Questo protocollo descrive il metodo, i materiali, le attrezzature e i passaggi per la preparazione bottom-up di RNA e proteine che producono cellule sintetiche. Il compartimento acquoso interno delle cellule sintetiche conteneva il lisato batterico S30 incapsulato all’interno di un bistrato lipidico (cioè liposomi stabili), utilizzando un metodo di trasferimento dell’emulsione dell’acqua-in-olio.
L’approccio di assemblaggio bottom-up per la costruzione di cellule sintetiche è uno strumento efficace per isolare e studiare i processi cellulari in un ambiente di imitazione cellulare. Inoltre, lo sviluppo di sistemi di espressione senza cellule ha dimostrato la capacità di ricostituire i processi di produzione, trascrizione e traduzione delle proteine (DNA-RNA-proteina) in modo controllato, sfruttando la biologia sintetica. Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di un sistema di espressione privo di cellule, compresa la produzione di un potente lisato batterico e incapsulando questo lisato all’interno di vescicle giganti di unilamellar a base di lipidi a base di colesterolo (GUV) (cioè liposomi stabili), per formare cellule sintetiche. Il protocollo descrive i metodi per preparare i componenti delle cellule sintetiche, compresa la produzione di lismi batterici attivi, seguiti da una preparazione dettagliata passo-passo delle cellule sintetiche sulla base di un metodo di trasferimento dell’emulsione acqua-in-olio. Questi facilitano la produzione di milioni di cellule sintetiche in modo semplice e conveniente con un’elevata versatilità per la produzione di diversi tipi di proteine. Le cellule sintetiche ottenute possono essere utilizzate per studiare la produzione e l’attività di proteine/RNA in un ambiente isolato, in evoluzione diretta, e anche come piattaforma di somministrazione controllata di farmaci per la produzione on demand di proteine terapeutiche all’interno del corpo.
Le cellule sintetiche sono particelle artificiali simili a cellule, che imitano una o più funzioni di una cellula vivente, come la capacità di dividere, formare interazioni di membrana e sintetizzare proteine basate su un codice genetico1,2,3. Le cellule sintetiche che racchiudono sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) possiedono un’elevata modularità grazie alla loro capacità di produrre varie proteine e sequenze di RNA dopo alterazioni nel modello di DNA. Presentando un’alternativa interessante agli attuali approcci di produzione di proteine, i sistemi CFPS si basano su lisa cellule, componenti purificati o componenti sintetici e comprendono tutti i meccanismi di trascrizione e traduzione necessari per la sintesi proteica come ribosomi, RNA polymerasi, aminoacidi e fonti energetiche (ad esempio, 3-fosforocifo e tripofosfato adenina)4,5,6,7,,8,. L’incapsulamento di un sistema CFPS all’interno di vescicoli lipidi consente la produzione semplice ed efficiente di proteine senza dipendere da una cellula vivente10. Inoltre, questa piattaforma permette la sintesi di peptidi che possono degradare all’interno delle cellule naturali, produzione di proteine tossiche per le cellule viventi, e modificare le proteine con aminoacidi non naturali11,12. Le cellule sintetiche sono state utilizzate come modello per scopi di ricerca studiando i componenti cellulari minimi necessari per consentire la vita cellulare da una prospettiva evolutiva1,13. Le cellule sintetiche sono state utilizzate anche per costruire e implementare circuiti genetici e come modelli per l’evoluzione diretta14,15,16. Altri studi si sono concentrati sulla capacità delle cellule sintetiche di imitare l’attività biologica delle cellule naturali, con l’obiettivo di sostituire le cellule naturali danneggiate, come le cellule beta in pazienti con diabete17. Inoltre, la capacità di questi CFPS che incapsulano le cellule sintetiche di produrre una varietà di proteine terapeutiche illustra il suo potenziale per essere incorporato nell’uso clinico18.
Qui descriviamo un protocollo di laboratorio-scala dal basso verso l’alto (Figura 1) per la produzione di RNA e cellule sintetiche che producono proteine sulla base di un sistema CFPS incapsulato in una vescicola lipidica. Questo dimostra il potenziale uso di piattaforme di cellule sintetiche come nuovi sistemi di somministrazione di farmaci per la produzione in loco di un farmaco terapeutico proteico in vivo19. Studi precedenti hanno studiato l’ottimizzazione della reazione CFPS e i processi di preparazione del lisato cellulare4,8,20. Inoltre, sono state applicate diverse tecniche per la preparazione del liposoma di dimensioni cellulari, come i metodi di stabilizzazione delle goccioline microfluidiche e polimeriche21,22,23, che differiscono anche nella composizione lipida dei liposomi24,25,26. Nel protocollo presentato, le cellule sintetiche vengono prodotte utilizzando un metodo di trasferimento dell’emulsione dell’acqua e dell’olio e il processo di incapsulamento viene eseguito a basse temperature (<4 ))5,10,24,27,28. Queste condizioni lievi sono state trovate per essere favorevoli per mantenere l’integrità bio-funzionale del macchinario molecolare, vale a dire ribosomi e proteine27,29,30. La composizione lipidica delle particelle è costituita sia da colesterolo che da 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). Il primo si trova in tutte le membrane cellulari dei mammiferi ed è essenziale per la stabilità, rigidità e riduzione della permeabilità della membrana, e quest’ultimo imita la composizione fosforlipide mammifera11,13. La trascrizione cellulare e la macchina molecolare di traslazione vengono estratte dal ceppo BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), che viene trasformato con pAR1219 plasmide sovraesprimendo la polimerasi dell’RNA T7 per aumentare la potenza CFPS e la sintesi proteica. Questo sistema è stato utilizzato per produrre proteine diagnostiche e terapeutiche, con pesi molecolari fino a 66 kDa in vitro e in vivo19,31. Il seguente protocollo fornisce un metodo semplice ed efficace per la produzione del sistema di cellule sintetiche, che può affrontare una vasta gamma di questioni fondamentali associate alla sintesi proteica in natura e può essere utilizzato anche per applicazioni di somministrazione di farmaci.
Questo protocollo introduce un metodo semplice e conveniente per la produzione di grandi quantità di cellule sintetiche che producono proteine. La resa delle cellule attive dipende da un’attenta e accurata esecuzione del protocollo con particolare attenzione a diversi passaggi critici. Nella sezione di preparazione del lisa di questo metodo, è essenziale raggiungere la densità di batteri appropriata prima della lisi cellulare per ottenere una quantità sufficiente di proteine nel lisato batterico. In secondo luogo, il…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da ERC-STG-2015-680242.
Gli autori riconoscono anche il sostegno del Technion Integrated Cancer Center (TICC); il Russell Berrie Nanotechnology Institute; il Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; il Ministero dell’Economia di Israele per una borsa di studio Kamin (52752); Il Ministero israeliano della tecnologia scientifica e dello spazio – Ufficio del Capo Scienziato (3-1878); la Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); l’Associazione europea contro il cancro (2015-0116); la Fondazione tedesco-israeliana per la ricerca scientifica e lo sviluppo di una borsa di studio GIF Young (I-2328-1139.10/2012); il programma IRG FP-7 dell’Unione europea per una sovvenzione per l’integrazione di carriera (908049); il Phospholipid Research Center Grant; una Rosenblatt Foundation for cancer research, una Sovvenzione della Mallat Family Foundation; e la Fondazione unger Family. A. Schroeder riconosce alon e alle borse di studio Taub. O. Adir riconosce le borse di studio Sherman e Gutwirth. G. Chen riconosce la Compagnia Sherman. N. Krinsky riconosce la baronessa Ariane de Rothschild Women Doctoral Program dalla Fondazione Rothschild Caesarea.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |