פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.
גישת ההרכבה מלמטה-למעלה לבניית תאים סינתטיים היא כלי יעיל לבידוד ולחקירת תהליכים סלולאריים בסביבה תא מחקה. יתר על כן, הפיתוח של מערכות ביטויים ללא תא הפגינו את היכולת ליצור מחדש את ייצור החלבון, שעתוק ותהליכי תרגום (DNA → RNA ← חלבון) באופן מבוקר, רתימת ביולוגיה סינתטית. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מערכת ביטוי ללא תא, כולל הייצור של ליפוסט בקטריאלי חזק ו encapsulating זה ליפוסט בתוך כולסטרול עשיר מבוסס השומנים ענק unilamellar שלפוחיות (GUVs) (כלומר, ליפוזומים יציבים), כדי ליצור תאים סינתטיים. הפרוטוקול מתאר את השיטות להכנת הרכיבים של התאים הסינתטיים, כולל ייצור ליטים חיידקיים פעילים, ואחריו הכנה מפורטת של שלב אחר שלב של התאים הסינתטיים המבוססים על שיטת העברת אמולסיה בשמן מים. אלה מקלים על ייצור מיליוני תאים סינתטיים באופן פשוט ובמחיר נוח עם רב-תכליתיות גבוהה להפקת סוגים שונים של חלבונים. התאים הסינתטיים המתקבלים ניתן להשתמש כדי לחקור את הייצור של חלבון/RNA ופעילות בסביבה מבודדת, האבולוציה מכוונת, וגם כפלטפורמת משלוח סמים מבוקרת לייצור על פי דרישה של חלבונים טיפוליים בתוך הגוף.
תאים סינתטיים הם חלקיקים כמו תא מלאכותי, מחקה פונקציות אחת או מרובות של תא חי, כגון היכולת לחלק, אינטראקציה ממברנה טופס, ולסנתז חלבונים על בסיס קוד גנטי1,2,3. תאים סינתטיים התוחמים את התאים ללא חלבון סינתזה (CFPS) מערכות בעלי מודולריות גבוהים בשל יכולתם לייצר חלבונים שונים רצפי RNA לאחר שינויים בתבנית ה-DNA. הצגת חלופה אטרקטיבית לגישות הנוכחיות של ייצור החלבון, מערכות cfps מבוססות על תאי ליפוסט, רכיבים מטוהרים או רכיבים סינתטיים וכוללים את כל מכונות התמלול והתרגום הדרושות לסינתזה חלבונים כגון ריבוזומים, RNA פולימראז, חומצות אמינו ומקורות אנרגיה (למשל, 3-פוספוליגליט ואדלין טריפוספט)4,5,6,7,8,9. האנקפסולציה של מערכת CFPS בתוך שלפוחיות השומנים מאפשר ייצור פשוט ויעיל של חלבונים ללא תלות תא חי10. יתר על כן, פלטפורמה זו מאפשרת סינתזה של פפטידים שעלולים לבזות בתוך תאים טבעיים, ייצור של חלבונים רעילים לתאים חיים, ולשנות חלבונים עם חומצות אמינו לא טבעיות11,12. תאים סינתטיים שימשו כמודל למטרות מחקר החוקרים את רכיבי התא המינימלי הנדרש כדי לאפשר את החיים הסלולריים מנקודת מבט אבולוציונית1,13. תאים סינתטיים גם שימשו כדי לבנות וליישם מעגל גנטי וכמודלים עבור אבולוציה מכוונת14,15,16. מחקרים אחרים התמקדו ביכולת של תאים סינתטיים לחקות את הפעילות הביולוגית של תאים טבעיים, במטרה להחליף תאים טבעיים פגומים, כגון תאים ביתא בחולים עם סוכרת17. יתר על כן, היכולת של אלה CFPS encapsulating תאים סינתטיים כדי לייצר מגוון של חלבונים טיפוליים ממחיש את הפוטנציאל שלה להיות שולבו לשימוש קליני18.
כאן אנו מתארים מלמטה-up פרוטוקול בקנה מידה (איור 1) לייצור של רנ א ו חלבון להפקת תאים סינתטיים מבוסס על מערכת cfps מקומסת ב vesicle השומנים. זה מראה את השימוש הפוטנציאלי של פלטפורמות תאים סינתטיים כמו מערכות משלוח התרופה הרומן לייצור באתר של תרופה לחלבון טיפולית ב vivo19. מחקרים קודמים חקרו את האופטימיזציה של התגובה cfps ואת תהליכי ההכנה של התא ליפוסט4,8,20. יתר על כן, טכניקות מספר הוחלו עבור ליפוכי תא בגודל הכנה, כגון microflu, מבוססי פולימר שיטות ייצוב מבוסס droplet21,22,23, אשר גם שונים ליפוזומים ‘ הרכב השומנים24,25,26. בפרוטוקול המוצג, תאים סינתטיים מיוצרים באמצעות שיטת העברת אמולסיה בשמן מים ותהליך עטיפת האנקפסולציה מבוצע בטמפרטורות נמוכות (< 4 ° c)5,10,24,27,28. תנאים אלה מתון נמצאו חיוביות עבור שמירה על היושרה הביו תפקודית של המכונות המולקולריות, כלומר ריבוזומים וחלבונים27,29,30. הרכב השומנים של החלקיקים מורכב הן של כולסטרול והן 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC). הראשון נמצא בכל ממברנות התא של היונקים, והוא חיוני עבור יציבות, קשיחות וחדירות הפחתת הקרום, ואת האחרון מחקה ממגלית פוספוליפיד הרכב11,13. תמלול ותרגום מכונות מולקולריות של הסלולר מופקים BL21 (DE3) es, מאמץ קולי (E. coli) זן, אשר הופך עם pAR1219 פלמביטוי יתר T7 RNA פולימראז כדי להגדיל את העוצמה cfps וסינתזה חלבון. מערכת זו שימש כדי לייצר חלבונים אבחון וטיפולי, עם משקולות מולקולרים של עד 66 kda ב מבחנה ב vivo19,31. הפרוטוקול הבא מספק שיטה פשוטה ואפקטיבית לייצור מערכת התאים הסינתטית, שיכולה לענות על מגוון רחב של שאלות עקרוניות הקשורות לסינתזה החלבונים בטבע ויכולה לשמש גם ליישומים של משלוחי סמים.
פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ובמחיר נוח לייצור כמויות גדולות של תאים סינתטיים המייצרים חלבונים. התשואה של תאים פעילים תלויה בביצוע קפדני ומדויק של הפרוטוקול עם דגש על מספר שלבים קריטיים. בסעיף ההכנה ליפוסט של שיטה זו, חיוני להגיע לצפיפות החיידקים המתאימה לפני הפירוק התאים כדי להשיג כמות מ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי ERC-STG-2015-680242.
המחברים גם מכירים בתמיכת מרכז הסרטן המשולב של הטכניון (TICC); מכון ראסל ברי לננוטכנולוגיה; המרכז הבינתחומי הראשי למדעי החיים & הנדסה; משרד הכלכלה הישראלי למענק כמאנה (52752); משרד המדע של הטכנולוגיה והחלל – משרד המדען הראשי (3-11878); הקרן הישראלית למדע (1778/13, 1421/17); האגודה הישראלית לסרטן (2015-0116); הקרן הגרמנית-ישראלית למחקר ופיתוח מדעי לגרנט הצעיר GIF (I-2328-1139.10/2012); האיחוד האירופי FP-7 IRG תוכנית עבור מענק אינטגרציה לקריירה (908049); מרכז המחקר פוספוליפיד מענק; קרן רוזנבלט לחקר הסרטן, מלגת קרן משפחת מאלון; וקרן משפחת אונגר. א. שרדר מכיר במלגות אלון וטאוב. א. אדיר מכיר במלגות שרמן וגוטוויה. ז. חן מכיר במלגת שרמן. נ. קרינסקי מכיר בתוכנית הדוקטורט לנשים ברונית אריאן דה רוטשילד מקרן רוטשילד בקיסריה.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |