Summary
Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.
Abstract
De bottom-up assemblage benadering voor de bouw van synthetische cellen is een effectief instrument voor het isoleren en onderzoeken van cellulaire processen in een cel nabootsen omgeving. Bovendien heeft de ontwikkeling van celvrije expressiesystemen aangetoond dat het vermogen is om de eiwitproductie-, transcriptie- en vertaalprocessen (DNA→RNA→eiwit) op een gecontroleerde manier te reconstrueren, waarbij synthetische biologie wordt gebruikt. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van een cel-vrije expressie systeem, met inbegrip van de productie van een krachtige bacteriële lysaat en inkapselen dit lysaat binnen cholesterol-rijke lipide-gebaseerde gigantische unilamellar vesicles (GUVs) (dat wil zeggen, stabiele liposomen), om synthetische cellen te vormen. Het protocol beschrijft de methoden voor de voorbereiding van de componenten van de synthetische cellen, met inbegrip van de productie van actieve bacteriële lysaten, gevolgd door een gedetailleerde stapsgewijze voorbereiding van de synthetische cellen op basis van een water-in-olie emulsie overdracht methode. Deze vergemakkelijken de productie van miljoenen synthetische cellen op een eenvoudige en betaalbare manier met een hoge veelzijdigheid voor het produceren van verschillende soorten eiwitten. De verkregen synthetische cellen kunnen worden gebruikt om de productie en activiteit van eiwitten/RNA te onderzoeken in een geïsoleerde omgeving, in gerichte evolutie, en ook als een gecontroleerd geneesmiddelenleveringsplatform voor on-demand productie van therapeutische eiwitten in het lichaam.
Introduction
Synthetische cellen zijn kunstmatige celachtige deeltjes, die een of meerdere functies van een levende cel nabootsen, zoals het vermogen om te verdelen, membraaninteracties te vormen en eiwitten te synthetiseren op basis van een genetische code1,2,3. Synthetische cellen die celvrije eiwitsynthese (CFPS) systemen omsluiten bezitten een hoge modulariteit vanwege hun vermogen om verschillende eiwitten en RNA sequenties te produceren na veranderingen in de DNA-sjabloon. CFPS-systemen zijn gebaseerd op cellysaat, gezuiverde componenten of synthetische componenten en bieden een aantrekkelijk alternatief voor de huidige benaderingen van eiwitproductie en omvatten alle transcriptie- en vertaalmechanismen die nodig zijn voor eiwitsynthese, zoals ribosomen, RNA-polymerase, aminozuren en energiebronnen (bijvoorbeeld 3-fosfhoglyceren en adenine trifosfaat)4,5,6,7,8,9. De inkapseling van een CFPS-systeem in lipideblaasjes maakt de eenvoudige en efficiënte productie van eiwitten mogelijk zonder afhankelijk te zijn van een levende cel10. Bovendien, dit platform maakt synthese van peptiden die kunnen degraderen in natuurlijke cellen, de productie van eiwitten die giftig zijn voor levende cellen, en eiwitten te wijzigen met niet-natuurlijke aminozuren11,12. Synthetische cellen zijn gebruikt als een model voor onderzoeksdoeleinden het onderzoeken van de minimale celcomponenten die nodig zijn om cellulair leven mogelijk te maken vanuit een evolutionair perspectief1,13. Synthetische cellen zijn ook gebruikt voor het bouwen en implementeren van genetische circuits en als modellen voor gerichte evolutie14,15,16. Andere studies hebben zich gericht op het vermogen van synthetische cellen om de biologische activiteit van natuurlijke cellen na te bootsen, gericht op het vervangen van beschadigde natuurlijke cellen, zoals bètacellen bij patiënten met diabetes17. Bovendien illustreert het vermogen van deze CFPS om synthetische cellen in te kapselen om een verscheidenheid aan therapeutische eiwitten te produceren, het potentieel ervan om in klinisch gebruik te worden opgenomen18.
Hier beschrijven we een bottom-up lab-schaal protocol (Figuur 1) voor de productie van RNA en eiwitproducerende synthetische cellen op basis van een CFPS-systeem ingekapseld in een lipide blaasje. Dit toont het mogelijke gebruik van synthetische celplatforms als nieuwe systemen voor de levering van geneesmiddelen voor de on-site productie van een therapeutisch eiwitmedicijn in vivo19. Eerdere studies hebben de optimalisatie van de CFPS-reactie en de cellysaatvoorbereidingsprocessen4,8,20onderzocht. Bovendien zijn verschillende technieken toegepast voor liposoompreparaat ter grootte van celformaat, zoals microfluïdische en polymeergebaseerde druppelstabilisatiemethoden21,22,23, die ook verschillen in de lipidesamenstelling van liposomen24,25,26. In het gepresenteerde protocol worden synthetische cellen geproduceerd met behulp van een water-in-olie emulsieoverdrachtsmethode en wordt het inkapselingsproces uitgevoerd bij lage temperaturen (<4 °C)5,10,24,27,28. Deze milde omstandigheden bleken gunstig te zijn voor het behoud van de bio-functionele integriteit van de moleculaire machines, namelijk ribosomen en eiwitten27,29,30. De lipidesamenstelling van de deeltjes bestaat uit zowel cholesterol als 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC). De eerste is te vinden in alle zoogdiercelmembranen en is essentieel voor de stabiliteit, stijfheid en doorlaatbaarheid vermindering van het membraan, en de laatste bootst zoogdier fosfolipide samenstelling11,13. De cellulaire transcriptie en vertaling moleculaire machines worden gewonnen uit de BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stam, die wordt getransformeerd met pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase om CFPS potentie en eiwitsynthese te verhogen. Dit systeem is gebruikt voor de productie van diagnostische en therapeutische eiwitten, met moleculaire gewichten tot 66 kDa in vitro en in vivo19,31. Het volgende protocol biedt een eenvoudige en effectieve methode voor de productie van het synthetische celsysteem, dat een breed scala aan fundamentele vragen in verband met eiwitsynthese in de natuur kan aanpakken en ook kan worden gebruikt voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De afbeelding van het productieprotocol van de volledige synthetische cellen wordt gepresenteerd in figuur 1. Afhankelijk van de behoeften van de gebruiker kunnen de eiwitexpressie (paragraaf 3.2) en de synthetische celvorming (punt 4) delen van het protocol ook onafhankelijk (met enkele aanpassingen) onafhankelijk worden uitgevoerd.
1. Bereiding van S30-T7 lysaat
- Streepplaat de E. coli BL21(DE3) bacteriën getransformeerd met de T7 RNA polymerase uitdrukken pAR1219 plasmide op een LB-agar plaat aangevuld met 50 μg/mL ampicillin om enkele kolonies te verkrijgen.
- Bereid een starteroplossing voor: inenoculeer een enkele kolonie in 5 mL LB-media aangevuld met 50 μg/mL ampicillin in een 100 mL Erlenmeyer-kolf en groei 's nachts met behulp van een incubatorshaker op 250 tpm en 37 °C. Maak duplicaten voor.
- Inent elke 5 mL starter afzonderlijk in 500 mL tb-media aangevuld met 50 μg/mL ampicillin in een 2 L Erlenmeyer-kolf met schotten en kweek deze met behulp van een incubatorshaker op 250 rpm en 37 °C tot het OD600 van 0,8-1 bereikt. Controleer periodiek met behulp van een spectrofotometer.
- Voeg 2-3 mL van 100 mM voorraad IPTG (tot 0,4 - 0,6 mM) voor inductie van T7 RNA polymerase expressie en blijven groeien van de cultuur totdat het od600bereikt ∙4.
- Breng de oplossing van elke Erlenmeyer-kolf over in twee gesteriliseerde centrifugebuizen van 250 ml.
- Centrifugeer elk op 7.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
LET OP: In dit stadium kan de bacteriële pellet enkele dagen bij -20 °C worden bewaard voordat ze naar de volgende stappen gaan. - Hang elke pellet opnieuw op in 250 mL koude (4 °C) S30 lysatebuffer en centrifugeer op 7.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
OPMERKING: De S30 lysaatbuffer wordt gebruikt voor het handhaven van de eiwitstabiliteit nadat cellyse wordt uitgevoerd met behulp van de homogenisator in stap 1.9. Vanaf deze stap moeten alle stappen tot 1.12 achtereenvolgens en snel worden uitgevoerd.
LET OP: Voordat u doorgaat naar de volgende stap, pre-cool de tips en 1,5-milliliter flesjes die nodig zijn voor het opslaan van de lysaat - Gooi de supernatant weg en hang alle pellets samen op in 15 mL koude S30 lysate buffer. Filter de suspensie met gaaskussen.
LET OP: 15ml oplossing is te wijten aan homogenisator min. volume. Moet worden opgemerkt dat bacteriën concentratie is ook belangrijk. - Homogeniseren bij een werkdruk van 15.000 psi, met een luchtdruk van 4 bar (twee passen) voor celbreuk. Vermijd oplossingverdunning voor een meer geconcentreerd en actief lysaat.
- Voeg 100 μL van 0,1 M DTT (LET) per 10 mL van de gehomogeniseerde suspensie toe.
- Centrifugeer de vering op 24.700 x g gedurende 30 min bij 4 °C.
- Voer de volgende stap snel uit voor het behoud van de lysaatactiviteit: verdeel de supernatant één voor één in 200 μL aliquots in voorgekoelde 1,5 mL-flacons en klik onmiddellijk vast met vloeibare stikstof. Bewaar bij -80 °C voor verder gebruik.
LET OP: DTT is geclassificeerd als irriterend en schadelijk en moet daarom met zorg worden behandeld.
2. Bereiding van lipiden in olieoplossing
- Los POPC en cholesterol in chloroform (CAUTION) afzonderlijk op, elk tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg/mL. Vortex elk flesje afzonderlijk.
- Combineer de componenten in een 2mL glazen flacon: voeg 50 μL POPC in chloroform, 50 μL cholesterol in chloroform en 500 μL minerale olie toe. Voor 100 μL synthetische cellen zijn 2 flacons lipiden in olie nodig.
- Vortex, en verwarm dan ongeveer 1 uur bij 80 °C in een chemische kap om de chloroform te verdampen. Zorg ervoor dat volledige verdamping heeft plaatsgevonden door de opgegeven tijd/omstandigheden te volgen en het volume van de oplossing te controleren.
LET OP: De resulterende lipide-in-olie oplossing kan maximaal twee weken bij kamertemperatuur worden bewaard. Voor betere resultaten wordt aanbevolen om voor elk experiment een nieuwe bereiding te gebruiken. Lipide- en cholesterolverhoudingen kunnen worden gewijzigd volgens de gewenste membraansamenstelling. Een hoge concentratie cholesterol kan leiden tot de vorming van aggregaten in de uiteindelijke synthetische celoplossing.
LET OP: Chloroform is geclassificeerd als irriterend en schadelijk en moet daarom met zorg en in gebieden met rookextractie worden behandeld.
3. Preparaten van uiterlijke, voor- en voedingsoplossingen
- Voorbereiding van voorraadoplossingen
- Bereid de in tabel 2 vermelde voorraadoplossingen voor met ultrazuiver water (UPW).
LET OP: Voorraadoplossingen moeten van tevoren worden voorbereid en bij -20 °C worden opgeslagen tot verder gebruik. Reagens 7 heeft de neiging om aggregaten te vormen. Verwarming tot 37 °C vermindert de aggregatie. Lichte aggregatie heeft geen invloed op de reactie. Reagens 8 oplossing is melkachtig en troebel.
- Bereid de in tabel 2 vermelde voorraadoplossingen voor met ultrazuiver water (UPW).
- Buitenoplossing
- Los glucose op in DNase/RNase-vrije H2O tot een eindconcentratie van 200 mM.
- Bereid voor 100 μL binnenoplossing 1,6 mL van de buitenste oplossing voor.
- Pre-inner oplossing
- Voeg reagentia 1-14 toe op basis van de in tabel 2vermelde bedragen en concentratie . Bereid bijvoorbeeld voor een laatste synthetisch celvolume van 100 μL 100 μL binnenoplossing voor.
OPMERKING: UPW moet worden toegevoegd om het uiteindelijke vereiste volume te voltooien. In dit stadium kan het mengsel enkele uren bij 4 °C worden bewaard.
- Voeg reagentia 1-14 toe op basis van de in tabel 2vermelde bedragen en concentratie . Bereid bijvoorbeeld voor een laatste synthetisch celvolume van 100 μL 100 μL binnenoplossing voor.
- Voeroplossing
- Voeg alle reagentia toe op basis van de in tabel 3 vermelde bedragen en concentratie.
LET OP: Gebruik 1:1 verhouding van de voedingsoplossing:innerlijke oplossing. Bereid voor een laatste synthetisch celvolume van 100 μL 100 μL voedingsoplossing voor. Het wordt aanbevolen om een klein teveel volume van de buitenste, binnenste en voeding oplossing voor te bereiden.
- Voeg alle reagentia toe op basis van de in tabel 3 vermelde bedragen en concentratie.
4. Bereiding van synthetische cellen
OPMERKING: De volgende volumes worden aangepast voor de bereiding van 100 μL synthetische cellen.
- Synthetische cellen die eiwitten produceren
- In een buis van 15 mL, plaats 12 mL van de buitenste oplossing en voeg langzaam, op de top een laag, van 500 μL lipiden in olieoplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Om de voorbereiding van de innerlijke oplossing af te ronden: meng de ingrediënten van de innerlijke oplossing op gemalen ijs tot een eindvolume van 100 μL door het ontdooien en toevoegen van S30-T7 Lysaat (reagens 15) en DNA plasmimid (reagens 16) aan het opgeslagen mengsel.
- Voeg aan de tweede 2 mL glasflacon met 500 μL lipiden in olieoplossing 100 μL van de binnenoplossing toe. Pipette er krachtig op en neer gedurende 1 minuut en vortex voor nog een minuut op niveau vijf.
- Incubeer gedurende 10 min op gemalen ijs en voeg langzaam de resulterende emulsie toe bovenop de oliefase in de 15 mL buis (van 4.1.1).
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 100 x g en 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 10 min bij 400 x g en 4 °C. Tegen het einde van de centrifugering moet een pellet aan de onderkant van de buis worden waargenomen.
OPMERKING: Het gebruik van een swingende emmer centrifuge rotor heeft hier de voorkeur voor het verkrijgen van een betere dekking van een tweede laag lipiden tijdens de water-in-olie druppels passage door de interfase. In het geval dat er geen waarneembare pellet is, kan de centrifugatiesnelheid worden verhoogd tot 1000 x g. Zie anders de sectie Discussie, verwijzend naar de specifieke ernst van de buitenste oplossing. - Haal de pellet eruit.
- Verwijder overtollige olielaag.
- Gebruik een bijgesneden pipettip geladen met ongeveer 400 μL buitenoplossing om de pellet te extraheren. Laat de buitenste oplossing los tijdens het passeren van de oliefase om alleen de pellet in de waterige fase te verzamelen.
- Veeg de punt na de extractie van de pellet om te voorkomen dat de overdracht van olie resten en breng de pellet naar een schone 1,5 mL buis.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 1.000 x g en 4 °C, verwijder de supernatant en hang de pellet opnieuw op in 100 μL voedingsoplossing (1:1 verhouding van binnen:voedings).
LET OP: Hier kan ook een centrifugerotor met vaste hoek worden gebruikt. - Voor eiwitexpressie, incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C zonder te schudden.
LET OP: Optimale incubatietijd varieert tussen verschillende eiwitten. - Evalueer de geproduceerde eiwithoeveelheid met behulp van een geschikte methode op basis van de doeleiwiteigenschappen.
- Aanbevolen controlegroepen
- Innerlijke oplossing en lysate activiteit bevestiging
- Bereid een complete innerlijke oplossing voor (met DNA & S30-T7 lysate).
- Incubeer de bovenstaande reactie onmiddellijk met behulp van een incubatorshaker op de vloer bij 250 rpm of een thermomixer bij 1200 tpm, bij een constante temperatuur van 37 °C gedurende 2 uur.
OPMERKING: Pas de incubatietijd aan op de incubatietijd van de synthetische cellen.
- Synthetische cellen
- Negatieve controlegroep: Bereid het protocol gepresenteerd in 4.1 voor met innerlijke oplossing zonder DNA.
- Positieve controle: Bereid het protocol gepresenteerd in 4.1 met innerlijke oplossing met een T7 plasmide codering voor een reporter gen.
OPMERKING: Voeg naast de testgroepen een positieve controlegroep toe die bestaat uit een meldergen, zoals sfGFP, om de inkapselingsefficiëntiestap te garanderen.
- Innerlijke oplossing en lysate activiteit bevestiging
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We presenteren een protocol voor de bereiding van synthetische cellen door een S30-T7 CFPS-systeem in te kapselen op basis van BL21 E. coli in lipideblaasjes. Een schematische beschrijving van het voorbereidingsproces met een afbeelding van elke fase wordt weergegeven in figuur 2. Het succes van het synthetische celvoorbereidingsproces is afhankelijk van de juiste prestaties van elke fase en wordt uitgevoerd door verschillende parameters. Het protocol moet worden aangepast aan de productie van een specifiek eiwit.
Plasmids uitdrukken van het model eiwit super-map Green Fluorescent Protein (sfGFP) en Renilla Luciferase onder de T7 promotor werden geïntroduceerd in CFPS bulk reacties en synthetische cellen, en eiwitproductie werd geëvalueerd met behulp van verschillende methoden, waaronder westerse vlek, flow cytometrie, microscopie en spectroscopie (Figuur 3). Een verificatie van de sfGFP-Zijn6 gelabeldeiwit (~27 kDa32)productie door westerse vlekanalyse wordt gepresenteerd in figuur 3A. Een monster van 30 μL synthetische cellen verdund 6 plooien werd gemengd met 10 μL van een gemeenschappelijke SDS-PAGE monster buffer (met de detergenten natrium dodecyl sulfaat (SDS) en β-mercaptoethanol) en gekookt voor 10 min (95 oC). We ontdekten dat de combinatie van warmte en wasmiddelen in de monsterbuffer voldoende is om de blaasjes uit elkaar te halen en het gebruik van eiwitten in de SDS-PAGE gel mogelijk te maken. Eiwitdetectie werd uitgevoerd met behulp van anti-Zijn polyklonale primaire antilichaam (verdund 1:12,000). Zoals verwacht wordt er, terwijl eiwitproductie wordt gedetecteerd in monsters die dna-sjablonen ("+sfGFP DNA") bevatten, geen eiwit waarnemen in negatieve controlemonsters waarin de DNA-sjabloon werd uitgesloten ("-DNA"). Monsters van gezuiverde sfGFP en gezuiverde sfGFP ingekapseld in het membraan van synthetische cellen ('sfGFP (ingekapseld)), worden gebruikt als positieve controles voor de sfGFP CFP bulkproductie en voor de synthese ervan binnen synthetische cellen, respectivley. Deze methode kan worden toegepast op verschillende eiwitsoorten. Volgens Krinsky et al.19is de sfGFP-productieopbrengst verkregen volgens het gedetailleerde protocol 380 μg/mL in CFPS-oplossing en 5,3 μg/mL, wanneer de CFPS-oplossing is ingekapseld in lipideblaasjes.
Wanneer het eiwit dat wordt geproduceerd in de synthetische cellen fluorescerend is, kan de productie ervan worden geëvalueerd met behulp van microscopie en flow cytometrie gebaseerde methoden. We analyseerden de synthetische cellen met behulp van een fluorescerende microscoop met een filter voor GFP fluorescentie (Figuur 3B). Aangezien de CFPS-componenten een aantal autofluorescerende elementen hebben, moeten de parameters voor beeldverwerving worden aangepast aan een geschikt negatief controlemonster (synthetische cellen zonder DNA-sjabloon, bijvoorbeeld).
Daarnaast gebruikten we flow cytometrie om de gemiddelde fluorescentieintensiteit van sfGFP-producerende synthetische cellen te bepalen, en het percentage actieve synthetische cellen, dat eiwitten daarin kan produceren (figuur 3C I&II). Voor elk geanalyseerd monster werden 10.000 gebeurtenissen verzameld. De synthetische celproductie, die in dit protocol wordt beschreven, levert meestal een actieve populatie van 21-25% op binnen een oplossing met een geschatte concentratie van 107 synthetische cellen/mL. De lichte fluorescentieintensiteit die wordt gepresenteerd door "-DNA"-monsters in figuur 3C II is te wijten aan de autofluorescentie van verschillende componenten in de CFPS-reactie, zoals het S30-lysaat.
Representatieve grootteanalyse op basis van het GFP-signaal (in diameter) van synthetische cellen die volgens de hierboven beschreven methode zijn voorbereid, toont een gemiddelde waarde van 2,4±0,5 μm (figuur 3D II). Aangezien de vorming van water in olie-emulsie in deze methode een resultaat is van het toepassen van mechanische krachten, kan de grootteverdeling van de deeltjes worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals de methode en de snelheid van het op-en-neer ppetteren van de emulsie, het model van de vortexmixermachine, enz.
Om de veelzijdigheid van de eiwitproductie van synthetische cellen te testen, werd de expressie van het reporter-eiwit Renilla luciferase in synthetische cellen geanalyseerd (Figuur 3E). De test kwantificeerde Renilla luciferase activiteit door het meten van de luminescentie gegenereerd uit de enzymatische reactie van luciferase en het substraat, h-coelenterazine. Om de enzymatische reactie te veroorzaken, werd vlak voor de meting een eindconcentratie van 1 μM h-coelenterazine toegevoegd aan de synthetische cellen (25 μL monstervolume). "-DNA"-monster, dat het luciferase-encoding DNA-sjabloon niet bevat, werd gebruikt als een negatieve controle voor het testen van luminescentie als gevolg van niet-enzymatische oxidatie van het substraat. Luminescentie werd gemeten met behulp van een plaatlezer.
Figuur 1: Een illustratie van het proces voor typische synthetische cellen voorbereiding protocol. Het proces is verdeeld in twee stappen. Stap 1: Pre-experiment preparaten waaronder DNA plasmide zuivering, S30-T7 lysate voorbereiding, voorraad oplossingen voorbereiding die nodig zijn voor de binnen-en voeding oplossingen, lipiden-in-olie oplossing voorbereiding en buitenste oplossing voorbereiding. Stap 2: Synthetische celvorming die voeding en innerlijke oplossingen voorbereiding, synthetische cellen voorbereiding en analyse omvat. Een voorbeeld van het vereiste volume van elk ingrediënt voor de voorbereiding van 100 μL synthetische cellen oplossing wordt gepresenteerd in blauw tussen haakjes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Schematische illustratie van het protocol voor de bereiding van synthetische cellen. Een afbeelding van een goed uitgevoerd proces illustreert elke fase van het protocol. Dit cijfer is gewijzigd van Krinsky et al.19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van de productie van sfGFP en Renilla luciferase in synthetische cellen. (A) Een westerse vlekanalyse van de sfGFP-His6-productie in zowel CFPS-bulkreacties als in synthetische cellen. Eiwitdetectie werd uitgevoerd met behulp van anti-Zijn polyklonale primaire antilichaam (verdund 1:12,000). Gezuiverde sfGFP-His6 werd gebruikt als een positieve controle (7,8 μg). sfGFP (ingekapseld) is een positieve controle van gezuiverde sfGFP ingekapseld in synthetische cellen. Monsters zonder DNA-sjablonen werden gebruikt als een negatieve controle voor de productie-analyse ("-DNA"). (B) Representatieve afbeeldingen van sfGFP produceren synthetische cellen genomen met behulp van een fluorescerende microscoop met een helder veld en een GFP-filter. Schaalbalken = 50 μm. (C) I&II Flow cytometrieanalyse van sfGFP die synthetische cellen activiteit produceert (Gegevens verzameld met behulp van digitale, 4-laser analyzer). De monsters werden gemeten na 3 uur incubatie. Voor elk geanalyseerd monster werden 10.000 gebeurtenissen verzameld. FSC (500 V) en SSC (300 V) filters werden gebruikt om de totale synthetische celpopulatie te definiëren. Vervolgens werd een FITC (600 V) filter gebruikt om GFP fluorescentie te detecteren.. (I) De berekening van de actieve synthetische celpopulatie [%] was gebaseerd op de gfp-fluorescentieintensiteitsdrempel, gedefinieerd door het "-DNA"-monster (rood histogram), waardoor een fout van ~1% mogelijk was. II) Gemiddelde fluorescentieintensiteit van sfGFP-productie synthetische cellen. Deze waarde werd berekend op basis van de actieve synthetische celpopulatie en genormaliseerd tot het "-DNA"-monster door de gemiddelde fluorescentie van de actieve synthetische cellen te delen door het gemiddelde van de synthetische cellen zonder sfGFP-DNA. (D) I&II Synthetische celgrootteanalyse. Het emissiespectrum werd gedetecteerd door respectievelijk 505-560 nm en 642-745 nm voor GFP- en heldere veldsignalen. (I) Een representatief beeld van de geanalyseerde synthetische cellen. II) verdeling van de grootte van synthetische cellen. Er werd analyse uitgevoerd en de diameterverdelingen van de actieve synthetische cellen werd berekend op basis van het GFP-signaal. (E) Productie van actieve Renilla luciferase in synthetische cellen. Luciferase activiteit werd gekwantificeerd met luminescentie metingen na de toevoeging van 1 μM h-coelenterazine met behulp van een plaatlezer en gepresenteerd als lichtintensiteit [RLU] x 106. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Tabel 1: Voorbereiding van buffer- en voorraadoplossingen. | |
| Opmerkingen | |
| Luria Bertani (LB) agar (1,5%) Plaat: | Voorbereiden en steriliseren. Voeg Ampicillin bij een eindconcentratie van 50 μg/mL pas na afkoeling toe tot kamertemperatuur. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L Natriumchloride (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-gistextract | |
| 15 g/L Agar agar gezuiverd | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| LB media (20 mL): | Minimale media. Voorbereiden en steriliseren op voorhand. Net voordat u de bacteriën inent, voegt u Ampicillin toe met een uiteindelijke concentratie van 50 μg/mL. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L Natriumchloride (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-gistextract | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| Terrific Broth (TB) media (1 L): | Rijke media. Voorbereiden en steriliseren op voorhand. Net voordat u de bacteriën inent, voegt u Ampicillin toe met een uiteindelijke concentratie van 50 μg/mL. |
| 12 g/L Bacto-tryptone | |
| 24 g/L Bacto-gistextract | |
| 4% (v/v) Glycerol watervrije | |
| 2,32 g/L K2HPO4 | |
| 12,54 g/L KH2PO4 | |
| 50 μg/mL Ampicillin | |
| S30 lysate buffer (1,5 L): | Bereid en steriliseer vooraf (*exclusief DTT en 2-mercaptoethanol). Bewaar op -4 °C. |
| 10 mM Tris-acetaat bij pH = 7,4 | Trisma-basis. Bereid de pH voor op 7,4 met azijnzuur. |
| Magnesiumacetaat van 14 mM | |
| 60 mm kaliumacetaat | |
| *1 mDTT | Vlak voor gebruik toevoegen |
| *0,5 mL/L 2-mercapto-ethanol | Vlak voor gebruik toevoegen |
| 1 M HEPES-KOH (pH = 8): | Los HEPES op tot een eindconcentratie van 1 M. Pas aan op pH 8 met koh-oplossing. |
| HEPES HEPES | |
| Kaliumhydroxide (KOH) | |
| Tabel 2: Samenstelling van de binnenoplossing. | ||||||||||
| Eindaanvraag Inner-oplossingsvolume | ||||||||||
| Nummer | Reagens | Aandelen conc. | Laatste conc. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μ L | |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Pre-Inner oplossing |
| 2 | Magnesiumacetaat | 1 M | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Kaliumacetaat | 1 M | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Ammoniumacetaat | 5,2 M | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0,5 m | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Aminozuren - mengsel I | 50 m | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Aminozuren - mengsel II | 50 m | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Sacharose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | DNA plasmide | 10 μg/mL | * | * | * | * | * | * | ||
| Tabel 3: Samenstelling van de voedingsoplossing. | |||||||||
| Volume van de eindgevraagde voedingsoplossing | |||||||||
| Nummer | Reagens | voorraad conc. | laatste conc. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μL |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 M | 83,3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Magnesiumacetaat | 1 M | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Kaliumacetaat | 1 M | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Ammoniumacetaat | 5,2 M | 236,4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0,5 m | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Aminozuren - mengsel I | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Aminozuren - mengsel II | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | Gtp | 50 mM | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG | 100 mM | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glucose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tabel 4: Vereiste oplossingen voor de bereiding van synthetische cellen. | |
| Oplossing en materialen vereist | Opmerkingen |
| Lipiden in olie | Bewaar op kamertemperatuur tot gebruik. Voorbereid overeenkomstig afdeling 2 |
| Buitenoplossing | Bereid overeenkomstig punt 3.1 |
| Innerlijke oplossing | Bereid volgens punt 3.2. |
| Testtests + controles monsters volgens punt 4.1. | |
| Blijf op gemalen ijs tot gebruik. | |
| Voeroplossing | Bereid volgens punt 3.3. |
| Blijf op gemalen ijs tot gebruik. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol introduceert een eenvoudige en betaalbare methode voor de productie van grote hoeveelheden eiwitproducerende synthetische cellen. De opbrengst van actieve cellen is afhankelijk van een zorgvuldige en nauwkeurige uitvoering van het protocol met de nadruk op verschillende kritische stappen. In het lysaatpreparaat gedeelte van deze methode, is het essentieel om de juiste bacteriëndichtheid vóór cellyse te bereiken om een voldoende hoeveelheid proteïnen in het bacteriële lysaat te bereiken. Ten tweede moet het lyseproces worden uitgevoerd bij 4 °C en moet het lysaat snel worden ingevroren met vloeibare stikstof om de eiwitactiviteit te behouden. Bovendien gebruikten we in dit protocol E. coli BL21(DE3) cellen getransformeerd met pAR1219 plasmide die T7 RNA polymerase uitdrukten. In gevallen waarin een andere stam van bacteriën wordt gebruikt, kunnen veranderingen in de lysateconcentratie nodig zijn om een bevredigende hoeveelheid RNA polymerase en ribosomen te bereiken. Zelfs wanneer dezelfde bacteriële stam wordt gebruikt, verschillende lysate producties kunnen een aantal batch-to-batch variabiliteit.
De blaasproductie sectie bevat ook een paar belangrijke stappen. Oplosbaarheid van de lipiden en verwijdering van het chloroform uit de minerale olie is belangrijk voor het vaststellen van de water-in-olie emulsie. De centrifugering van de water-in-olie druppels in de buitenste waterige buffer is ook een belangrijke stap in het protocol om synthetische cellen te genereren met een lipide bilayer. Veranderingen in de binnenste oplossing van de blaasjes en de lipidesamenstelling kunnen leiden tot een laag druppels in de olie-water interfase zonder waarneembare pellet. Om dit te overwinnen, is een snelle oplossing om de centrifugatiesnelheid te verhogen tot 1.000 x g in de emulsieoverdrachtstap. In het geval dat dit het probleem niet oplost, kan de specifieke ernst van de buitenste waterige oplossing worden gewijzigd om ervoor te zorgen dat de innerlijke oplossing een hogere specifieke zwaartekracht heeft dan de buitenste oplossing. Bovendien kan de osmolaliteit van de innerlijke oplossing ook variëren tussen verschillende lysate bronnen en producties, variërend van 800-1100 mOsm/kg. Variabiliteit in de osmolaliteit van de binnenoplossing is vooral te wijten aan veranderende concentraties van het lysaat tijdens het productieproces. Meestal leidt dit niet tot significante veranderingen in de eiwitproductie, maar een grote verdunning kan leiden tot een verminderde opbrengst als gevolg van lage concentraties van de transcriptie- en vertaalenzymen in het lysaat zelf. Het meten van de totale eiwitconcentratie in elke lysaatbatch kan helpen bij het afstemmen van lysateconcentraties in de binnenoplossing om constante waarden te behouden (ongeveer 22 mg/mL gemeten door Bradford-test).
Niettemin heeft deze methode een aantal beperkingen die moeten worden vermeld. Niet alle gegenereerde synthetische cellen zijn actief en in staat om eiwitten te produceren als gevolg van onvolledige inkapseling van alle vereiste componenten. We hebben ongeveer 21-25% van de actieve cellen gemeten bij de productie van sfGFP-uitdrukkende synthetische cellen met behulp van stroomcytometrie (er werden geen significante grootteverschillen waargenomen tussen actieve en inactieve cellen). Olie en lipide overtollige residuen blijven af en toe in het tweelaagse lipidemembraan na de overdracht van de synthetische cellen in de waterige fase. Het optimaliseren van de lipide- en cholesterolconcentraties in de oliefase kan dit probleem verbeteren. Het is ook belangrijk op te merken dat de grootteverdeling van de verkregen synthetische cellen vrij breed is in vergelijking met alternatieve microfluïdische methoden, met blaasjes variërend van ongeveer 1-50 μm.
De hoge opbrengst van de emulsieoverdrachtsmethode maakt het bijzonder geschikt voor synthetische cellen die celvrije eiwitsynthesesystemen inkapselen voor therapeutische eiwitproductie. Verschillende variaties van de emulsieoverdrachtsmethode zijn gebruikt in synthetische celstudies en omvatten veranderingen in de oliebereidingsprocedure, membraansamenstelling, monstervolume, binnenoplossing-olieverhouding en centrifugatiesnelheden5,24,28. Microfluïde en polymeergebaseerde druppelstabilisatiemethoden zijn ook gebruikt voor de bereiding van synthetische cellen, maar inkapseling van het hele CFPS-systeem is nog niet uitgevoerd met deze methoden21,22,23.
De synthetische cellen die met deze methode werden verkregen, werden in vivo getoond om eiwitten te produceren en kanker te behandelen in murinemodellen19. De mogelijkheden van deze cellen kunnen in de toekomst verder worden uitgebreid dan eiwitexpressie. Integratie van andere cellulaire processen zoals cellulaire communicatie, cytoskeletmodificatie en celdeling in synthetische cellen zijn onlangs beschreven33,34,35,36. Vervanging van het bacteriële lysaat door eukaryotisch cellysaat zal expressie van eiwitten met een hogere complexiteit en post-translationele modificaties mogelijk maken, en zal misschien minder immunogeen zijn, zelfs zonder een reinigingsprocedure, waardoor meer therapeutische grenzen worden geopend37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door ERC-STG-2015-680242.
De auteurs erkennen ook de steun van het Technion Integrated Cancer Center (TICC); het Russell Berrie Nanotechnology Institute; het Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; het Israëlische ministerie van Economie voor een Kamin-subsidie (52752); het Ministerie van Israël van De Technologie en de Ruimte van de wetenschap van Israël - Bureau van de Belangrijkste Wetenschapper (3-11878); de Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); de Israel Cancer Association (2015-0116); de Duits-Israëlische Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek en Ontwikkeling voor een GIF Young-subsidie (I-2328-1139.10/2012); het FP-7 IRG-programma van de Europese Unie voor een loopbaanintegratiebeurs (908049); het Phosfolipide Research Center Grant; een Rosenblatt Foundation for cancer research, een Mallat Family Foundation Grant; en de Unger Family Foundation. A. Schröder erkent Alon en Taub Fellowships. O. Adir erkent de Sherman en Gutwirth beurzen. G. Chen erkent de Sherman Fellowship. N. Krinsky erkent de barones Ariane de Rothschild Women Doctoral Program van de Rothschild Caesarea Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
