साइटोलिसिस, एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए, cytolysis उपभोग और cytolysis की अभिव्यक्ति के माध्यम से निषेध टी-लिम्फोसाइट एंटिजेन 45. इसके अतिरिक्त, वे इस तरह के विकास कारक बीटा (tgf-β), interleukin-10 (आईएल-10) और आईएल-३५5बदलने के रूप में निरोधात्मक साइटोकिन्स छिपाना कर सकते हैं । treg कोशिकाओं स्वाभाविक रूप से थाइमस से प्राप्त किया जा सकता है, जो मामले में वे thymus व्युत्पन्न treg (ttreg) कोशिकाओं को नामित कर रहे हैं, या वे उस मामले में परिधीय अंगों में प्रेरित किया जा सकता है कहा जाता है पेरिफेल्ली प्रेरित treg (ptreg) कोशिकाओं.

हेलिओस, ikaros ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर परिवार के एक सदस्य, ttreg कोशिकाओं और ptreg6कोशिकाओं के बीच भेद के लिए एक मार्कर होने की सूचना दी गई थी । बाद में, दो अन्य समूहों की रिपोर्ट है कि neuropilin 1 (Nrp1), एक सेमाफोरिन III रिसेप्टर, कुछ शर्तों के तहत ttreg कोशिकाओं के लिए एक सतह मार्कर के रूप में सेवा कर सकता7,8. फिर भी, सिंह एट अल. पता चला है कि helios भोले चूहों9में इस संदर्भ में एक बेहतर मार्कर है ।

treg कोशिकाओं के सबसेट प्रतिरक्षा प्रणाली के homeostasis के रखरखाव में और autoimmunity और संक्रमण के खिलाफ संरक्षण में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । इसलिए, यह दोनों लिम्फोइड और गैर-लसीकाभ ऊतकों में इन आबादी की संख्या और अनुपात निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसे हासिल करने के लिए, एक को इन अंगों से एकल सेल निलंबन की तैयारी करनी है । पिछले अध्ययनों में कई प्रोटोकॉलों का वर्णन या उपयोग किया गया है । मुख्य रूप से, स्वचालित dissociators पहले प्रकाशित रिपोर्टों10,11में इस्तेमाल किया गया है । स्वचालित dissociators का उपयोग सुविधाजनक और समय की बचत है, लेकिन यह एक महंगी प्रक्रिया है । इसलिए, हम एक मैनुअल विधि का इस्तेमाल किया है एक सेल निलंबन से मूर्तीने thymic ग्रंथियों, अग्नाशई draining लिम्फ नोड्स (pdlns) और normoglycemic गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (मंजूरी) चूहों से spleens भारी तैयार करने के लिए, और इन अंगों से अलग एकल कोशिकाओं । यह विधि हमारे पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है और हमने पाया है कि एकल सेल निलंबन की तैयारी के लिए मैनुअल विधि स्वचालित वियोजन विधि9,12,13,14के रूप में के रूप में कुशल है । इसके अलावा, हम फ्लो cytometry का इस्तेमाल किया सीडी 4 के अनुपात निर्धारित करने के लिए+सीडी 8-CD25+Foxp3+ treg कोशिकाओं और treg कोशिकाओं ttreg और ptreg कोशिकाओं के सबसेट । ttreg और ptreg कोशिकाओं का उपयोग कर प्रतिष्ठित थे helios और Nrp1 के रूप में मार्कर के लिए ttreg सेल. इस प्रकार, हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि एकल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए मैनुअल विधि कुशलता से काम करता है और तैयार एकल सेल निलंबन आगे प्रवाह cytometry का उपयोग कर अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

उप्साला विश्वविद्यालय में स्थानीय पशु नैतिकता समिति ने पशु प्रयोगों को मंजूरी दी.

1. पशुओं से अंगों की कटाई

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों बलिदान ।
  2. में thymic ग्रंथियों और spleens भारी प्लेस 20 मिलीलीटर प्रस्फुरण वाइल्स या 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के 5 मिलीलीटर से भरा hanks ́ संतुलित नमक समाधान (hbss) । १.५ मिलीलीटर माइक्रो ट्यूबों में प्लेस pdlns 1 मिलीलीटर rpmi १६४० के साथ भरा हुआ है । पूरे थाइमस और प्लीहा का उपयोग करें, और सभी pdlns ।
    नोट: अंगों प्रक्रिया भर में बर्फ पर रखा जाना चाहिए और जांचकर्ता तेजी से होने की कोशिश करनी चाहिए, जबकि एकल सेल निलंबन की तैयारी, विशेष रूप से जब thymic प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बाद से thymic ऊतक हैंडलिंग जल्दी से उच्च तापमान पर अपमानित किया जा सकता है ।

2. थाइमस और प्लीहा से एकल कोशिका अलगाव

  1. अच्छी तरह से चिमटी की एक जोड़ी के साथ थाइमस और प्लीहा निचोड़ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को रिहा करने के लिए । शेष thymic और प्लीहा कैप्सूल छोड़ें ।
  2. एक गोली के रूप में 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रिप करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । सुपरनांट को त्याग दें ।
  3. लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे करने के लिए, ०.२ मीटर एनएच4सीएल के 5 मिलीलीटर में सेल निलंबन resuspend और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते । ट्यूबों उल्टा धीरे हर 2 मिनट । ऊष्मायन के अंत में hbss के 5 मिलीलीटर जोड़ें lysis को रोकने के लिए ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  5. hbss के लगभग 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । hbss के साथ ट्यूबों भरें ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  7. hbss के लगभग 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । hbss के साथ ट्यूबों भरें ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  9. थाइमस के लिए 5 मिलीलीटर और तिल्ली के लिए 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
  10. thymic सेल निलंबन और ५०० μl प्लीहा सेल निलंबन की सेल छलनी टोपी के साथ 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों के लिए 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । कक्ष के निलंबन को सेल छलनी कैप्स पर लागू करें ।
    नोट: एक ३५ μm नायलॉन जाल टोपी में शामिल किया गया है । प्रत्येक ट्यूब में लगभग 5-10 लाख कोशिकाएँ एकत्र की गई थीं.

3. pdln से एकल सेल अलगाव

  1. एक रैक में एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक बाँझ २५० μm धातु जाल प्लेस । rpmi के 1 मिलीलीटर के साथ जाल कुल्ला ।
  2. धातु जाल को लिम्फ नोड्स स्थानांतरण और चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग कर जाल के माध्यम से उन्हें पीसने । ट्यूब में कोशिकाओं को फ्लश करने के लिए धातु जाल पर rpmi की 1 मिलीलीटर लागू करें । 3 बार दोहराएं और मेष निकालें ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  4. rpmi के लगभग 5 मिलीलीटर में सेल पेलेट resuspend । rpmi के साथ ट्यूबों भरें ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  6. rpmi के लगभग 5 मिलीलीटर में सेल पेलेट resuspend । rpmi के साथ ट्यूबों भरें ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  8. rpmi के 2 मिलीलीटर में सेल पेलेट resuspend । सेल छलनी टोपी के साथ 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों के लिए सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर स्थानांतरण । कक्ष के निलंबन को सेल छलनी कैप्स पर लागू करें ।

4. फ्लो साइटोमेट्री

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर थाइमस, पीडीएलएन और प्लीहा से सेल निलंबन । सुपरनांट को त्याग दें ।
  2. १०० μl प्रवाह cytometry धुंधला बफर (facs बफर) में निम्नलिखित सतह एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को दाग: ०.७५ μg/100 μl fitc-संयुग्मित सीडी 4 एंटीबॉडी, ०.६० μg/100 μl apc-H7-संयुग्मित सीडी 8 एंटीबॉडी, ०.३० μg/100 μl पीई-संयुग्मित CD25 एंटीबॉडी, 5 μl (1:20) apc-संयुग्मित Nrp1 एंटीबॉडी. ४० मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब सेते हैं ।
  3. प्रत्येक ट्यूब के लिए facs बफर के २०० μl जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें । एक और समय दोहराएं ।
  4. फिक्स और permeabilize निर्धारण बफर (pfb) के ५०० μl में सेल गोली resuspending द्वारा कोशिकाओं को पारगम्यमान ।
    नोट: pfb निर्धारण/permeabilization के 3 भाग के साथ ध्यान केंद्रित करने का 1 हिस्सा मिश्रण द्वारा तैयार किया जाता है/
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रिज में ट्यूबों रखें ।
    नोट: एक 1 ज ऊष्मायन भी काम करता है ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  7. permeabilization वाशिंग बफर (pwb) के ५०० μl में सेल गोली resuspend । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
    नोट: pwb के आसुत पानी में 1:10 करने के लिए permeabilization बफर (10x) को पतला करके तैयार किया जाता है ।
  8. pwb के १०० μl में निम्नलिखित इंट्रासेलर एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को दाग: ०.३० μg/100 μl पीई-Cy7-संयुग्मित Foxp3 एंटीबॉडी, 4 μl (1:25) pacificblue-संयुग्मित helios एंटीबॉडी । 1 ज के लिए बर्फ पर ट्यूब सेते हैं ।
  9. प्रत्येक ट्यूब के लिए pwb के ५०० μl जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  10. pwb के ५०० μl में सेल गोली resuspend । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४३३ एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रेसेज । सुपरनांट को त्याग दें ।
  11. facs बफर के ३०० μl में सेल पेलेट resuspend ।
  12. एक प्रवाह साइटोमीटर पर कोशिकाओं का विश्लेषण.
  13. गेट सिंगल सेल साइड कैटरिंग-क्षेत्र, ऊंचाई और चौड़ाई, और आगे तितर-बितर क्षेत्र, ऊंचाई और चौड़ाई के आधार पर । विश्लेषण के लिए १,०००,००० इवेंट चलाएं ।
  14. प्रयोगों की FCS फ़ाइलों को निर्यात और एक प्रवाह cytometry विश्लेषक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उन्हें विश्लेषण.

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Representative Results

ttreg और ptreg कोशिकाओं पर Nrp1 और helios की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, हम thymic ग्रंथियों, pdlns और normoglycemic मंजूरी चूहों की spleens भारी से एकल कोशिकाओं को तैयार किया और उन्हें treg सेल मार्करों सीडी 4, CD25, Foxp3, helios और Nrp1 के साथ प्रवाह cytometric के लिए दाग विश्लेषण. परिणाम के रूप में प्रतिनिधि gating रणनीतियों में दिखाया गया विश्लेषण किया गया (चित्रा 1). हमने पाया है कि हेलिओस का अनुपात+ सीडी 4+सीडी 8-CD25+Foxp3 के बीच + treg कोशिकाओं के सभी तीन अंगों में Nrp1+ कोशिकाओं की तुलना में अधिक था (चित्रा 2a) । थाइमस में treg कोशिकाओं के ८०% से अधिक helios, जो pdln और प्लीहा (चित्रा 2a) की तुलना में अधिक था व्यक्त की । हेलिओस+ treg कोशिकाओं के बीच Nrp1+ कोशिकाओं का अनुपात थाइमस और प्लीहा (चित्रा 2b) में उन की तुलना में pdln में अधिक था । Nrp1+ treg कोशिकाओं के बहुमत भी helios व्यक्त की है, और Nrp1 के बीच में हेलिओस+ कोशिकाओंके अनुपात + थाइमस और तिल्ली में treg कोशिकाओं कि pdln (चित्रा 2c) में अधिक थे । एक साथ, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि helios Nrp1 से ttreg कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक बेहतर मार्कर है.

Figure 1
चित्रा 1: प्रवाह cytometry के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीतियों । जी एकल कोशिकाओं fsc और एसएससी के आधार पर gated थे । फिर, कोशिकाओं सीडी 4 और सीडी 8 अभिव्यक्ति के लिए आगे gated थे । सीडी 4+सीडी 8- कोशिकाओं को आगे CD25 की अभिव्यक्ति के लिए gated थे । अगले, सीडी 4+सीडी 8-CD25+ कोशिकाओं Foxp3 अभिव्यक्ति के लिए gated थे । सीडी 4+सीडी 8-CD25+Foxp3+ treg कोशिकाओं Nrp1 या helios अभिव्यक्ति के लिए gated थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: थाइमस, pdln और प्लीहा में treg कोशिकाओं में Nrp1 और helios की अभिव्यक्ति । चार 8 सप्ताह पुरानी गैर मधुमेह की मंजूरी चूहों बलिदान किया गया । एकल कोशिकाओं thymic ग्रंथियों, pdlns और spleens से तैयार किए गए थे । कोशिकाओं को तो प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए फ्लोरोक्रोम संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे । (A) Nrp1+ और helios+ के बीच की कोशिकाओं के प्रतिशत 4 सीडी 4+सीडी 8-CD25+Foxp3+ treg कोशिकाओं. (ख) हेलिओस+ treg कोशिकाओं के बीच Nrp1+ कोशिकाओं के प्रतिशत । (ग) Nrp1+ treg कोशिकाओं के बीच हेलिओस+ कोशिकाओं के प्रतिशत । परिणाम के रूप में व्यक्त कर रहे है ± SEM. * * *p < ०.००१ । एक तरफा anova के बाद tukey के कई तुलना (ए, बी और सी) और अयुग्मित टी परीक्षण (ए) किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम thymic ग्रंथियों से एकल कोशिकाओं पृथक, pdlns और मंजूरी चूहों की spleens भारी, और की अभिव्यक्ति की जांच की helios और Nrp1 में सीडी 4+सीडी 8-CD25+Foxp3+ treg कोशिकाओं प्रवाह cytometry का उपयोग. वर्तमान अध्ययन में, मंजूरी चूहों का इस्तेमाल किया गया था, जो टाइप 1 मधुमेह का एक मुरीन मॉडल है । पिछले एक अध्ययन में, हम जंगली प्रकार माउस उपभेदों सीडी-1 और C57BL/6 चूहों की जांच करने के लिए कि क्या helios या Nrp1 ptreg कोशिकाओं से ttreg कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक बेहतर मार्कर है इस्तेमाल किया है । उस अध्ययन में, हम भोले चूहों9में treg कोशिकाओं के उपसेट का निर्धारण करने के लिए एक समान प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया. हमने पाया है कि helios इस संदर्भ में एक बेहतर मार्कर है । इसलिए, इस के साथ साथ हम इस मॉडल में हमारे पहले खोजने की पुष्टि करने के लिए normoglycemic मंजूरी चूहों का इस्तेमाल किया और पाया कि परिणाम हमारे पिछले10परिणामों के साथ संगत थे. यह प्रोटोकॉल एकल कोशिकाओं को तैयार करने और बाद में उन्हें प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए एक कुशल, अभी तक किफायती तरीका प्रदान करता है । कई प्रकाशित प्रोटोकॉल है जिसमें एकल कोशिकाओं को एक स्वत: वियोजन11,12का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं । इसके बजाय एक dissociator का उपयोग कर, thymic ग्रंथियों और spleens भारी मैंयुअल रूप से निचोड़ा और शेष कैप्सूल discarding द्वारा, हम सेल निलंबन में रेशेदार ऊतक की उपस्थिति से बचने और सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन मुख्य रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं और लाल से बना है कर सकते है रक्त कोशिकाओं । हम तो लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे करने के लिए एनएच4सीएल का इस्तेमाल किया । यदि अंगों को सामान्य आकार से बड़ा किया जाए तो कुछ और मिनटों के लिए lysis की अवधि को बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, lysis अवधि बहुत ज्यादा नहीं बढ़ाया जाना चाहिए, अन्यथा प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी lysed किया जाएगा. यह सेल निलंबन सेल छलनी के साथ एक टोपी के माध्यम से जाने के लिए महत्वपूर्ण है (या अन्य समकक्ष सेल फिल्टर), प्रवाह cytometry के दौरान रोकना समस्याओं को रोकने के लिए.

अंधेरे में काम करने की सिफारिश की है जब फ्लोरोक्रोम संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ काम करने के लिए प्रकाश के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचने. हम कोशिकीय और इंट्रासेलर धुंधला के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं । एंटीबॉडी के तेजी से बाध्यकारी होने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन भी किया जा सकता है, लेकिन अविशिष्ट बाध्यकारी का खतरा है ।

कुछ इंट्राकोशिलर मार्कर कोशिकाओं की बड़ी संख्या प्रवाह cytometry में अच्छा संकेत देने के लिए की आवश्यकता है । pdlns के छोटे आकार को देखते हुए, उंहें एक धातु जाल पर पीसने के लिए और अधिक देखभाल की आवश्यकता के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक अधिकतम रिहाई की अनुमति । अधिक pdlns का संग्रह भी सेल संख्या बढ़ाने के लिए एक तरीका है । इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा है कि कोशिकाओं को स्थिर और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए permeabilized हैं, इस प्रकार वे बाद में कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । चुंबकीय छंटाई कार्यात्मक अध्ययन की अनुमति के लिए एक विकल्प है अगर केवल सतह मार्कर ब्याज की हैं ।

इस प्रोटोकॉल autoimmunity और कैंसर13,14के अंय माउस मॉडल में लागू किया गया है । एकल कोशिका तैयारी विभिन्न प्रतिरक्षा अंगों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए एक बुनियादी लेकिन उपयोगी तकनीक है । सिंगल सेल तैयारी के लिए इस विधि का उपयोग करने से परिगलन हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं की कुल संख्या कम हो सकती है । पारंपरिक प्रवाह cytometry के वर्णक ओवरलैप मार्कर है कि एक ही समय में पता लगाया जा सकता है की संख्या को सीमित करता है । इसलिए, कई पैनलों और कोशिकाओं की बड़ी संख्या के लिए एक समग्र प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । भविष्य में, यह जन cytometry के विकास से दूर किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

वर्तमान अध्ययन वित्तीय स्वीडिश अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था, exodiab, स्वीडिश मधुमेह फाउंडेशन, स्वीडिश बाल मधुमेह कोष, seb diabetesfonden और o.e. och एडला जोहान्ससंस vetenskapliga stiftelse. लेखकों को भी प्रति धंयवाद-ओला carlsson और स्टेलन sandler उनके समर्थन करता है और चर्चा के लिए करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD mice In-house breading
HBSS Statens veterinärmedicinska anstalt 991750
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R0883-500ML
NH4Cl EMD Millipore 1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher 00-5523-00 Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer ThermoFisher 00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience ThermoFisher 11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience ThermoFisher 12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a BD Biosciences 560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody R&D Systems FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience ThermoFisher 25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody BioLegend 137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap CORNING 352235 A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP Sarstedt 62.554.002
Micro tube 1.5 mL Sarstedt 72.690.001
Disposable scintillation vials WHEATON
Flow cytometry BD
Flow cytometry analysis software Inivai Technologies Flowlogic

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References

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Luo, Z., Thorvaldson, L., Blixt, M., … More

Luo, Z., Thorvaldson, L., Blixt, M., Singh, K. Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (144), e58848, doi:10.3791/58848 (2019).

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