يصف هذا البروتوكول الطريقة والمواد والمعدات والخطوات اللازمة لإعداد الحمض النووي الريبي والبروتين يُنتج الخلايا الاصطناعية من أسفل إلى أعلى. تحتوي المقصورة المائية الداخلية للخلايا الاصطناعية على تحلل اتبكي S30 مغلف داخل طبقة ثنائية من الدهون (أي الليبوزومات المستقرة) ، وذلك باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت.
نهج التجميع من أسفل إلى أعلى لبناء الخلايا الاصطناعية هو أداة فعالة لعزل والتحقيق في العمليات الخلوية في بيئة تحاكي الخلية. وعلاوة على ذلك، أظهر تطوير أنظمة التعبير الخالية من الخلايا القدرة على إعادة إنتاج البروتين والنسخ وعمليات الترجمة (DNA→RNA→protein) بطريقة خاضعة للرقابة، مما يسخّر البيولوجيا التركيبية. هنا نصف بروتوكول لإعداد نظام التعبير خالية من الخلايا، بما في ذلك إنتاج تحلل البكتيريا قوية وتغليف هذا تحلل داخل الغنية بالدهون الغنية بالدهون الحويصلات يونيلاميلار (GUVs) (أي liposomes مستقرة)، لتشكيل الخلايا الاصطناعية. ويصف البروتوكول طرق إعداد مكونات الخلايا الاصطناعية بما في ذلك إنتاج الخلايا البكتيرية النشطة، يليها إعداد مفصل للخلايا الاصطناعية خطوة بخطوة على أساس طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت. هذه تسهل إنتاج الملايين من الخلايا الاصطناعية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة مع براعة عالية لإنتاج أنواع مختلفة من البروتينات. يمكن استخدام الخلايا الاصطناعية التي تم الحصول عليها للتحقيق في إنتاج البروتين / الحمض النووي الريبي والنشاط في بيئة معزولة ، في تطور موجه ، وكذلك كمنصة تسليم الأدوية الخاضعة للرقابة لإنتاج البروتينات العلاجية عند الطلب داخل الجسم.
الخلايا الاصطناعية هي جزيئات تشبه الخلايا الاصطناعية ، تحاكي وظيفة واحدة أو متعددة للخلية الحية ، مثل القدرة على الانقسام ، وتشكيل تفاعلات الغشاء ، وتوليف البروتينات استنادًا إلى رمز وراثي1،2،3. تمتلك الخلايا الاصطناعية التي تُغلف أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) وحدات عالية بسبب قدرتها على إنتاج بروتينات مختلفة وتسلسلات الحمض النووي الريبي بعد التعديلات في قالب الحمض النووي. تقديم بديل جذاب للنهج الحالية لإنتاج البروتين، وتستند أنظمة CFPS على تحلل الخلايا، والمكونات النقية، أو المكونات الاصطناعية وتشمل جميع آلات النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين مثل الريبوسوم، البوليميراز الحمض النووي الريبي، الأحماض الأمينية ومصادر الطاقة (على سبيل المثال، 3-phosphoglycerate والغدينين ثلاثي الفوسفات)4،,5،,6،,7،,8،,9. تغليف نظام CFPS داخل الحويصلات الدهنية تمكن من إنتاج بسيط وفعال من البروتينات دون الاعتماد على الخلية الحية10. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا المنبر تخليق الببتيدات التي قد تتحلل داخل الخلايا الطبيعية، وإنتاج البروتينات السامة للخلايا الحية، وتعديل البروتينات مع الأحماض الأمينية غير الطبيعية11،12. وقد استخدمت الخلايا الاصطناعية كنموذج لأغراض البحث التحقيق في الحد الأدنى من مكونات الخلية المطلوبة لتمكين الحياة الخلوية من منظور تطوري1,13. كما استخدمت الخلايا الاصطناعية لبناء وتنفيذ الدائرة الوراثية وكنماذج للتطور الموجه14،15،16. وقد ركزت دراسات أخرى على قدرة الخلايا الاصطناعية على تقليد النشاط البيولوجي للخلايا الطبيعية، تهدف إلى استبدال الخلايا الطبيعية التالفة، مثل خلايا بيتا في المرضى الذين يعانون من مرض السكري17. وعلاوة على ذلك، فإن قدرة هذه الخلايا الاصطناعية CFPS تغليف لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات العلاجية يوضح قدرتها على أن تدمج في الاستخدام السريري18.
هنا نصف بروتوكول المختبر من أسفل إلى أعلى على نطاق(الشكل 1)لإنتاج الحمض النووي الريبي والخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين على أساس نظام CFPS مغلفة في الحويصلات الدهنية. وهذا يدل على الاستخدام المحتمل لمنصات الخلايا الاصطناعية كأنظمة جديدة لتوصيل الأدوية لإنتاج المخدرات البروتينية العلاجية في الجسم الحي19في الموقع. وقد بحثت الدراسات السابقة الأمثل من رد فعل CFPS وعمليات إعداد الخلية lysate4،8،20. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق العديد من التقنيات لإعداد الدهون بحجم الخلية، مثل أساليب تثبيت قطرات الدم الدقيقة والبوليمر21،22،23، والتي تختلف أيضًا في تكوين الدهون الدهنية24،25،26. في البروتوكول المعروض ، يتم إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت ويتم عملية التغليف في درجات حرارة منخفضة (<4 °C)5،10،24،27،28. وقد وجد أن هذه الظروف المعتدلة مواتية للاحتفاظ بالسلامة الحيوية الوظيفية للآلات الجزيئية ، وهي الريبوسوم والبروتينات27،29،30. يتكون تكوين الدهون من الجسيمات من كل من الكوليسترول و1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). تم العثور على الأول في جميع أغشية خلايا الثدييات وهو ضروري للاستقرار والصلابة والحد من نفاذية الغشاء ، ويحاكي هذا الأخير تكوين فوسفوليبيد الثدييات11،13. يتم استخراج النسخ الخلوي والآلات الجزيئية الترجمة من سلالة BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) ، والتي يتم تحويلها مع pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase لزيادة قوة CFPS وتخليق البروتين. وقد استخدم هذا النظام لإنتاج البروتينات التشخيصية والعلاجية، مع الأوزان الجزيئية تصل إلى 66 كيلو في المختبر وفي الجسم الحي19،,31. يوفر البروتوكول التالي طريقة بسيطة وفعالة لإنتاج نظام الخلايا الاصطناعية ، والتي يمكن أن تعالج مجموعة واسعة من الأسئلة الأساسية المرتبطة بتخليق البروتين في الطبيعة ويمكن استخدامها أيضًا في تطبيقات تسليم الأدوية.
يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وبأسعار معقولة لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين. تعتمد غلة الخلايا النشطة على التنفيذ الدقيق والدقيق للبروتوكول مع التركيز على العديد من الخطوات الحاسمة. في قسم إعداد الليكل من هذه الطريقة ، من الضروري الوصول إلى كثافة البكتيريا ?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل ERC-STG-2015-680242.
ويعترف المؤلفون أيضا بدعم مركز تكنيون المتكامل للسرطان( TICC)؛ معهد راسل بيري للتكنولوجيا النانوية؛ مركز لوري لوكي متعدد التخصصات لعلوم الحياة والهندسة؛ وزارة الاقتصاد الإسرائيلية لمنحة كامين (52752)؛ وزارة تكنولوجيا العلوم والفضاء الإسرائيلية – مكتب كبير العلماء (3-11878)؛ المؤسسة الإسرائيلية للعلوم (1778/13، 1421/17)؛ الجمعية الإسرائيلية للسرطان (2015-0116)؛ المؤسسة الألمانية الإسرائيلية للبحث العلمي والتطوير من أجل منحة من شركة GIF Young (I-2328-1139.10/2012)؛ برنامج الاتحاد الأوروبي FP-7 IRG لمنحة الاندماج الوظيفي (908049)؛ منحة مركز أبحاث فوسفوليبيد؛ (أ) مؤسسة روزنبلات لبحوث السرطان، منحة مؤسسة الأسرة في مالات؛ ومؤسسة عائلة (أونغر) أ. شرودر يعترف زمالتي ألون وتاوب. O. Adir يعترف زمالات شيرمان وغوتويرث. ز. تشين يعترف زمالة شيرمان. ن. كرينسكي يعترف البارونة أريان دي روتشيلد برنامج الدكتوراه النسائية من مؤسسة روتشيلد قيصرية.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |