Summary
ここで、マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓の研究をするこれらの細胞をフローサイトメトリーを排水から単一セルを準備するためのプロトコルを提案する.さらに、このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いた T 細胞のサブセットを決定するため使用されました。
Abstract
私たちの免疫システムは数と制御性 T 細胞 (Treg) 細胞を含む免疫細胞の多様性から成っています。Treg 細胞は末梢誘導 Treg (pTreg) 細胞、胸腺派生 Treg (tTreg) 細胞 2 つのサブセットに分けることができます。彼らは私たちの体のさまざまな器官に存在しており、ヘリオスなどニューロピリン 1 の特定のマーカーで区別することができます。TTreg 細胞 pTreg 細胞よりもより機能的に抑制されることが報告されています。したがって、異種細胞集団を調査するとき、tTreg と pTreg の両方の細胞の割合を調べることが重要です。ここで、フローサイトメトリーを用いた pTreg 細胞 tTreg 細胞を区別するために normoglycemic 非肥満糖尿病マウスから、胸腺腺、膵ドレイン リンパ節および脾臓を集めました。手動でこれらの器官からの単一細胞懸濁液をご用意しました。螢光色素共役表面 CD4, CD8, CD25 とニューロピリン 1 抗体を用いて細胞を染色します。彼らは一晩冷蔵庫で保管されました。次の日セルは共役螢光色素細胞内の Foxp3 とヘリオスの抗体で染色しました。これらのマーカーは、Treg 細胞の 2 つのサブセットの特性評価に使用されました。このプロトコルは、単純かつ実用的なマウス胸腺、膵リンパ節および脾臓を排水から単一セルを準備し、その後フローサイトメトリーによる解析のために使用する方法を示します。
Introduction
(Treg) T 細胞は免疫系の恒常性のために重要です。Treg 細胞は CD4 細胞表面抗原の発現と CD25、および転写因子フォーク ヘッド ボックス P3 (Foxp3)1,2,3によって定義されます。坂口らはまず、CD25 はマウス4、Treg 細胞を識別するための先駆的な観察を提供する T サプレッサー細胞の発現を示したことを示した。Treg 細胞さまざまな誘発アポトーシス、サイトカイン消費と細胞毒性の発現を抑制する granzymes の分泌を介して細胞崩壊を含むメカニズムを介して抑制能力を出すことによって免疫寛容で中心的な役割を再生します。T リンパ球抗原 45。さらに、成長因子 β (TGF-β)、インターロイキン 10 (IL-10) と IL-355変換など抑制性サイトカインを分泌することができます彼ら。Treg 細胞自然から派生できる胸腺胸腺の派生 (tTreg) Treg 細胞を指定されている場合、または場合は末梢細胞 Treg (pTreg) と呼ばれる、末梢臓器で誘導されることができます。
ヘリオス、イカロス転写因子ファミリーのメンバー報告された tTreg 細胞間の区別のマーカーと pTreg 細胞6。後、他の 2 つのグループは、セマフォリン III の受容体ニューロピリン 1 (Nrp1) が特定の条件7,8下 tTreg 細胞の表面マーカーとして役立つことができることを報告しました。それにもかかわらず、シンらはヘリオスが素朴なマウス9でこの文脈でより良いマーカーであることを示しています。
Treg 細胞のサブセットは、免疫系の恒常性維持、自己免疫や感染症に対する保護に極めて重要な役割を果たします。したがって、番号とリンパ系およびリンパ系組織でのこれらの人口の割合を決定することが重要です。これを達成するには、1 つはこれらの器官からの単一細胞懸濁液を準備するが。プロトコルの番号説明または以前の研究で使用されました。主に、自動 dissociators は、以前に発行されたレポート10,11で使用されています。自動 dissociators を使って使いやすく、時間の節約、それは高価な手順です。したがって、normoglycemic 非肥満の糖尿病 (NOD) マウス、およびこれらの器官から孤立 1 細胞からマウス胸腺腺、膵ドレイン リンパ節 (PDLNs) と脾臓から単一細胞懸濁液を準備する手動の方法を使いました。このメソッドは、我々 の以前の研究で使用されている、我々 は手動で単一細胞懸濁液を準備する方法は自動分解方法9,12,13,14と同じくらい効率的発見します。さらに、CD4 の割合を決定するためフローサイトメトリーを用いて+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 細胞 tTreg と pTreg の細胞の細胞と Treg のサブセット。TTreg 細胞のマーカーとしてヘリオスと Nrp1 を使用して tTreg と pTreg の細胞が区別されていました。したがって、我々 の結果を示す、単一のセルを準備するための手動の方法は効率的に働き、フローサイトメトリーを用いた研究の準備の単一細胞懸濁液をさらに使用できます。
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Protocol
ウプサラ大学のローカル動物倫理委員会は、動物実験を承認しました。
1. 動物の臓器を収穫
- 頚部転位によってマウスを犠牲に。
- 胸腺腺を置き、20 mL シンチレーション バイアルまたは 5 ml Hanks´ の 15 mL の円錐管に脾臓平衡塩類溶液 (HBSS)。1 ml RPMI 1640 の 1.5 mL のマイクロ チューブに場所 PDLNs。全体の胸腺と脾臓、およびすべての PDLNs を使用します。
注:プロシージャ全体で氷の上の臓器を収めるし、捜査官は胸腺の免疫細胞はすぐに高温で低下することがので胸腺組織を取り扱う際に特に単一細胞懸濁液を準備している間高速するみてください。
2. 単一のセル胸腺と脾臓から分離
- 徹底的に免疫細胞を解放するピンセットのペアと胸腺と脾臓を絞る。残りの胸腺と脾臓のカプセルを破棄します。
- 細胞懸濁液を 15 mL の円錐管、ペレットを形成するための 4 ° C で 5 分間 433 × gで遠心分離機に転送します。上清を捨てます。
- 赤い血液細胞を溶解するには、0.2 M NH4Cl の 5 mL の細胞懸濁液を再懸濁し、10 分反転チューブ逆さま優しく、溶解を停止する、インキュベーションの終わりに HBSS の 2 分を追加 5 mL 毎に室温で孵化させなさい。
- 4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- HBSS の約 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します。HBSS で管を埋めます。
- 4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- HBSS の約 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します。HBSS で管を埋めます。
- 4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- 胸腺 HBSS の 5 mL と 10 mL の脾臓の細胞ペレットを再懸濁します。
- 転送胸腺細胞懸濁液の 1 mL と 5 mL に脾細胞懸濁液 500 μ L はラウンド セル ストレーナー キャップ下部チューブです。細胞懸濁液をセル ストレーナー キャップに適用します。
注:35 μ m ナイロン メッシュは、キャップに組み込まれます。約 500 万セルは、各チューブに収集されました。
3 PDLN からつのセル隔離
- 滅菌 250 μ m の金属製のメッシュをラックに 15 mL の円錐管にかぶせます。1 ml RPMI のメッシュをすすいでください。
- リンパ節を金属メッシュに転送し、ピンセットのペアを使用してメッシュをそれらを挽きます。RPMI の 1 mL をチューブにセルをフラッシュする金属製のメッシュに適用します。3 回以上を繰り返し、メッシュを削除します。
- 4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- RPMI 約 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します。RPMI で管を埋めます。
- 4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- RPMI 約 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します。RPMI で管を埋めます。
- 4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- RPMI の 2 mL の細胞ペレットを再懸濁します。5 mL に転送細胞懸濁液 2 mL はラウンド セル ストレーナー キャップ下部チューブです。細胞懸濁液をセル ストレーナー キャップに適用します。
4. フローサイトメトリー
- 胸腺、PDLN、4 ° C で 5 分間 433 x gで脾臓細胞懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。
- フローサイトメトリー (FACS バッファー) を染色の 100 μ L 以下の表面抗体で細胞を染色: 0.75 μ g/100 μ L CD4 の FITC 結合抗体、0.60 μ g/100 μ L APC H7 共役 CD8 抗体、0.30 μ g/100 μ L PE 共役 CD25 抗体、5 μ L (1:20)APC 共役 Nrp1 抗体。40 分間氷の上管を孵化させなさい。
- 各チューブに FACS バッファーの 200 μ L を追加します。4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。あと 1 回を繰り返します。
- 修正し、細胞ペレットを 500 μ L の透過固定バッファー (PFB) で再によってセルを permeabilize します。
注:PFB は混合の固定/透過集中固定/透過希釈剤の 3 つの部分の 1 の部分によって準備されます。 - 冷蔵庫の中のチューブを 4 ° C で一晩保ちます。
注:1 時間インキュベーションも動作します。 - 4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- 500 μ L の透過洗浄バッファー (PWB) で細胞ペレットを再懸濁します。4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
注:プリント配線板は透過を希釈することによって準備される (10 倍) を 1:10 に蒸留水でバッファーします。 - プリント基板の 100 μ L 中次の細胞抗体と細胞を染色: 0.30 μ g/100 μ L PE Cy7 共役 Foxp3 抗体、4 μ L (1:25) PacificBlue 共役ヘリオス抗体。1 h の氷のチューブを孵化させなさい。
- 各管にプリント配線板の 500 μ L を追加します。4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- 500 μ L のプリント基板で細胞ペレットを再懸濁します。4 ° C で 5 分間 433 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨てます。
- FACS バッファーの 300 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。
- 流れの cytometer で細胞を分析します。
- ゲート側散布面積、高さ、幅、および前方の散布面積、高さと幅に基づいて単一のセルです。解析 100 万のイベントを実行します。
- 実験の FCS ファイルをエクスポートし、流れ cytometry アナライザ ソフトウェアを使用して分析します。
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Representative Results
Nrp1 と tTreg と pTreg のセルのヘリオスの発現を調べるためには、PDLNs と normoglycemic NOD マウスの脾臓、胸腺腺から単一セルを作製し、Treg 細胞マーカー CD4, CD25、Foxp3、ヘリオスと Nrp1 フロー フローサイトメトリーの染色解析。戦略 (図 1) をゲート代表で示すように、結果を分析されました。ヘリオス+ cd4 陽性細胞の割合を分かった+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 細胞は Nrp1 よりも高い+細胞のすべての 3 つの臓器 (図 2 a)。胸腺における Treg 細胞の 80% 以上は、PDLN および脾臓 (図 2 a) に比較してより高いヘリオスを表明しました。Nrp1 の割合+ヘリオス+ Treg 細胞では, 細胞は胸腺と脾臓 (図 2 b) でより高く、PDLN で。Nrp1 の大半+ Treg 細胞も表現されたヘリオス、ヘリオス+細胞 Nrp1 の中でプロポーション+Treg 細胞の胸腺と脾臓は PDLN (図 2) のそれよりも高かった。一緒に、ヘリオスが Nrp1 より tTreg 細胞を検出するより良いマーカーであることが示唆されました。
図 1: フローサイトメトリー用戦略をゲート代表します。生きている単一セルは、FSC と SSC に基づいてゲートだった。その後、細胞が CD4 および CD8 の式のゲートさらに。CD4+CD8-細胞がさらに CD25 の式のゲートします。次に、CD4+CD8-CD25+細胞は Foxp3 表現のゲートだった。CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 細胞は Nrp1 またはヘリオス式のゲートだった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Nrp1 および Treg 細胞胸腺, PDLN, 脾臓のヘリオス発現。4 つの 8 週齢非糖尿病 NOD マウスが犠牲になった。胸腺腺、PDLNs および脾臓から単一電池を作製しました。セルし、フローサイトメトリーによる解析のための共役螢光抗体で染色しました。(A) Nrp1 の割合+ヘリオス+ cd4 陽性細胞と CD8+-CD25+Foxp3+ Treg 細胞。(B) Nrp1 の割合ヘリオス+ Treg 細胞の中で細胞の+ 。(C) ヘリオス+の割合 Nrp1 細胞+ Treg 細胞。結果は ± SEM. の手段として表されます * * *p < 0.001。テューキーの多重比較 (A、B および C) 続いて一方通行 ANOVA と対になっていない t 検定 (A) を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、胸腺腺、PDLNs、NOD マウスの脾臓から単一細胞を分離し、ヘリオスと cd4 Nrp1 の発現を調べた+CD8-CD25+Foxp3+ Treg 細胞のフローサイトメトリーを用いたします。本研究ではタイプ 1 の糖尿病のマウスモデルである NOD マウスは使用されました。以前の研究では、ヘリオスまたは Nrp1 が pTreg 細胞 tTreg 細胞を識別するための良いマーカーであるかどうかを調査する c57bl/6 マウスと野生型マウス系統 CD 1 を使いました。その研究では、同様のプロトコルを使用して素朴なマウス9Treg 細胞のサブセットを決定します。ヘリオスがこの文脈でよりよいマーカーであることがわかった。したがって、ここ我々 はこのモデルで私達の以前の見つけることを確認し、結果私たちの以前の結果10と一貫性のあることがわかった normoglycemic NOD マウスを使用します。このプロトコルでは、単一のセルを準備し、その後それらを使用して、フローサイトメトリーによる解析のための効率的、かつ経済的な方法を提供します。いくつかの公開プロトコル自動分解11,12を使用して単一のセルが用意してあります。我々 は細胞懸濁液で線維組織の存在を回避でき、細胞懸濁液は免疫細胞と赤の主体を確認、分解を使用すると、手動で胸腺腺や脾臓を圧迫し、残りのカプセルを破棄して、代わりに血液細胞。NH4Cl を使用して赤の血液細胞を溶解させます。臓器が通常のサイズよりも大きい場合は、数分以上の換散の期間を拡張できます。しかし、溶解時間があまり拡張されていない必要があります、それ以外の場合、免疫細胞は分離も。Cytometry 流れ中にセル ストレーナー (またはその他の対応するセルのフィルター) と、目詰まりの問題を防ぐためにキャップを経る細胞懸濁液を知らせることが重要です。
暗闇での作業をお勧め螢光色素標識抗体を使用するときライトへの長い露出を避けるために。我々 は、細胞染色細胞外と細胞内の氷の上を孵化させなさい。孵化は、抗体の高速バインドを許可する部屋の温度で行うことができますが、非特異的結合の危険性があります。
いくつかの細胞内マーカーでは、フローサイトメトリーで良好な信号を与えるためにセルの数が多い必要があります。PDLNs の小型サイズを考えると、金属製のメッシュにそれらを研削免疫細胞の最大のリリースを許可するより多くのケアが必要です。多くの PDLNs を収集はまた、セル数を増やす方法です。このプロトコルのもう一つの制限は、セル固定フローサイトメトリーによる解析のグリセリン、彼らはその後の機能研究のため使用できません。磁気の並べ替えは、場合にのみ関心のある表面マーカー機能研究を可能にするオプションです。
このプロトコルは、自己免疫と癌13,14の他のマウスのモデルに適用されています。単一セルの準備は、異なる免疫臓器の免疫細胞の特性を決定する基本が便利な手法です。このメソッドを使用して単一のセルの準備のためと、壊死細胞の総数を減少させる可能性がある可能性があります。従来のフローサイトメトリーのスペクトルの重なりは、同時に検出できるマーカーの数を制限します。したがって、いくつかのパネルと多数のセルは全体的な免疫プロファイルを集録する必要です。将来は、この質量フローサイトメトリーの発展によって解決できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、スウェーデン研究評議会、EXODIAB、スウェーデン糖尿病財団、スウェーデンの子供糖尿病基金、SEB Diabetesfonden、o. e. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse によって財政上支えられました。著者は、彼らのサポートとの議論のおかげでオーラあたりカールソンとステラ サンドラーにたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
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