Immunology and Infection

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/58848

Zhengkang Luo¹, Lina Thorvaldson¹, Martin Blixt¹, Kailash Singh¹

¹Department of Medical Cell Biology, Uppsala University

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas Entwässerung Lymphknoten und Milz, weiter zu studieren diese Zellen mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll verwendet zur Bestimmung der Teilmengen von regulatorischen T-Zellen mit Durchflusszytometrie.

Abstract

Unser Immunsystem besteht aus einer Zahl und Vielfalt der immunen Zellen einschließlich der regulatorische T-Zellen (Treg)-Zellen. Treg-Zellen können in zwei Untergruppen, Zebrafischembryonen abgeleiteten Treg (tTreg) und peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen unterteilt werden. Sie befinden sich in verschiedenen Organen unseres Körpers und durch spezifische Marker, wie Helios und Neuropilin 1 unterschieden werden können. Es wurde berichtet, dass tTreg Zellen funktionell mehr suppressive als pTreg Zellen sind. Daher ist es wichtig, den Anteil der tTreg und pTreg Zellen zu bestimmen, bei der Untersuchung von heterogenen Zellpopulationen. Hier sammelten wir Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten und Milz von Normoglycemic nicht adipösen diabetischen Mäusen tTreg Zellen aus pTreg Zellen mittels Durchflusszytometrie zu unterscheiden. Wir vorbereitet manuell einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen. Fluorochrom konjugiert Oberfläche CD4, CD8, CD25 und Neuropilin-1 Antikörper wurden verwendet, um die Zellen zu beflecken. Sie waren über Nacht im Kühlschrank aufbewahren. Am nächsten Tag waren die Zellen mit intrazellulären Foxp3 und Helios Antikörper konjugiert Fluorochrom befleckt. Diese Markierungen wurden verwendet, um die zwei Teilmengen von Treg-Zellen zu kennzeichnen. Dieses Protokoll zeigt eine einfache aber praktische Möglichkeit, einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz vorbereiten und verwenden Sie sie für spätere durchflusszytometrischen Analyse.

Introduction

Regulatorische (Treg) T-Zellen sind entscheidend für die Homöostase des Immunsystems. Treg-Zellen werden durch die Expression von Oberflächenantigenen CD4 und CD25 und die Transkription Faktor Forkhead Box P3 (Foxp3)¹^,²^,³definiert. Sakaguchi Et Al. zeigten erstmals, dass CD25 auf T-Suppressor-Zellen in Mäusen⁴konstitutiv exprimiert wird, die eine bahnbrechende Beobachtung für die Identifizierung des menschlichen Treg-Zellen zur Verfügung gestellt. Treg-Zellen spielen eine zentrale Rolle im Immuntoleranz durch gleichzeitiges eine unterdrückende Fähigkeit über eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich Zytolyse durch die Sekretion von Granzymen induzieren Apoptose, Zytokin-Verbrauch und Hemmung durch den Ausdruck von zytotoxischen T-Lymphozyten Antigen 4⁵. Darüber hinaus können sie hemmende Zytokine wie z. B. die Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β), Interleukin-10 (IL-10) und IL-35⁵absondern. Treg Zellen natürlich abgeleitet werden aus dem Thymus, in diesem Fall sind sie Zebrafischembryonen abgeleitete Treg (tTreg) Zellen bezeichnet, oder in diesem Fall nennt man peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen in den peripheren Organen induziert werden.

Helios, ein Mitglied der Adelsfamilie Ikaros Transkription Faktor wurde berichtet, dass ein Marker für die Unterscheidung zwischen tTreg Zellen und pTreg Zellen⁶. Zwei andere Gruppen berichtete später, dass Neuropilin 1 (Nrp1), ein semaphorin-III-Rezeptor als Oberfläche Marker für tTreg Zellen unter bestimmten Bedingungen⁷^,⁸dienen könnte. Dennoch haben Singh Et Al. gezeigt, dass Helios eine bessere Markierung in diesem Zusammenhang in naive Mäuse⁹.

Die Teilmengen von Treg-Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Immunsystems und den Schutz gegen Autoimmunität und Infektionen. Daher ist es wichtig, die Zahlen und Proportionen dieser Populationen in lymphatischen und nicht-lymphatischen Gewebe zu bestimmen. Um dies zu erreichen, muss man sich einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen vorzubereiten. Eine Reihe von Protokollen wurden beschrieben oder in früheren Studien verwendet. Vor allem, wurden automatische Dissociators in zuvor veröffentlichten Berichte¹⁰^,¹¹verwendet. Mit automatischen Dissociators ist bequem und zeitsparend, aber es ist ein teures Verfahren. Daher haben wir eine manuelle Methode verwendet, um einzelne Zellsuspensionen von murinen Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten (PDLNs) und Milz von Normoglycemic nicht adipösen Diabetiker (NOD) Mäuse und isolierte Einzelzellen aus diesen Organen vorzubereiten. Mit dieser Methode in unserer früheren Studien und wir fanden, dass die manuelle Methode für die Zubereitung von einzelnen Zellsuspension so effizient wie automatische Dissociator Methode⁹^,¹²^,¹³^,¹⁴. Darüber hinaus wir Durchflusszytometrie verwendet, um die Proportionen der CD4 bestimmen⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg Zellen und die Teilmengen von Treg-Zellen tTreg und pTreg Zellen. Die tTreg und pTreg Zellen wurden ausgezeichnet mit Helios und Nrp1 als Marker für tTreg Zelle. So zeigen unsere Ergebnisse, dass die manuelle Methode für die Vorbereitung der einzelnen Zellen effizient funktioniert und vorbereitete Einzelzelle Suspensionen können weiter verwendet werden, für Studien mit Durchflusszytometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Die lokalen Tier Ethikkommission an der Universität Uppsala genehmigt die Tierversuche.

1. Ernte Organe von Tieren

Die Mäuse durch zervikale Dislokation zu opfern.
Zebrafischembryonen Drüsen zu platzieren und Milz in 20 mL funkeln Fläschchen oder 15 mL konische Röhrchen gefüllt mit 5 mL Hanks´ ausgewogenen Salzlösung (HBSS). Ort PDLNs in 1,5 mL Mikro Tuben gefüllt mit 1 mL RPMI 1640. Verwenden Sie die gesamte Thymus und Milz und der PDLNs.
Hinweis: Organe auf dem Eis während des Verfahrens aufbewahrt werden und die Ermittler sollten versuchen, schnell zu sein, während der Vorbereitung einzelner Zellsuspensionen, vor allem, wenn Zebrafischembryonen Gewebe zu behandeln, da Zebrafischembryonen Immunzellen bei hohen Temperaturen schnell abgebaut werden können.

(2) einzelne Zelle isoliert von Thymus und Milz

Drücken Sie gründlich die Thymusdrüse und Milz mit einer Pinzette die Immunzellen zu veröffentlichen. Die restlichen Zebrafischembryonen und Milz Kapsel zu verwerfen.
Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C, eine Kugel zu bilden. Verwerfen Sie den überstand.
Um die Erythrozyten zu lysieren, die Zellsuspension in 5 mL 0,2 M NH₄Cl Aufschwemmen und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. invertieren die Rohre auf den Kopf sanft alle 2 min. hinzufügen 5 mL von HBSS am Ende der Inkubationszeit, die Zerstörung zu stoppen.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Die Zelle Pellet in etwa 5 mL HBSS aufzuwirbeln. Füllen Sie die Rohre mit HBSS.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Die Zelle Pellet in etwa 5 mL HBSS aufzuwirbeln. Füllen Sie die Rohre mit HBSS.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Die Zelle Pellet in HBSS für Thymus 5 mL und 10 mL für Milz aufzuwirbeln.
Transfer 1 mL der Suspension Zebrafischembryonen Zelle und die Milz Zellsuspension auf 5 mL 500 µL Rundrohr unten mit Zelle Sieb Kappen. Wenden Sie die Zellsuspension auf die Zelle Sieb Kappen.
Hinweis: Die Kappe ist ein 35 µm-Nylon-Mesh integriert. Etwa 5 Millionen Zellen wurden in jedem Röhrchen gesammelt.

3. einzelne Zelle isoliert von PDLN

Legen Sie eine sterile 250 µm Metallgitter über eine 15 mL konische Rohr in einem Rack. Spülen Sie das Netz mit 1 mL RPMI.
Übertragen Sie die Lymphknoten auf das Metallgitter und Schleifen sie durch das Gitter mit der Pinzette. Tragen Sie 1 mL RPMI auf das Metallgitter, die Zellen in das Rohr zu spülen. 3 weitere Male wiederholen und das Netz zu entfernen.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Die Zelle-Pellets in etwa 5 mL RPMI aufzuwirbeln. Füllen Sie die Rohre mit RPMI.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Die Zelle-Pellets in etwa 5 mL RPMI aufzuwirbeln. Füllen Sie die Rohre mit RPMI.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Die Zelle Pellet in 2 mL RPMI aufzuwirbeln. Übertragung der Zellsuspension 2 mL bis 5 mL unten Rundrohr mit Zelle Sieb Kappen. Wenden Sie die Zellsuspension auf die Zelle Sieb Kappen.

4. die Durchflusszytometrie

Zentrifugieren der Zellsuspensionen von PDLN, Thymus und Milz bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Färben Sie die Zellen mit den folgenden Oberfläche Antikörper in 100 µL der Durchflusszytometrie Fleckenbildung Puffer (FACS-Puffer): 0,75 µg/100 µL CD4 FITC-konjugierten Antikörpern, 0,60 µg/100 µL APC-H7 konjugiert CD8 Antikörper, 0,30 µg/100 µL PE konjugiert CD25 Antikörper, 5 µL (01:20) APC-konjugiert Nrp1 Antikörper. Inkubieren Sie die Rohre für 40 min auf Eis.
Jedes Rohr 200 µL Puffer FACS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie noch einmal.
Fix und permeabilize der Zellen durch resuspending der Zelle Pellet in 500 µL der Permeabilisierung Fixierung Puffer (PFB).
Hinweis: PFB ist bereit, durch das Mischen von 1 Teil der Fixierung/Permeabilisierung mit 3 Teile Verdünnungsmittel Fixierung/Permeabilisierung konzentrieren.
Halten Sie die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht.
Hinweis: Eine 1 h Inkubation funktioniert auch.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL der Permeabilisierung waschen Puffer (PWB). Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Hinweis: PWB wird vorbereitet durch Verdünnung Permeabilisierung Puffer (10 X) um 01:10 in destilliertem Wasser.
Färben Sie die Zellen mit den folgenden intrazellulären Antikörper in 100 µL PWB: 0,30 µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-konjugierten Antikörpern, 4 µL (01:25) Helios PacificBlue konjugierten Antikörper. Inkubieren Sie die Rohre auf Eis für 1 h.
Jedes Rohr 500 µL PWB hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Die Zelle Pellet in 500 µL PWB aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
Die Zelle Pellet in 300 µL Puffer FACS aufzuwirbeln.
Analysieren Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer.
Die einzelnen Zellen basierend auf Side Scatter-Area, Höhe und Breite, und Forward Scatter-Fläche, Höhe und breite Tor. Führen Sie 1 Million Ereignisse für die Analyse.
Die FCS-Exportdateien von Experimenten und analysieren sie mit Hilfe einer Flow-Zytometrie-Analyzer-Software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Um den Ausdruck von Nrp1 und Helios auf tTreg und pTreg Zellen zu untersuchen, wir einzelne Zellen von Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz Normoglycemic NOD Mäuse vorbereitet und mit der Treg Zelle Marker CD4 und CD25, Foxp3, Helios Nrp1 für Durchfluss durchflusszytometrischen befleckt Analyse. Die Ergebnisse wurden analysiert, wie gezeigt, in der Vertreter gating Strategien (Abbildung 1). Wir fanden, dass den Anteil der Helios⁺ Zellen unter CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg Zellen war höher als die von Nrp1⁺ Zellen in allen drei Organen (Abbildung 2A). Mehr als 80 % der Treg-Zellen im Thymus ausgedrückt Helios, das war höher als in der PDLN und der Milz (Abbildung 2A). Der Anteil der Nrp1⁺ Zellen unter Helios⁺ Treg-Zellen lag in der PDLN über in den Thymus und Milz (Abb. 2 b). Die Mehrheit der Nrp1⁺ Treg Zellen auch ausdrückliche Helios und die Proportionen des Helios⁺ Zellen unter Nrp1⁺Treg-Zellen im Thymus und Milz waren höher als in der PDLN (Abbildung 2). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass Helios eine bessere Markierung tTreg Zellen als Nrp1 zu erkennen ist.

Abbildung 1: repräsentative gating Strategien für Durchflusszytometrie. Die einzigen lebenden Zellen wurden gated basierend auf FSC und SSC. Zellen wurden dann weitere für CD4 und CD8 Ausdruck bewachte. CD4⁺CD8^– Zellen wurden weiter für den Ausdruck von CD25 eingezäunt. Nächste, CD4⁺CD8^–CD25⁺ Zellen wurden gated für Foxp3 Ausdruck. CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg Zellen für Nrp1 oder Helios Ausdruck gated wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: der Ausdruck der Nrp1 und Helios in Treg-Zellen im Thymus und Milz PDLN. Vier 8 Wochen alten nicht-diabetischen NOD Mäuse geopfert wurden. Einzelne Zellen wurden von den Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz vorbereitet. Die Zellen wurden dann mit Fluorochrom konjugierten Antikörpern für durchflusszytometrischen Analyse gebeizt. (A) die Prozentsätze der Nrp1⁺ und Helios⁺ unter den CD4-Zellen⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg Zellen. (B) die Prozentsätze der Nrp1⁺ Zellen unter Helios⁺ Treg-Zellen. (C) die Prozentsätze der Helios⁺ Zellen unter Nrp1⁺ Treg Zellen. Ergebnisse werden ausgedrückt als Mittel ± SEM. ***p < 0,001. Einfache ANOVA gefolgt von Tukey multiple Vergleiche (A, B und C) und ungepaarten t-Tests (A) wurden durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dieser Studie wir isolierte Einzelzellen aus Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz von Mäusen, NICKEN, und untersucht den Ausdruck von Helios und Nrp1 in CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg Zellen mittels Durchflusszytometrie. In der vorliegenden Studie wurden NOD Mäuse verwendet, das heißt ein Mausmodell des Typ 1 Diabetes. In einer früheren Studie haben wir die Wildtyp-Maus-Stämmen CD-1 und C57BL/6 Mäusen verwendet, um zu untersuchen, ob Helios oder Nrp1 eine bessere Markierung tTreg Zellen aus pTreg Zellen zu unterscheiden ist. In dieser Studie haben wir ein ähnliches Protokoll der Teilmengen von Treg-Zellen in naive Mäuse⁹bestimmen. Wir fanden, dass Helios eine bessere Markierung in diesem Zusammenhang ist. Daher verwendeten hierin wir Normoglycemic NOD Mäusen bestätigen unsere frühere Feststellung in diesem Modell und fand, dass die Ergebnisse unserer bisherigen Ergebnisse¹⁰entsprächen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente und dennoch wirtschaftliche Möglichkeit zur Vorbereitung von Einzelzellen und anschließend für durchflusszytometrischen Analyse verwenden. Es gibt mehrere veröffentlichten Protokolle in der Einzelzellen vorbereitet sind mit einer automatischen Dissociator¹¹^,¹². Anstelle einer Dissociator durch Zusammendrücken der Zebrafischembryonen Drüsen und Milz manuell und verwerfen die restliche Kapsel können wir vermeiden, das Vorhandensein von Bindegewebe in die Zellsuspension und sicherstellen, dass die Zellsuspension besteht hauptsächlich aus Immunzellen und rot Blutkörperchen. Wir haben dann NH₄Cl lyse der roten Blutkörperchen. Die Dauer der Lyse kann für ein paar Minuten verlängert werden, wenn die Organe größer als die normale Größe sind. Jedoch die Lyse Dauer sollten nicht zuviel verlängert werden, sonst werden auch immune Zellen lysiert werden. Es ist wichtig, die Zellsuspension durch eine Kappe mit Zelle Sieb (oder andere gleichwertige Zelle-Filter), um Verstopfung Probleme zu vermeiden während Durchflusszytometrie gehen zu lassen.

Arbeiten in der Dunkelheit wird empfohlen bei der Arbeit mit Fluorochrom konjugierten Antikörpern, längere Lichteinwirkung zu vermeiden. Wir inkubieren die Zellen auf Eis für extrazellulären und intrazellulären Färbung. Die Inkubationszeit kann auch bei Raumtemperatur ermöglicht eine schnellere Bindung von Antikörpern durchgeführt werden, aber besteht die Gefahr der unspezifischen Bindung.

Einige intrazellulären Marker eine große Anzahl von Zellen, gute Signale in Durchflusszytometrie zu geben. Angesichts der geringen Größe des PDLNs, erfordert auf einem Metallgitter Schleifen mehr Sorgfalt erlauben eine maximale Freisetzung von Immunzellen. Sammeln mehr PDLNs ist auch eine Möglichkeit, die Anzahl von Zellen zu erhöhen. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist, dass die Zellen fixiert und permeabilized für durchflusszytometrischen Analyse, damit sie nicht für nachfolgende funktionelle Studien verwendet werden. Magnetische Sortierung ist eine Option, um funktionelle Studien zu ermöglichen, wenn nur Oberflächenmarker von Interesse sind.

Dieses Protokoll wurde in anderen Maus-Modellen von Autoimmunität und Krebs¹³^,¹⁴angewendet. Einzelne Zelle Vorbereitung ist eine einfache, aber nützliche Technik, die Merkmale von Immunzellen in verschiedenen Organen immun zu bestimmen. Mit dieser Methode für einzelne Zelle Vorbereitung möglicherweise Nekrose, die sich ergeben können, die Gesamtzahl der Zellen zu verringern. Die spektrale Überlappung der traditionellen Durchflusszytometrie begrenzt die Anzahl der Markierungen, die zur gleichen Zeit erkannt werden können. Daher sind mehrere Platten und eine große Anzahl von Zellen erforderlich, eine insgesamt immune Profil zu erwerben. In Zukunft kann dies durch die Entwicklung der Masse Zytometrie überwunden werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die vorliegende Studie wurde von der schwedischen Forschungsrat, EXODIAB, der schwedischen Diabetes Foundation, schwedische Kind Diabetes Fonds, SEB Diabetesfonden und O.E Och Edla Johanssons Vetenskapliga Stiftelse finanziell unterstützt. Autoren möchten Dank pro-Ola Carlsson und Stellan Sandler für ihre Unterstützung und Diskussionen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOD mice			In-house breading
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH₄Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
Disposable scintillation vials	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analysis software	Inivai Technologies	Flowlogic