Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.
Abstract
Der Bottom-up-Montageansatz für den Aufbau synthetischer Zellen ist ein effektives Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung zellulärer Prozesse in einer Zellimittierungsumgebung. Darüber hinaus hat die Entwicklung zellfreier Expressionssysteme die Fähigkeit gezeigt, die Proteinproduktions-, Transkriptions- und Translationsprozesse (DNA-RNA-Protein) kontrolliert zu rekonstituieren und dabei die synthetische Biologie zu nutzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung eines zellfreien Expressionssystems, einschließlich der Herstellung eines potenten bakteriellen Lysats und der Verkapselung dieses Lysats in cholesterinreichen Lipid-basierten Riesen-Unilamellar-Vesikeln (GUVs) (d.h. stabile Liposomen), um synthetische Zellen zu bilden. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur Herstellung der Komponenten der synthetischen Zellen einschließlich der Herstellung von aktiven bakteriellen Lysaten, gefolgt von einer detaillierten schrittweisen Vorbereitung der synthetischen Zellen auf der Grundlage eines Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahrens. Diese erleichtern die Produktion von Millionen synthetischer Zellen auf einfache und erschwingliche Weise mit einer hohen Vielseitigkeit für die Herstellung verschiedener Arten von Proteinen. Die erhaltenen synthetischen Zellen können verwendet werden, um die Protein-RNA-Produktion und -Aktivität in einer isolierten Umgebung zu untersuchen, in der gerichteten Evolution, und auch als kontrollierte Plattform für die Bereitstellung von Medikamenten für die On-Demand-Produktion von therapeutischen Proteinen im Körper.
Introduction
Synthetische Zellen sind künstliche zellähnliche Teilchen, die eine oder mehrere Funktionen einer lebenden Zelle imitieren, wie z. B. die Fähigkeit, zu teilen, Membraninteraktionen zu bilden und Proteine basierend auf einem genetischen Code1,2,3zu synthetisieren. Synthetische Zellen, die zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS) umschließen, besitzen eine hohe Modularität aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene Proteine und RNA-Sequenzen nach Veränderungen in der DNA-Vorlage zu produzieren. Als attraktive Alternative zu den aktuellen Ansätzen der Proteinproduktion basieren CFPS-Systeme auf Zelllysat, gereinigten Komponenten oder synthetischen Komponenten und umfassen alle Transkriptions- und Übersetzungsmaschinen, die für die Proteinsynthese erforderlich sind, wie Ribosomen, RNA-Polymerase, Aminosäuren und Energiequellen (z. B. 3-Phosphoglycerat und Adenintriphosphat)8,4,5,6,7,9. Die Verkapselung eines CFPS-Systems in Lipidbläschen ermöglicht die einfache und effiziente Produktion von Proteinen, ohne von einer lebenden Zelle abhängig zu sein10. Darüber hinaus ermöglicht diese Plattform die Synthese von Peptiden, die in natürlichen Zellen abbauen können, Produktion von Proteinen, die toxisch für lebende Zellen sind, und modifizieren Proteine mit nicht-natürlichen Aminosäuren11,12. Synthetische Zellen wurden als Modell für Forschungszwecke verwendet, um die minimalen Zellkomponenten zu untersuchen, die erforderlich sind, um das zelluläre Leben aus evolutionärer Perspektive zu ermöglichen1,13. Synthetische Zellen wurden auch verwendet, um genetische Schaltung zu bauen und zu implementieren und als Modelle für gerichtete Evolution14,15,16. Andere Studien konzentrierten sich auf die Fähigkeit synthetischer Zellen, die biologische Aktivität natürlicher Zellen nachzuahmen, mit dem Ziel, beschädigte natürliche Zellen zu ersetzen, wie Betazellen bei Patienten mit Diabetes17. Darüber hinaus veranschaulicht die Fähigkeit dieser CFPS, synthetische Zellen zu verkapseln, eine Vielzahl von therapeutischen Proteinen zu produzieren, ihr Potenzial, in den klinischen Einsatz integriert zu werden18.
Hier beschreiben wir ein Bottom-up-Labor-Skalenprotokoll (Abbildung 1) zur Herstellung von RNA- und Protein produzierenden synthetischen Zellen auf Basis eines CFPS-Systems, das in einem Lipidvesikel eingekapselt ist. Dies zeigt die mögliche Verwendung synthetischer Zellplattformen als neuartige Wirkstoffabgabesysteme für die Vor-Ort-Produktion eines therapeutischen Proteinmedikaments in vivo19. Frühere Studien haben die Optimierung der CFPS-Reaktion und der Zelllysatpräparationsprozesse4,8,20untersucht. Darüber hinaus wurden verschiedene Techniken für die zellgroße Liposomenpräparation angewendet, wie mikrofluidische und polymerbasierte Tröpfchenstabilisierungsmethoden21,22,23, die sich auch in der Lipidzusammensetzung der Liposomen24,25,26unterscheiden. Im vorgestellten Protokoll werden synthetische Zellen nach einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren hergestellt und der Verkapselungsprozess bei niedrigen Temperaturen (<4 °C)5,10,24,27,28durchgeführt. Diese milden Bedingungen haben sich als günstig für die Beibehaltung der biofunktionellen Integrität der molekularen Maschinerie erwiesen, nämlich Ribosomen und Proteine27,29,30. Die Lipidzusammensetzung der Partikel besteht sowohl aus Cholesterin als auch aus 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC). Die erste findet sich in allen Säugetierzellmembranen und ist wesentlich für die Stabilität, Steifigkeit und Durchlässigkeit der Membran, und letztere imitiert Säugetier Phospholipid Zusammensetzung11,13. Die zelluläre Transkription und Translation molekulare Maschinerie werden aus dem BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) Stamm extrahiert, der mit pAR1219 Plasmid überexzierende T7-RNA-Polymerase umgewandelt wird, um die CFPS-Potenz und Proteinsynthese zu erhöhen. Dieses System wurde zur Herstellung diagnostischer und therapeutischer Proteine mit Molekulargewichten von bis zu 66 kDa in vitro und in vivo19,31verwendet. Das folgende Protokoll bietet eine einfache und effektive Methode zur Herstellung des synthetischen Zellsystems, die eine Vielzahl grundlegender Fragen im Zusammenhang mit der Proteinsynthese in der Natur angehen und auch für Arzneimittelabgabeanwendungen eingesetzt werden kann.
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Protocol
ANMERKUNG: Abbildung des vollständigen Produktionsprotokolls der synthetischen Zellen ist in Abbildung 1dargestellt. Je nach Bedarf des Anwenders können die Proteinexpression (Abschnitt 3.2) und die synthetische Zellbildung (Abschnitt 4) Teile des Protokolls auch unabhängig (mit einigen Anpassungen) durchgeführt werden.
1. Herstellung von S30-T7-Lysat
- Streifenplatte die E. coli BL21(DE3) Bakterien transformiert mit der T7 RNA Polymerase exzessimitieren pAR1219 Plasmid auf einer LB-Agar-Platte mit 50 g/ml Ampicillin ergänzt, um einzelne Kolonien zu erhalten.
- Bereiten Sie eine Starterlösung vor: Impfen Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml LB-Medien, ergänzt mit 50 g/ml Ampicillin in einem 100 ml Erlenmeyer Kolben und wachsen Sie über Nacht mit einem Bodeninkubator-Shaker bei 250 U/min und 37 °C. Vorbereiten von Duplikaten.
- Impfen Sie jeweils 5 ml Starter separat in 500 ml TB-Medien, ergänzt mit 50 g/ml Ampicillin in einem 2 L ErlenmeyerKolben mit Baffeln und züchten Sie ihn mit einem Bodeninkubator-Shaker bei 250 U/min und 37 °C, bis er OD600 von 0,8-1 erreicht. Überwachen Sie dies regelmäßig mit einem Spektralphotometer.
- Zur Induktion der T7-RNA-Polymerase-Expression 2-3 ml von 100 ml IPTG-Bestand (bis zu 0,4 - 0,6 mM) hinzufügen und die Kultur weiter wachsen lassen, bis sie OD600erreicht.
- Übertragen Sie die Lösung aus jedem Erlenmeyerkolben in zwei 250 ml sterilisierte Zentrifugenrohre.
- Zentrifuge bei je 7.000 x g für 10 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
HINWEIS: In diesem Stadium kann das bakterielle Pellet bei -20 °C für einige Tage gelagert werden, bevor es mit den nächsten Schritten fortschreitet. - Jedes Pellet in 250 ml kalt (4 °C) S30 Lysatpuffer und Zentrifuge bei 7.000 x g für 10 min bei 4 °C wieder aufsetzen.
HINWEIS: Der S30-Lysatpuffer wird zur Aufrechterhaltung der Proteinstabilität verwendet, nachdem die Zelllyse mit dem Homogenisator in Schritt 1.9 durchgeführt wurde. Von diesem Schritt nach vorn sollten alle Schritte bis 1.12 nacheinander und schnell durchgeführt werden.
ANMERKUNG: Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, kühlen Sie die Spitzen und 1,5-Milliliter-Fläschchen, die für die Lagerung des - Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie alle Pellets zusammen in 15 ml kaltem S30-Lysatpuffer wieder auf. Filtern Sie die Aufhängung mit Gazepad.
HINWEIS: 15ml Lösung ist durch Homogenisator min. Volumen. Beachten Sie, dass bakterienkonzentration ist auch wichtig. - Homogenisieren Sie bei einem Arbeitsdruck von 15.000 psi, mit einem Luftdruck von 4 bar (zwei Durchgänge) für Zellbruch. Vermeiden Sie eine Lösungsverdünnung für ein konzentrierteres und aktiveres Lysat.
- Fügen Sie 100 l 0,1 M DTT (VORSICHT) pro 10 ml der homogenisierten Suspension hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 24.700 x g für 30 min bei 4 °C.
- Führen Sie schnell den folgenden Schritt aus, um die Lysataktivität zu erhalten: Teilen Sie den Überstand eins nach dem anderen in 200 L-Aliquots in vorgekühlten 1,5 ml-Durchstechflaschen auf und fangen Sie sie sofort mit flüssigem Stickstoff ein. Bei -80 °C für die weitere Verwendung aufbewahren.
VORSICHT: DTT wird als reizend und schädlich eingestuft und sollte daher mit Vorsicht behandelt werden.
2. Herstellung von Lipiden in Öllösung
- POPC und Cholesterin in Chloroform (VORSICHT) separat auflösen, jeweils bis zu einer Endkonzentration von 100 mg/ml. Wirbel jede Durchstechflasche separat.
- Kombinieren Sie die Komponenten in einer 2ml Glasdurchstechflasche: fügen Sie 50 l POPC in Chloroform, 50 l Cholesterin in Chloroform und 500 l Mineralöl hinzu. Für 100 l synthetische Zellen werden 2 Durchstechflaschen mit Lipiden in Öl benötigt.
- Wirbel, und dann erhitzen für etwa 1 h bei 80 °C in einer chemischen Haube, um die Chloroform zu verdampfen. Stellen Sie sicher, dass die vollständige Verdampfung erfolgt ist, indem Sie die angegebenen Zeiten/Bedingungen befolgen und das Lösungsvolumen überwachen.
HINWEIS: Die resultierende Lipid-in-Öl-Lösung kann bis zu zwei Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden. Für verbesserte Ergebnisse wird empfohlen, vor jedem Experiment eine neue Zubereitung zu verwenden. Lipid- und Cholesterinverhältnisse können entsprechend der gewünschten Membranzusammensetzung verändert werden. Eine hohe Konzentration von Cholesterin kann zur Bildung von Aggregaten in der endgültigen synthetischen Zelllösung führen.
VORSICHT: Chloroform wird als reizend und schädlich eingestuft und sollte daher mit Vorsicht und in Bereichen mit Rauchextraktion behandelt werden.
3. Zubereitungen von Außen-, Vor- und Fütterungslösungen
- Vorbereitung von Bestandslösungen
- Bereiten Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Lagerlösungen mit Reinstwasser (UPW) vor.
HINWEIS: Lagerlösungen sollten im Voraus vorbereitet und bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. Reagenz 7 neigt dazu, Aggregate zu bilden. Die Erwärmung auf 37 °C reduziert die Aggregation. Eine leichte Aggregation wird die Reaktion nicht signifikant beeinflussen. Reagenz 8 Lösung ist milchig und trüb.
- Bereiten Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Lagerlösungen mit Reinstwasser (UPW) vor.
- Äußere Lösung
- Glukose in DNase/RNase-freiH2 Obis zu einer Endkonzentration von 200 mM auflösen.
- Für 100 l innenlösung, bereiten Sie 1,6 ml außenlösung.
- Vorinnere Lösung
- Reagenzien 1-14 entsprechend den in Tabelle 2aufgeführten Mengen und Konzentrationen hinzufügen. Zum Beispiel für ein endgültiges synthetisches Zellvolumen von 100 l, bereiten Sie 100 l innere Lösung vor.
HINWEIS: UPW sollte hinzugefügt werden, um das endgültige erforderliche Volumen abzuschließen. In diesem Stadium kann die Mischung bei 4 °C für einige Stunden gelagert werden.
- Reagenzien 1-14 entsprechend den in Tabelle 2aufgeführten Mengen und Konzentrationen hinzufügen. Zum Beispiel für ein endgültiges synthetisches Zellvolumen von 100 l, bereiten Sie 100 l innere Lösung vor.
- Fütterungslösung
- Fügen Sie alle Reagenzien entsprechend den in Tabelle 3 aufgeführten Mengen und Konzentrationen hinzu.
HINWEIS: Verwenden Sie das Verhältnis 1:1 der Zuführlösung:innenlösung. Für ein endgültiges synthetisches Zellvolumen von 100 l 100 l Fütterungslösung vorbereiten. Es wird empfohlen, ein kleines Überschüssiges Volumen an Außen-, Innen- und Fütterungslösung vorzubereiten.
- Fügen Sie alle Reagenzien entsprechend den in Tabelle 3 aufgeführten Mengen und Konzentrationen hinzu.
4. Herstellung synthetischer Zellen
ANMERKUNG: Die folgenden Volumina werden für die Herstellung von 100 l synthetischen Zellen angepasst.
- Synthetische Zellen, die Protein produzieren
- In einem 15 ml Rohr 12 ml der äußeren Lösung platzieren und langsam, oben eine Schicht, von 500 l Lipiden in Öllösung hinzufügen. Bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.
- Um die innere Lösungszubereitung fertigzustellen: Mischen Sie die Inhaltsstoffe der inneren Lösung auf zerkleinertem Eis auf ein Endvolumen von 100 l, indem Sie auftauen und S30-T7 Lysat (Reagenz 15) und DNA-Plasmid (Reagenz 16) in die gelagerte Mischung einfügen.
- Zur zweiten 2 ml Glasdurchstechflasche mit 500 l Lipiden in Öllösung 100 l der inneren Lösung hinzufügen. Pipette kräftig für 1 Minute und Wirbel für eine weitere Minute auf Ebene fünf.
- 10 min auf zerkleinertem Eis brüten und die resultierende Emulsion langsam auf die Ölphase in das 15 ml-Rohr (ab 4.1.1) geben.
- Zentrifuge für 10 min bei 100 x g und 4 °C und dann Zentrifuge für 10 min bei 400 x g und 4 °C. Am Ende der Zentrifugation sollte ein Pellet an der Unterseite des Rohres beobachtet werden.
HINWEIS: Die Verwendung eines schwingenden Schaufelzentrifugenrotors wird hier bevorzugt, um eine bessere Abdeckung einer zweiten Lipidschicht während des Durchgangs der Wasser-in-Öl-Tröpfchen durch die Interphase zu erhalten. Falls kein beobachtbares Pellet vorhanden ist, kann die Zentrifugationsgeschwindigkeit auf 1000 x gerhöht werden. Andernfalls lesen Sie den Abschnitt Diskussion, der sich auf die spezifische Schwere der äußeren Lösung bezieht. - Extrahieren Sie das Pellet.
- Überschüssige Ölschicht entfernen.
- Verwenden Sie eine getrimmte Pipettenspitze, die mit ca. 400 l Außenlösung beladen ist, um das Pellet zu extrahieren. Lassen Sie die äußere Lösung während der Ölphase los, um nur das Pellet in der wässrigen Phase zu sammeln.
- Wischen Sie die Spitze nach der Extraktion des Pellets ab, um ölrestige Ölreste zu vermeiden, und übertragen Sie das Pellet in ein sauberes 1,5 ml-Rohr.
- Zentrifuge für 10 min bei 1.000 x g und 4 °C, den Überstand entfernen und das Pellet in 100 l Fütterungslösung (1:1 Verhältnis von Innen-:Fütterungslösungen) wieder aufhängen.
HINWEIS: Hier kann auch ein Zentrifugerotor mit festem Winkel verwendet werden. - Zur Proteinexpression 2 Stunden bei 37 °C ohne Schütteln inkubieren.
HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit variiert zwischen verschiedenen Proteinen. - Bewerten Sie die produzierte Proteinmenge mit einer geeigneten Methode entsprechend den Zielproteineigenschaften.
- Empfohlene Kontrollgruppen
- Innere Lösung und Lysataktivitätsbestätigung
- Bereiten Sie eine komplette innere Lösung (mit DNA & S30-T7 Lysat) vor.
- Sofort die Reaktion oben mit einem Bodeninkubator-Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute oder einem Thermomixer bei 1200 Umdrehungen pro Minute bei einer konstanten Temperatur von 37 °C für 2 h inkubieren.
HINWEIS: Passen Sie die Inkubationszeit an die Inkubationszeit der synthetischen Zellen an.
- Synthetische Zellen
- Negative Kontrollgruppe: Bereiten Sie das in 4.1 vorgestellte Protokoll mit innerer Lösung ohne DNA vor.
- Positive Kontrolle: Bereiten Sie das in 4.1 vorgestellte Protokoll mit einer inneren Lösung vor, die eine T7-Plasmid-Codierung für ein Reportergen enthält.
HINWEIS: Fügen Sie eine positive Kontrollgruppe hinzu, die aus einem Reportergen, z. B. sfGFP, besteht, neben den Testgruppen, um den Kapselungseffizienzschritt sicherzustellen.
- Innere Lösung und Lysataktivitätsbestätigung
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Representative Results
Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung synthetischer Zellen, indem wir ein S30-T7 CFPS-System auf Basis von BL21 E. coli in Lipidbläschen verkapseln. Eine schematische Beschreibung des Vorbereitungsprozesses, die ein Bild der einzelnen Stufen enthält, ist in Abbildung 2dargestellt. Der Erfolg des synthetischen Zellvorbereitungsprozesses hängt von der entsprechenden Leistung der einzelnen Stufen ab und wird durch unterschiedliche Parameter bewirkt. Das Protokoll sollte angepasst werden, um die Produktion eines bestimmten Proteins zu berücksichtigen.
Plasmide, die das Modellprotein-Super-Ordner Green Fluorescent Protein (sfGFP) und Renilla Luciferase unter dem T7-Promotor exzieren, wurden in CFPS-Massenreaktionen und synthetische Zellen eingeführt, und die Proteinproduktion wurde mit verschiedenen Methoden bewertet, einschließlich Western Blot, Flow Cytometry, Mikroskopie und Spektroskopie (Abbildung 3). Eine Überprüfung der sfGFP-Sein6 getaggtes Protein (ca. 27 kDa32) Produktion durch Western Blot Analyse ist in Abbildung 3Adargestellt. Eine Probe von 30 l synthetischen Zellen, die 6-fach verdünnt wurden, wurde mit 10 l eines gemeinsamen SDS-PAGE-Probenpuffers (mit den Waschmitteln Natriumdodecylsulfat (SDS) und Mercaptoethanol) gemischt und 10 min (95 oC) gekocht. Wir fanden heraus, dass die Kombination von Wärme und Reinigungsmitteln im Probenpuffer ausreicht, um die Vesikel zu zerlegen und den Betrieb von Proteinen im SDS-PAGE-Gel zu ermöglichen. Der Proteinnachweis wurde mit Anti-His polyklonalen Primärantikörpern (verdünnt 1:12.000) durchgeführt. Wie erwartet, wird die Proteinproduktion in Proben nachgewiesen, die sfGFP-kodierende DNA-Vorlagen ("+sfGFP DNA") enthalten, aber kein Protein wird in Negativkontrollproben beobachtet, in denen die DNA-Vorlage ausgeschlossen wurde ("-DNA"). Proben von gereinigtem sfGFP und gereinigtem sfGFP, gekapselt in der Membran synthetischer Zellen ('sfGFP (gekapselt)), werden als positiv für die sfGFP GFPS-Massenproduktion und für ihre Synthese in synthetischen Zellen, respectivley, verwendet. Diese Methode kann auf verschiedene Proteintypen angewendet werden. Nach Krinsky et al.19beträgt die sfGFP-Produktionsausbeute, die nach dem detaillierten Protokoll erzielt wird, 380 g/ml in CFPS-Lösung und 5,3 g/ml, wenn die CFPS-Lösung in Lipidbläschen eingekapselt ist.
Wenn das Protein, das in den synthetischen Zellen produziert wird, fluoreszierend ist, kann seine Produktion mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie-basierten Methoden bewertet werden. Wir analysierten die synthetischen Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Filter für GFP-Fluoreszenz (Abbildung 3B). Da die CFPS-Komponenten über eine gewisse Autofluoreszenz verfügen, sollten die Bildaufnahmeparameter entsprechend einer geeigneten Negativkontrollprobe (z. B. synthetische Zellen ohne DNA-Vorlage) angepasst werden.
Darüber hinaus verwendeten wir die Durchflusszytometrie, um die mittlere Fluoreszenzintensität von sfGFP-produzierenden synthetischen Zellen und den Prozentsatz aktiver synthetischer Zellen zu bestimmen, die Proteine in ihnen produzieren können (Abbildung 3C I&II). Für jede analysierte Stichprobe wurden 10.000 Ereignisse gesammelt. Die in diesem Protokoll beschriebene synthetische Zellproduktion ergibt in der Regel eine aktive Population von 21-25% innerhalb einer Lösung mit einer ungefähren Konzentration von 107 synthetischen Zellen/ml. Die leichte Fluoreszenzintensität, die durch "-DNA"-Proben in Abbildung 3C II dargestellt wird, ist auf die Autofluoreszenz verschiedener Komponenten in der CFPS-Reaktion wie das S30-Lysat zurückzuführen.
Repräsentative Größenanalyse auf der Grundlage des GFP-Signals (im Durchmesser) synthetischer Zellen, die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, zeigt einen Mittelwert von 2,4 bis 0,5 m (Abbildung 3D II). Da die Bildung von Wasser in Ölemulsion in diesem Verfahren das Ergebnis der Anwendung mechanischer Kräfte ist, kann die Größenverteilung der Partikel durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden, wie die Methode und Geschwindigkeit der Pipettierung der Emulsion nach oben und unten, das Modell der Wirbelmischermaschine usw.
Um die Vielseitigkeit der Proteinproduktion synthetischer Zellen zu testen, wurde die Expression des Reporterproteins Renilla luciferase in synthetischen Zellen analysiert (Abbildung 3E). Der Test quantifizierte die Aktivität der Renilla-Luziferase durch Messung der Lumineszenz, die aus der enzymatischen Reaktion der Luziferase und ihres Substrats h-Coelenterazin erzeugt wird. Renilla Um die enzymatische Reaktion auszulösen, wurde den synthetischen Zellen kurz vor der Messung eine Endkonzentration von 1 m h-Coelenterazin zugesetzt (25 l Probenvolumen). "-DNA"-Probe, die nicht die luziferase-kodierende DNA-Vorlage enthielt, wurde als negative Kontrolle zum Testen der Lumineszenz aufgrund nicht-enzymatischer Oxidation des Substrats verwendet. Die Lumineszenz wurde mit einem Plattenleser gemessen.
Abbildung 1: Eine Abbildung des Prozesses für das typische Vorbereitungsprotokoll für synthetische Zellen. Der Prozess ist in zwei Schritte unterteilt. Schritt 1: Präparate vor dem Versuch einschließlich DNA-Plasmidreinigung, S30-T7-Lysat-Präparation, Stofflösungsvorbereitung für die Innen- und Fütterungslösungen, Lipid-in-Öl-Lösungsvorbereitung und äußere Lösungsvorbereitung. Schritt 2: Synthetische Zellbildung, die Fütterung und Innere Lösungsvorbereitung, Vorbereitung und Analyse synthetischer Zellen umfasst. Ein Beispiel für das erforderliche Volumen jeder Zutat für die Herstellung von 100 l synthetischen Zellen Lösung ist in blau in Klammern dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des synthetischen Zellvorbereitungsprotokolls. Ein Bild eines gut ausgeführten Prozesses veranschaulicht jede Phase des Protokolls. Diese Zahl wurde von Krinsky et al.19geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Produktion Renilla von sfGFP und Renilla-Luziferase in synthetischen Zellen. (A) Eine Western-Blot-Analyse der sfGFP-His6-Produktion sowohl in CFPS-Massenreaktionen als auch in synthetischen Zellen. Der Proteinnachweis wurde mit Anti-His polyklonalen Primärantikörpern (verdünnt 1:12.000) durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde als Positivkontrolle verwendet (7,8 g). sfGFP (gekapselt) ist eine positive Kontrolle von gereinigtem sfGFP, das in synthetischen Zellen eingekapselt ist. Proben ohne DNA-Vorlagen wurden als Negativkontrolle für die Produktionsanalyse ("-DNA") verwendet. (B) Repräsentative Bilder von sfGFP zur Herstellung synthetischer Zellen, die mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Hellfeld und einem GFP-Filter aufgenommen wurden. Skalenstäbe = 50 m (C) I&II Flow Zytometrieanalyse der sfGFP-Produktion synthetischer Zellenaktivität (Daten, die mit digitalem 4-Laser-Analysator gesammelt werden). Die Proben wurden nach 3 h Inkubation gemessen. Für jede analysierte Stichprobe wurden 10.000 Ereignisse gesammelt. FSC-Filter (500 V) und SSC (300 V) wurden verwendet, um die gesamte synthetische Zellpopulation zu definieren. Dann wurde ein FITC(600 V) Filter verwendet, um GFP-Fluoreszenz zu erkennen. (I) Die Berechnung der aktiven synthetischen Zellpopulation [%] basierte auf dem GFP-Fluoreszenzintensitätsschwellenwert, der durch die "-DNA"-Probe (rotes Histogramm) definiert wurde, was einen Fehler von 1 % zuließ. (II) Mittlere Fluoreszenzintensität von sfGFP zur Herstellung synthetischer Zellen. Dieser Wert wurde aus der aktiven synthetischen Zellpopulation berechnet und zur "-DNA"-Probe normalisiert, indem die mittlere Fluoreszenz der aktiven synthetischen Zellen durch den Mittelwert der synthetischen Zellen ohne sfGFP-DNA dividiert wurde. (D) I&II Synthetische Zellgrößenanalyse. Das Emissionsspektrum wurde mit 505-560 nm bzw. 642-745 nm für GFP- bzw. Hellfeldsignale nachgewiesen. (I) Ein repräsentatives Bild der analysierten synthetischen Zellen. (II) Größenverteilung synthetischer Zellen. Es wurde eine Analyse durchgeführt und die Durchmesserverteilungen der aktiven synthetischen Zellen auf Basis des GFP-Signals berechnet. (E) Herstellung der aktiven Renilla-Luziferase in synthetischen Zellen. Renilla Die Luciferase-Aktivität wurde mit Lumineszenzmessungen nach Zugabe von 1 'M h-Coelenterazin mit einem Plattenleser quantifiziert und als Lichtintensität [RLU] x 106dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Tabelle 1: Vorbereitung von Puffer- und Lagerlösungen. | |
| Kommentare | |
| Luria Bertani (LB) Agar (1,5%) Teller: | Vorbereiten und sterilisieren. Ampicillin erst nach abkühlender Auftemperatur in einer Endkonzentration von 50 g/ml hinzufügen. |
| 10 g/L Bacto-Trypton | |
| 10 g/L Natriumchlorid (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-Hefe-Extrakt | |
| 15 g/L Agar Agar gereinigt | |
| 50 g/ml Ampicillin | |
| LB-Medien (20 ml): | Minimale Medien. Bereiten Sie und sterilisieren Sie im Voraus. Kurz vor der Impfung der Bakterien, fügen Sie Ampicillin in einer Endkonzentration von 50 g/ml hinzu. |
| 10 g/L Bacto-Trypton | |
| 10 g/L Natriumchlorid (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-Hefe-Extrakt | |
| 50 g/ml Ampicillin | |
| Terrific Broth (TB) Medien (1 L): | Rich Media. Bereiten Sie und sterilisieren Sie im Voraus. Kurz vor der Impfung der Bakterien, fügen Sie Ampicillin in einer Endkonzentration von 50 g/ml hinzu. |
| 12 g/L Bacto-Trypton | |
| 24 g/L Bacto-Hefe-Extrakt | |
| 4% (v/v) Glycerol wasserfrei | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | |
| 12,54 g/L KH2PO4 | |
| 50 g/ml Ampicillin | |
| S30 Lysatpuffer (1,5 l): | Im Voraus vorbereiten und sterilisieren (*ohne DTT und 2-Mercaptoethanol). Bei -4 °C lagern. |
| 10 mM Trisacetat bei pH = 7,4 | Trisma-Basis. Bereiten Sie den pH-Wert mit Essigsäure auf 7,4 vor und passen Sie ihn an. |
| 14 mM Magnesiumacetat | |
| 60 mM Kaliumacetat | |
| *1 mMD DTT | Kurz vor der Verwendung hinzufügen |
| *0,5 ml/L 2-Mercaptoethanol | Kurz vor der Verwendung hinzufügen |
| 1 M HEPES-KOH (pH = 8): | HEPES auf eine Endkonzentration von 1 M auflösen. Mit KOH-Lösung an pH 8 anpassen. |
| HEPES | |
| Kaliumhydroxid (KOH) | |
| Tabelle 2: Zusammensetzung der inneren Lösung. | ||||||||||
| Endangefordertes Inner-Lösungsvolumen | ||||||||||
| Anzahl | Reagenz | Stock conc. | Finale Conc. | 25 l | 50 l | 100 l | 200 l | 300 l | 400 € L | |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Vor-innere Lösung |
| 2 | Magnesiumacetat | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Kaliumacetat | 1 M | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Ammoniumacetat | 5,2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Aminosäuren - Mischung I | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Aminosäuren - Mischung II | 50 M | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Saccharose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysat | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | DNA-Plasmid | 10 g/ml | * | * | * | * | * | * | ||
| Tabelle 3: Zusammensetzung der Fütterungslösung. | |||||||||
| Endgültiges gewünschtes Zuführlösungsvolumen | |||||||||
| Anzahl | Reagenz | Lager conc. | abschließende Conc. | 25 l | 50 l | 100 l | 200 l | 300 l | 400 l |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 83,3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Magnesiumacetat | 1 M | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Kaliumacetat | 1 M | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Ammoniumacetat | 5,2 M | 236,4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0,5 M | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Aminosäuren - Mischung I | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Aminosäuren - Mischung II | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glukose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tabelle 4: Erforderliche Lösungen für die Herstellung synthetischer Zellen. | |
| Lösung & Materialien erforderlich | Kommentare |
| Lipide in Öl | Bei Raumtemperatur bis zum Gebrauch lagern. Vorbereitet nach Abschnitt 2 |
| Äußere Lösung | Vorbereitet nach Abschnitt 3.1 |
| Innere Lösung | Vorbereitet nach Abschnitt 3.2. |
| Vorbereiten von Tests + Kontrollproben gemäß Abschnitt 4.1. | |
| Auf zerkleinertem Eis bis zum Gebrauch aufbewahren. | |
| Fütterungslösung | Vorbereitet nach Abschnitt 3.3. |
| Auf zerkleinertem Eis bis zum Gebrauch aufbewahren. | |
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Discussion
Mit diesem Protokoll wird eine einfache und erschwingliche Methode zur Herstellung großer Mengen proteinproduzierender synthetischer Zellen eingeführt. Die Ausbeute aktiver Zellen hängt von einer sorgfältigen und genauen Ausführung des Protokolls ab, wobei der Schwerpunkt auf mehreren kritischen Schritten liegt. Im Lysatpräparat dieser Methode ist es wichtig, die entsprechende Bakteriendichte vor der Zelllyse zu erreichen, um eine ausreichende Menge an Proteinen im bakteriellen Lysat zu erreichen. Zweitens sollte der Lyseprozess bei 4 °C durchgeführt werden und das Lysat schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren werden, um die Proteinaktivität aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus verwendeten wir in diesem Protokoll E. coli BL21(DE3)-Zellen, die mit pAR1219 Plasmid transformiert wurden, das T7-RNA-Polymerase exzessient. In Fällen, in denen ein anderer Bakterienstamm verwendet wird, können Änderungen der Lysatkonzentration erforderlich sein, um eine zufriedenstellende Menge an RNA-Polymerase und Ribosomen zu erreichen. Selbst wenn der gleiche Bakterienstamm verwendet wird, können verschiedene Lysat-Produktionen eine gewisse Batch-zu-Batch-Variabilität haben.
Die Vesikelproduktion umfasst auch ein paar wichtige Schritte. Die Löslichkeit der Lipide und die Entfernung des Chloroform aus dem Mineralöl ist wichtig für die Herstellung der Wasser-in-Öl-Emulsion. Die Zentrifugierung der Wasser-in-Öl-Tröpfchen in den äußeren wässrigen Puffer ist auch ein wichtiger Schritt im Protokoll, um synthetische Zellen mit einer Lipid-Bilayer zu erzeugen. Veränderungen in der inneren Lösung der Vesikel und der Lipidzusammensetzung können zu einer Tröpfchenschicht an der Öl-Wasser-Interphase ohne beobachtbare Pellets führen. Um dies zu überwinden, besteht eine schnelle Lösung darin, die Zentrifugationsgeschwindigkeit im Emulsionstransferschritt auf 1.000 x g zu erhöhen. Falls dies das Problem nicht löst, kann die spezifische Schwerkraft der äußeren wässrigen Lösung geändert werden, um sicherzustellen, dass die innere Lösung eine höhere spezifische Schwerkraft als die äußere Lösung hat. Darüber hinaus kann die Osmolalität der inneren Lösung auch zwischen verschiedenen Lysatquellen und Produktionen variieren, die zwischen 800-1100 mOsm/kg liegen. Die Variabilität der inneren Lösung summiert sich hauptsächlich durch wechselnde Konzentrationen des Lysats während des Produktionsprozesses. In der Regel führt dies nicht zu signifikanten Veränderungen in der Proteinproduktion, aber eine große Verdünnung kann zu einer geringeren Ausbeute aufgrund niedriger Konzentrationen der Transkriptions- und Translationsenzyme im Lysat selbst führen. Die Messung der Gesamtenproteinkonzentration in jeder Lysatcharge kann bei der Abstimmung der Lysatkonzentrationen in der inneren Lösung helfen, konstante Werte beizubehalten (ca. 22 mg/ml gemessen durch Bradford-Assay).
Dennoch hat diese Methode einige Einschränkungen, die erwähnt werden sollten. Nicht alle erzeugten synthetischen Zellen sind aktiv und in der Lage, Proteine aufgrund einer unvollständigen Verkapselung aller erforderlichen Komponenten zu produzieren. Wir haben etwa 21-25% der aktiven Zellen bei der Herstellung von sfGFP gemessen, die synthetische Zellen mit Flusszytometrie exzessizieren (es wurden keine signifikanten Größenunterschiede zwischen aktiven und inaktiven Zellen beobachtet). Öl- und Lipidüberschussrückstände verbleiben nach dem Transfer der synthetischen Zellen in die wässrige Phase gelegentlich in der Zweischicht-Lipidmembran. Die Optimierung der Lipid- und Cholesterinkonzentrationen in der Ölphase kann dieses Problem verbessern. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Größenverteilung der erhaltenen synthetischen Zellen im Vergleich zu alternativen mikrofluidischen Methoden recht breit ist, mit Vesikeln im Bereich von ca. 1-50 m.
Die hohe Ausbeute des Emulsionstransferverfahrens macht es besonders geeignet für synthetische Zellen, die zellfreie Proteinsynthesesysteme für die therapeutische Proteinproduktion verkapseln. Verschiedene Variationen des Emulsionstransferverfahrens wurden in synthetischen Zellstudien eingesetzt und beinhalteten Veränderungen im Ölaufbereitungsverfahren, Membranzusammensetzung, Probenvolumen, innere Lösung zum Ölverhältnis und Zentrifugationsgeschwindigkeiten5,24,28. Mikrofluidische und polymerbasierte Tröpfchenstabilisierungsmethoden wurden auch für die synthetische Zellpräparation verwendet, jedoch wurde die Verkapselung des gesamten CFPS-Systems mit diesen Methoden noch nicht durchgeführt21,22,23.
Die mit dieser Methode gewonnenen synthetischen Zellen wurden in vivo gezeigt, um Proteine zu produzieren und Krebs in murinen Modellen zu behandeln19. Die Fähigkeiten dieser Zellen können in Zukunft über die Proteinexpression hinaus weiter ausgebaut werden. Die Integration anderer zellulärer Prozesse wie Zellkommunikation, Zytoskelettmodifikation und Zellteilung in synthetische Zellen wurde kürzlich beschrieben33,34,35,36. Die Substitution des bakteriellen Lysats durch eukaryotisches Zelllysat wird die Expression von Proteinen mit höherer Komplexität und posttranslationalen Modifikationen ermöglichen und wird vielleicht auch ohne Reinigungsverfahren weniger immunogen sein und somit mehr therapeutische Grenzen eröffnen37.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von ERC-STG-2015-680242 unterstützt.
Die Autoren würdigen auch die Unterstützung des Technion Integrated Cancer Center (TICC); das Russell Berrie Nanotechnology Institute; das Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; das israelische Wirtschaftsministerium für einen Kamin-Zuschuss (52752); das israelische Ministerium für Wissenschaftstechnologie und Raumfahrt – Büro des Chefwissenschaftlers (3-11878); die Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); der Israel Cancer Association (2015-0116); die Deutsch-Israelische Stiftung für wissenschaftliche Forschung und Entwicklung für ein GIF-Young-Stipendium (I-2328-1139.10/2012); das FP-7 IRG-Programm der Europäischen Union für einen Stipendien für die berufliche Eingliederung (908049); das Phospholipid Research Center Grant; eine Rosenblatt Foundation for Cancer Research, ein Mallat Family Foundation Grant; und der Familienstiftung Unger. A. Schroeder würdigt Alon und Taub Fellowships. O. Adir würdigt die Sherman- und Gutwirth-Stipendien. G. Chen erkennt die Sherman Fellowship an. N. Krinsky würdigt das Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program der Rothschild Caesarea Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
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