Summary
פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.
Abstract
גישת ההרכבה מלמטה-למעלה לבניית תאים סינתטיים היא כלי יעיל לבידוד ולחקירת תהליכים סלולאריים בסביבה תא מחקה. יתר על כן, הפיתוח של מערכות ביטויים ללא תא הפגינו את היכולת ליצור מחדש את ייצור החלבון, שעתוק ותהליכי תרגום (DNA → RNA ← חלבון) באופן מבוקר, רתימת ביולוגיה סינתטית. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מערכת ביטוי ללא תא, כולל הייצור של ליפוסט בקטריאלי חזק ו encapsulating זה ליפוסט בתוך כולסטרול עשיר מבוסס השומנים ענק unilamellar שלפוחיות (GUVs) (כלומר, ליפוזומים יציבים), כדי ליצור תאים סינתטיים. הפרוטוקול מתאר את השיטות להכנת הרכיבים של התאים הסינתטיים, כולל ייצור ליטים חיידקיים פעילים, ואחריו הכנה מפורטת של שלב אחר שלב של התאים הסינתטיים המבוססים על שיטת העברת אמולסיה בשמן מים. אלה מקלים על ייצור מיליוני תאים סינתטיים באופן פשוט ובמחיר נוח עם רב-תכליתיות גבוהה להפקת סוגים שונים של חלבונים. התאים הסינתטיים המתקבלים ניתן להשתמש כדי לחקור את הייצור של חלבון/RNA ופעילות בסביבה מבודדת, האבולוציה מכוונת, וגם כפלטפורמת משלוח סמים מבוקרת לייצור על פי דרישה של חלבונים טיפוליים בתוך הגוף.
Introduction
תאים סינתטיים הם חלקיקים כמו תא מלאכותי, מחקה פונקציות אחת או מרובות של תא חי, כגון היכולת לחלק, אינטראקציה ממברנה טופס, ולסנתז חלבונים על בסיס קוד גנטי1,2,3. תאים סינתטיים התוחמים את התאים ללא חלבון סינתזה (CFPS) מערכות בעלי מודולריות גבוהים בשל יכולתם לייצר חלבונים שונים רצפי RNA לאחר שינויים בתבנית ה-DNA. הצגת חלופה אטרקטיבית לגישות הנוכחיות של ייצור החלבון, מערכות cfps מבוססות על תאי ליפוסט, רכיבים מטוהרים או רכיבים סינתטיים וכוללים את כל מכונות התמלול והתרגום הדרושות לסינתזה חלבונים כגון ריבוזומים, RNA פולימראז, חומצות אמינו ומקורות אנרגיה (למשל, 3-פוספוליגליט ואדלין טריפוספט)4,5,6,7,8,9. האנקפסולציה של מערכת CFPS בתוך שלפוחיות השומנים מאפשר ייצור פשוט ויעיל של חלבונים ללא תלות תא חי10. יתר על כן, פלטפורמה זו מאפשרת סינתזה של פפטידים שעלולים לבזות בתוך תאים טבעיים, ייצור של חלבונים רעילים לתאים חיים, ולשנות חלבונים עם חומצות אמינו לא טבעיות11,12. תאים סינתטיים שימשו כמודל למטרות מחקר החוקרים את רכיבי התא המינימלי הנדרש כדי לאפשר את החיים הסלולריים מנקודת מבט אבולוציונית1,13. תאים סינתטיים גם שימשו כדי לבנות וליישם מעגל גנטי וכמודלים עבור אבולוציה מכוונת14,15,16. מחקרים אחרים התמקדו ביכולת של תאים סינתטיים לחקות את הפעילות הביולוגית של תאים טבעיים, במטרה להחליף תאים טבעיים פגומים, כגון תאים ביתא בחולים עם סוכרת17. יתר על כן, היכולת של אלה CFPS encapsulating תאים סינתטיים כדי לייצר מגוון של חלבונים טיפוליים ממחיש את הפוטנציאל שלה להיות שולבו לשימוש קליני18.
כאן אנו מתארים מלמטה-up פרוטוקול בקנה מידה (איור 1) לייצור של רנ א ו חלבון להפקת תאים סינתטיים מבוסס על מערכת cfps מקומסת ב vesicle השומנים. זה מראה את השימוש הפוטנציאלי של פלטפורמות תאים סינתטיים כמו מערכות משלוח התרופה הרומן לייצור באתר של תרופה לחלבון טיפולית ב vivo19. מחקרים קודמים חקרו את האופטימיזציה של התגובה cfps ואת תהליכי ההכנה של התא ליפוסט4,8,20. יתר על כן, טכניקות מספר הוחלו עבור ליפוכי תא בגודל הכנה, כגון microflu, מבוססי פולימר שיטות ייצוב מבוסס droplet21,22,23, אשר גם שונים ליפוזומים ' הרכב השומנים24,25,26. בפרוטוקול המוצג, תאים סינתטיים מיוצרים באמצעות שיטת העברת אמולסיה בשמן מים ותהליך עטיפת האנקפסולציה מבוצע בטמפרטורות נמוכות (< 4 ° c)5,10,24,27,28. תנאים אלה מתון נמצאו חיוביות עבור שמירה על היושרה הביו תפקודית של המכונות המולקולריות, כלומר ריבוזומים וחלבונים27,29,30. הרכב השומנים של החלקיקים מורכב הן של כולסטרול והן 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC). הראשון נמצא בכל ממברנות התא של היונקים, והוא חיוני עבור יציבות, קשיחות וחדירות הפחתת הקרום, ואת האחרון מחקה ממגלית פוספוליפיד הרכב11,13. תמלול ותרגום מכונות מולקולריות של הסלולר מופקים BL21 (DE3) es, מאמץ קולי (E. coli) זן, אשר הופך עם pAR1219 פלמביטוי יתר T7 RNA פולימראז כדי להגדיל את העוצמה cfps וסינתזה חלבון. מערכת זו שימש כדי לייצר חלבונים אבחון וטיפולי, עם משקולות מולקולרים של עד 66 kda ב מבחנה ב vivo19,31. הפרוטוקול הבא מספק שיטה פשוטה ואפקטיבית לייצור מערכת התאים הסינתטית, שיכולה לענות על מגוון רחב של שאלות עקרוניות הקשורות לסינתזה החלבונים בטבע ויכולה לשמש גם ליישומים של משלוחי סמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: האיור המלא של פרוטוקול הייצור של התאים הסינתטיים מוצג באיור 1. על פי צורכי המשתמש, ביטוי החלבון (סעיף 3.2) והיווצרות תאים סינתטיים (סעיף 4) חלקים מהפרוטוקול יכול להתבצע גם באופן עצמאי (עם כמה עיבודים).
1. הכנת S30-T7 ליפוסט
- פס הצלחת ה -E. coli BL21 (DE3) חיידקים השתנה עם T7 RNA פולימראז המבטא pAR1219 פלמיד על צלחת LB-אגר שיושלם עם 50 μg/mL אמפיצילין להשיג מושבות יחיד.
- הכנת פתרון המתנע: אינוחסן מושבה אחת לתוך 5 מ ל של LB-מדיה שיושלם עם 50 μg/mL אמפיצילין ב 100 mL Erlenmeyer בקבוקון ולגדול לילה באמצעות החממה שייקר הרצפה ב 250 rpm ו 37 ° c. . הכן כפילויות
- לחישוב כל 5 מ ל המתנע בנפרד לתוך 500 mL של מדיה TB בתוספת 50 μg/mL אמפיצילין בקבוקון 2 L Erlenmeyer אייר עם הצקות ולצמוח אותו באמצעות שייקר החממה רצפה ב 250 סל"ד ו 37 ° c עד שהוא מגיע OD600 של 0.8-1. הצג באופן תקופתי באמצעות ספקטרוסקופיה.
- הוסף 2-3 mL של 100 mM מלאי של IPTG (כדי להגיע 0.4-0.6 mM) עבור אינדוקציה של T7 RNA פולימראז ביטוי ולהמשיך לגדל את התרבות עד שהוא מגיע OD600≈ 4.
- להעביר את הפתרון מכל בקבוקון Erlenmeyer אייר לתוך 2 250 mL לצינורות צנטריפוגה מעוקר.
- צנטריפוגה כל אחד ב 7,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את הגלולה החיידקית ב-20 ° c למשך מספר ימים לפני המעבר לשלבים הבאים. - להשעות מחדש כל גלולה ב 250 mL של קר (4 ° צ') מאגר S30 lysate צנטריפוגה ב 7,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
הערה: מאגר S30 lysate משמש לשמירה על יציבות החלבון לאחר הליזה התאים מבוצעת באמצעות הומוגניצר בשלב 1.9. משלב זה קדימה, כל הצעדים עד 1.12 צריך להתבצע ברציפות ובמהירות.
הערה: לפני שתמשיך לשלב הבא, מגניב מראש את הטיפים ומבחנות 1.5-מיליליטר שיהיה צורך לאחסן את הליפוסט - להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את כל כדורי יחד 15 מ ל של מאגר S30 lysate קר. לסנן את ההשעיה באמצעות פד גזה.
הערה: 15ml של פתרון הוא בשל נפח הומוגניצר min. יש לשים לב כי הריכוז חיידקים הוא גם חשוב. - הומוגון בלחץ העבודה של 15,000 psi, עם לחץ אוויר של 4 בר (שני מעברי) עבור שבירה תא. הימנע דילול הפתרון עבור ליפוסט מרוכז ופעיל יותר.
- הוסף 100 μL של 0.1 M DTT (זהירות) עבור 10 מ ל של ההשעיה המהומוגניים.
- צנטריפוגה את ההשעיה ב 24,700 x g עבור 30 דקות ב 4 ° c.
- בצע את הצעד הבא במהירות עבור שמירה על פעילות ליפוסט: לחלק את supernatant אחד על אחד לתוך 200 μL ali, מקורר בבקבוקונים 1.5 mL ומיד להקפיא אותם עם חנקן נוזלי. חנות at-80 ° c לשימוש נוסף.
התראה: DTT מסווגת כגירוי ומזיקים, ולכן יש לטפל בהם בזהירות.
2. הכנת שומנים בתמיסה הנפט
- התמוססות POPC וכולסטרול ב כלורופורם (זהירות) בנפרד, כל אחד לריכוז סופי של 100 mg/mL. . מערבולת כל בקבוק בנפרד
- לשלב את הרכיבים בבקבוקון זכוכית 2mL: להוסיף 50 μL של POPC ב כלורופורם, 50 μL של כולסטרול ב כלורופורם ו 500 μL של שמן מינרלי. עבור 100 μL של תאים סינתטיים, 2 מבחנות של שומנים בשמן נדרשים.
- ומערבולת, ואז החום בערך 1 h ב 80 ° c במכסה כימי כדי לאדות את הכלורופורם. ודא כי התאיידות מלאה אירעה על-ידי ביצוע הזמן/תנאים שצוינו וניטור נפח הפתרון.
הערה: ניתן לאחסן את פתרון השומנים בשמן בטמפרטורת החדר לשבועיים. לקבלת תוצאות משופרות, מומלץ להשתמש בהכנה טרייה לפני כל ניסוי. יחסי השומנים והכולסטרול ניתן לשנות על פי הרכב הממברנה הרצוי. ריכוז גבוה של כולסטרול יכול להוביל להיווצרות אגרגטים בתמיסה הסופית של התא הסינתטי.
התראה: הכלורופורם מסווג כגירוי ומזיק, ולכן יש לטפל בהם בזהירות ובאזורים עם הפקת מנדפים.
3. ההכנות של פתרונות חיצוניים, טרום פנימיות והאכלה
- הכנת פתרונות מניות
- הכן את פתרונות המניה המפורטים בטבלה 2 תוך שימוש במים באולטרטהורים (upw).
הערה: יש להכין פתרונות מניות מראש ולאחסן ב-20 ° c עד שימוש נוסף. מגיב 7 נוטה ליצור אגרגטים. החימום עד 37 ° c יקטין את הצבירה. צבירה קלה לא תשפיע על התגובה באופן משמעותי. מגיב 8 הפתרון הוא חלבי ו turbid.
- הכן את פתרונות המניה המפורטים בטבלה 2 תוך שימוש במים באולטרטהורים (upw).
- תמיסה חיצונית
- התמוססות גלוקוז ב-DNase/RNase-H חינם2O לריכוז הסופי של 200 מ"מ.
- עבור 100 μL של הפתרון הפנימי, להכין 1.6 mL של הפתרון החיצוני.
- פתרון טרום-פנימי
- הוסף ריאגנטים 1-14 על פי הסכומים והריכוז המפורטים בטבלה 2. לדוגמה, עבור נפח תא סינתטי סופי של 100 μL, הכינו 100 μL של הפתרון הפנימי.
הערה: יש להוסיף את UPW כדי להשלים את אמצעי האחסון הנדרש הסופי. בשלב זה ניתן לאחסן את התערובת ב -4 ° c למשך מספר שעות.
- הוסף ריאגנטים 1-14 על פי הסכומים והריכוז המפורטים בטבלה 2. לדוגמה, עבור נפח תא סינתטי סופי של 100 μL, הכינו 100 μL של הפתרון הפנימי.
- תמיסת הזנה
- מוסיפים את כל הריאגנטים בהתאם לכמויות והריכוז המפורטים בטבלה 3.
הערה: השתמש 1:1 יחס של פתרון האכלה: הפתרון הפנימי. עבור נפח תא סינתטי הסופי של 100 μL, להכין 100 μL של פתרון האכלה. מומלץ להכין נפח עודף קטן של פתרון חיצוני, פנימי והזנה.
- מוסיפים את כל הריאגנטים בהתאם לכמויות והריכוז המפורטים בטבלה 3.
4. הכנת תאים סינטטיים
הערה: אמצעי האחסון הבאים מותאמים להכנה של 100 μL של תאים סינתטיים.
- תאים סינתטיים המייצרים חלבון
- בצינור 15 מ ל, מקום 12 מ ל של הפתרון החיצוני, לאט להוסיף, על גבי שכבה, של 500 μL של שומנים בפתרון הנפט. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות.
- כדי להשלים את הפתרון הפנימי הכנה: לערבב את מרכיבי הפתרון הפנימי על קרח כתוש לנפח הסופי של 100 μL על ידי הS30 והוסיף-T7 Lysate (מגיב 15) ו-DNA פלמיד (מגיב 16) לתערובת המאוחסנת.
- לשני 2 mL בקבוקון זכוכית עם 500 μL של שומנים בפתרון הנפט, להוסיף 100 μL של הפתרון הפנימי. הפיפטה עולה ויורדת במרץ לדקה ומערבולת לדקה נוספת בקומה חמש.
- דגירה עבור 10 דקות על קרח כתוש ולאחר מכן להוסיף לאט אמולסיה התוצאה על גבי שלב הנפט בצינור 15 מ"ל (מ 4.1.1).
- צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 100 x ו 4 ° צ' ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 400 x g ו 4 ° c. עד סוף הצנטריפוגה, יש לצפות בגלולה בתחתית הצינור.
הערה: שימוש ברוטור צנטריפוגה מנופף בדלי הוא מועדף כאן לרכישת כיסוי טוב יותר של שכבה שנייה של שומנים במהלך מעבר של טיפות מים בשמן ' דרך השלב הפנימי. במקרה שאין שום גלולה הנצפה, מהירות צנטריפוגה יכול להיות מוגבר 1000 x g. אחרת, עיין בסעיף ' דיון ' המתייחס לחומרת החומרה הספציפית של הפתרון החיצוני. - . להוציא את הגלולה
- הסר שכבת שמן עודפת.
- השתמש עצה פיפטה גזוז טעון עם כ 400 μL של הפתרון החיצוני כדי לחלץ את הגלולה. שחררו את הפתרון החיצוני תוך כדי העברת דרך שלב הנפט כדי לאסוף רק את הגלולה בשלב מימית.
- נגב את הטיפ לאחר החילוץ של הגלולה כדי למנוע העברת שאריות נפט ולהעביר את הגלולה לצינור נקי 1.5 mL.
- צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 1,000 x ו 4 ° c, להסיר את supernatant ו להשעות מחדש את הגלולה ב 100 μl של האכלה פתרון (1:1 היחס של הפנימי: פתרונות האכלה).
הערה: ניתן להשתמש גם ברוטור צנטריפוגה בזווית קבועה. - עבור ביטוי חלבון, הדגירה 2 שעות ב 37 ° צ' מבלי לרעוד.
הערה: זמן דגירה אופטימלי משתנה בין חלבונים שונים. - הערכת כמות החלבון המופקת באמצעות שיטה מתאימה בהתאם למאפייני החלבון המיועד.
- קבוצות שליטה מומלצות
- הפתרון הפנימי ואישור פעילות ליפוסט
- הכינו פתרון פנימי מלא (עם דנ א & S30-T7 lysate).
- מיד מודבבת את התגובה לעיל באמצעות החממה הרצפה שייקר ב 250 סל ד או thermomixer ב 1200 rpm, בטמפרטורה קבועה של 37 ° צ' עבור 2 h.
הערה: כוונן את זמן הדגירה כדי להתאים את זמן הדגירה של תאים סינתטיים.
- תאים סינטטיים
- קבוצת שליטה שלילית: הכן את הפרוטוקול המוצג ב-4.1 עם הפתרון הפנימי ללא דנ א.
- שליטה חיובית: הכן את הפרוטוקול המוצג ב-4.1 עם הפתרון הפנימי המכיל קידוד T7-ביניים עבור גן עיתונאי.
הערה: הוסף קבוצת בקרה חיובית המורכבת מגנים של כתבת, כגון sfGFP, לצד קבוצות הבדיקה כדי להבטיח את שלב היעילות של האנקפסולציה.
- הפתרון הפנימי ואישור פעילות ליפוסט
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים סינתטיים על-ידי encapsulating S30-T7 CFPS מערכת מבוסס על BL21 E. coli בתוך שלפוחית השומנים. תיאור סכמטי של תהליך ההכנה הכולל תמונה של כל שלב מוצג באיור 2. הצלחת תהליך ההכנה של התא הסינתטי תלויה בביצועים המתאימים של כל שלב ומושפע מפרמטרים שונים. הפרוטוקול צריך להיות מותאם כדי להתאים את הייצור של חלבון מסוים.
פלמידים ביטוי חלבון מודל סופר תיקיית החלבון פלורסנט ירוק (sfGFP) ו Renilla לluciferase תחת T7 יזם הוכנסו לתוך התגובות בצובר cfps ותאים סינתטיים, וייצור החלבון הוערך באמצעות שיטות שונות, כולל כתם מערבי, זרימה cy, מיקרוסקופ ו ספקטרוסקופיה (איור 3). אימות של sfGFP-שלו6 חלבון מתויג (~ 27 kda32) הפקה על ידי ניתוח כתמי אבן מערבית מוצג באיור 3a. מדגם של 30 μL של תאים סינתטיים מדולל 6 קפלי היה מעורבב עם 10 μL של מאגר משותף SDS-PAGE לדוגמה (המכיל את הדטרגנטים נתרן dodecyl סולפט (SDS) ו β-mercaptoethanol) ו מבושלים 10 דקות (95 oC). גילינו ששילוב החום והדטרגנטים במאגר המדגם מספיק כדי לפרק את השלפוחיות ולאפשר את הפעלת החלבונים ב-SDS-PAGE ג'ל. גילוי חלבון בוצע באמצעות אנטי שבטיים הראשי נוגדן (מדולל 1:12000). כצפוי, בעוד ייצור החלבון מזוהה דגימות המכילות את הקידוד sfGFP-DNA תבניות ("+ sfGFP DNA"), חלבון לא נצפתה דגימות שליטה שלילית שבה תבנית ה-DNA נשלל ("-DNA"). דוגמאות של מטוהרים sfGFP ומטוהרים sfGFP שעברו בתוך קרום של תאים סינתטיים (' sfGFP (כדורים)), משמשים כפקדים חיוביים עבור הייצור הגורפת של sfGFP CFPS ועבור הסינתזה שלה בתוך תאים סינתטיים, מכבד. ניתן להחיל שיטה זו על סוגי חלבון שונים. לדברי קרינסקי ואח '19, תפוקת הייצור sfGFP שהתקבל תחת הפרוטוקול המפורט הוא 380 μg/ml בפתרון cfps ו 5.3 μg/ml, כאשר הפתרון cfps הוא כופר בתוך שלפוחיות השומנים.
כאשר החלבון המיוצר בתוך התאים הסינתטיים הוא פלורסנט, הייצור שלה ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ וזרימה שיטות מבוססות cy,. ניתחנו את התאים הסינתטיים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט עם מסנן עבור זריחה GFP (איור 3B). כיוון שלרכיבי CFPS יש פלורסנט אוטומטית, יש להתאים את הפרמטרים של רכישת התמונה בהתאם לדגימת שליטה מתאימה (תאים סינתטיים ללא תבנית DNA, לדוגמה).
בנוסף, השתמשנו cy, השמש הזרימה לקבוע את עוצמת הזריחה מתכוון של התאים הסינתטיים המייצרים sfGFP, ואת האחוז של תאים סינתטיים פעיל, אשר יכול לייצר חלבונים בתוכם (איור 3C I & II). 10,000 אירועים נאספו עבור כל מדגם שנותח. ייצור התא הסינתטי, המתואר בפרוטוקול זה, מניב בדרך כלל אוכלוסייה פעילה של 21-25% בתוך פתרון עם ריכוז של 10שבעה תאים סינתטיים/mL. האינטנסיביות הקלה של הזריחה המוצגת על ידי "-DNA" דגימות באיור 3C II היא בשל האור האוטומטי של רכיבים שונים ב-cfps התגובה כגון S30 lysate.
ניתוח גודל מייצג בהתבסס על האות gfp (בקוטר) של תאים סינתטיים שהוכנו על ידי השיטה המתוארת לעיל מראה ערך ממוצע של 2.4 ± 0.5 יקרומטר (איור 3ד II). כמו היווצרות מים תחליב שמן בשיטה זו היא תוצאה של החלת כוחות מכניים, התפלגות גודל של חלקיקים עשוי להיות מושפע מגורמים שונים, כגון שיטה ומהירות של ליטוף אמולסיה למעלה-ולמטה, המודל של מכונת מערבל מערבולת, וכו '.
כדי לבדוק את צדדיות של ייצור החלבון של תאים סינתטיים, הביטוי של חלבון הכתב Renilla לוציפראז בתוך תאים סינתטיים נותחו (איור 3e). הדרך שבה מדידת האור הופק מהתגובה האנזימטית של לוציפראז והמצע שלה, h-קומרכאזין. כדי לזרז את התגובה האנזימטית, התווספה הריכוז הסופי של 1 μM של h-קומרכאזין לתאים הסינתטיים (25 מדגם μL לדוגמה) ממש לפני המדידה. "-DNA" לדוגמה, לא המכיל את תבנית ה-DNA לוציפראז קידוד שימש שליטה שלילית עבור בדיקת הומינסנציה עקב חמצון לא אנזימטי של המצע. לומינסנציה נמדדה באמצעות קורא צלחות.
איור 1: איור של התהליך לקבלת פרוטוקול הכנה טיפוסי לתאים סינתטיים. התהליך מחולק לשני צעדים. שלב 1: ההכנות טרום הניסוי כולל טיהור DNA הניקוי, S30-T7 lysate הכנה, פתרונות מניות הכנה הנדרש עבור פתרונות פנימיים והאכלה, שומנים-in-oil הכנה הפתרון והכנה הפתרון החיצוני. שלב 2: היווצרות תאים סינתטיים הכולל הכנה להזנה ופתרונות פנימיים, הכנה וניתוח של תאים סינתטיים. דוגמה לאמצעי האחסון הנדרש של כל מרכיב להכנת 100 μL של פתרון תאים סינתטיים מוצג בכחול בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: איור סכימטי של פרוטוקול הכנת התא הסינתטי. תמונה של תהליך שבוצעה היטב ממחישה כל שלב של הפרוטוקול. דמות זו השתנתה מקרינסקי ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות הנציג של הייצור של sfgfp ו renilla ללוציפראז בתוך תאים סינתטיים. (א) ניתוח כתמי מערבי של ייצור sfgfp-His6 בשתי התגובות בצובר cfps ו תאים סינתטיים בתוך. זיהוי חלבונים בוצע באמצעות אנטי-שבטיים העיקרי נוגדן (מדולל 1:12000). מטוהרים sfGFP-His6 שימש שליטה חיובית (7.8 μg). sfGFP (כימוס) הוא שליטה חיובית של sfGFP מטוהרים המכומד בתאים סינתטיים. דגימות ללא תבניות DNA שימשו כפקד שלילי עבור ניתוח הייצור ("-DNA"). (ב) תמונות מייצגות של sfGFP להפקת תאים סינתטיים נלקח באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט עם שדה בהיר מסנן gfp. סולם ברים = 50 μm. (ג) אני & השנייה זרימה cy, לנסות ניתוח של sfGFP הפקת פעילות תאים סינתטיים (נתונים שנאספו באמצעות דיגיטלי, 4-לייזר מנתח). דגימות נמדדו לאחר 3 שעות של דגירה. 10,000 אירועים נאספו עבור כל מדגם שנותח. מסנני FSC (500 V) ו-אס. אס (300 V) שימשו להגדרת אוכלוסיית התאים הסינתטית הכוללת. לאחר מכן, מסנן FITC (600 V) שימש לזיהוי זריחה GFP... (I) החישוב של אוכלוסיית התא הסינתטי הפעיל [%] היה מבוסס על הסף של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של GFP, המוגדר על-ידי דגימת "-DNA" (היסטוגרמה אדומה), המאפשרת שגיאה של ~ 1%. (II) משמעות העוצמה הפלואורסצנטית של sfGFP הפקת תאים סינתטיים. ערך זה חושב מאוכלוסיית התאים הסינתטיים הפעילה ומנורמל למדגם "-DNA" על-ידי חלוקת הקרינה הפלואורסצנטית הממוצע של התאים הסינתטיים הפעילים על ידי הממוצע של תאים סינתטיים ללא sfGFP-DNA. (ד) אני & בדיקת גודל התא הסינתטי השני. ספקטרום הפליטה זוהה על ידי 505-560 ננומטר ו 642-745 ננומטר עבור GFP ואותות שדה בהיר, בהתאמה. (I) דמות ייצוגית של התאים הסינטטיים שנותחו. (II) התפלגות הגודל של תאים סינתטיים. הניתוח בוצע וההפצות של התאים הסינתטיים הפעילים חושבו בהתבסס על האות GFP. (ה) הפקה של מפעיל renilla לוציפראז בתוך תאים סינתטיים. פעילות לוציפראז היתה בכמת עם מדידות לומינסנציה לאחר תוספת של 1 μM h-קומרכאזין באמצעות קורא צלחת מוצג כעוצמת אור [RLU] x 106. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| טבלה 1: הכנת פתרונות מאגר ומניות. | |
| ערות | |
| לוריא ברטני (ליברות) אגר (1.5%) צלחת | . היכון וחטא הוסף אמפיצילין בריכוז סופי של 50 μg/mL רק לאחר קירור לטמפרטורת החדר. |
| 10 גר'/ל' באקול-טריפטון | |
| 10 גר'/L נתרן כלוריד (הנאגל) | |
| מחלץ 5 g/L Bacto-שמרים | |
| 15 g/L ' אגר אגר מטוהר | |
| 50 μg/mL אמפיצילין | |
| LB מדיה (20 mL): | . מדיה מינימלית . היכון וחטא מראש רק לפני האמפיצילין החיידקים, להוסיף בריכוז הסופי של 50 μg/mL. |
| 10 גר'/ל' באקול-טריפטון | |
| 10 גר'/L נתרן כלוריד (הנאגל) | |
| מחלץ 5 g/L Bacto-שמרים | |
| 50 μg/mL אמפיצילין | |
| מדיה של ציר מצוין (TB) (1 ל): | . מדיה עשירה . היכון וחטא מראש רק לפני האמפיצילין החיידקים, להוסיף בריכוז הסופי של 50 μg/mL. |
| 12 ג/ל באקול-טריפטון | |
| מחלץ 3 g/L באקאל-שמרים | |
| 4% (v/v) גליצרול הידרונול | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | |
| 50 μg/mL אמפיצילין | |
| S30 ליפוסט מאגר (1.5 L): | להכין ולחטא מראש (* ללא DTT ו 2-mercaptoethanol). חנות ב-4 ° c. |
| 10 מילימטר טריס-אצטט ב-pH = 7.4 | . בסיס טריסמה להכין ולהתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות חומצה אצטית. |
| 14 ממ אצטט מגנזיום | |
| 60 מילימטר אשלגן אצטט | |
| * 1 מ"מ DTT | הוסף רק לפני השימוש |
| * 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | הוסף רק לפני השימוש |
| 1 M הפסי-קו (pH = 8): | מפזר HEPES לריכוז הסופי של 1 M. התאמה ל-pH 8 באמצעות פתרון KOH. |
| מיכל ביטון | |
| אשלגן הידרוקסיד (KOH) | |
| שולחן 2: הרכב הפתרון הפנימי. | ||||||||||
| הדרישה הסופית של הפתרון הפנימי | ||||||||||
| ספר | ריאגנט | . מלאי מניות | . הדבר האחרון | 25 μL | 50 מיקרומטר | 100 מיקרומטר | 200 מיקרומטר | 300 מיקרומטר | 400 μ אני | |
| 1 | הכלב KOH pH = 8 | 1 מדיום | 55 ממ ' | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | פתרון טרום-פנימי |
| 2 | אצטט מגנזיום | 1 מדיום | 14 ממ ' | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | אשלגן אצטט | 1 מדיום | 50 ממ ' | 1.25 | 2.5 | מיכל 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | אמוניום אצטט | 5.2 מ ' | 155 ממ ' | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| מיכל 5 | . פג 6000 | 50% | 3 | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0.5 מ ' | 40 ממ ' | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | חומצות אמינו-תערובת אני | 50 מ ' | 2.5 ממ ' | 1.25 | 2.5 | מיכל 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | חומצות אמינו-תערובת II | 50 מ ' | 2.5 ממ ' | 1.25 | 2.5 | מיכל 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | ATP | 100 ממ ' | 1.2 ממ ' | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | GTP | 50 ממ ' | 1 ממ ' | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | UTP | 100 ממ ' | 0.8 ממ ' | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | מיכל ה, מרכזיה | 100 ממ ' | 1 ממ ' | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | סוכרוז | 2 מטרים בלבד | 200 ממ ' | 2.5 | מיכל 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 * * | H2O אופב | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 ליפוסט | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 | פלסמיד דנ א | 10 μg/mL | * | * | * | * | * | * | ||
| שולחן 3: האכלה הרכב פתרון. | |||||||||
| נפח פתרון ההזנה המבוקש הסופי | |||||||||
| ספר | ריאגנט | conc מניות. | הסופי. | 25 μL | 50 מיקרומטר | 100 מיקרומטר | 200 מיקרומטר | 300 מיקרומטר | 400 מיקרומטר |
| 1 | הכלב KOH pH = 8 | 1 מדיום | 83.3 ממ ' | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | אצטט מגנזיום | 1 מדיום | 21.2 ממ ' | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | אשלגן אצטט | 1 מדיום | 75.5 ממ ' | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | אמוניום אצטט | 5.2 מ ' | 236.4 ממ ' | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| מיכל 5 | פג-6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0.5 מ ' | 60.1 ממ ' | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | חומצות אמינו-תערובת אני | 50 ממ ' | 3.8 ממ ' | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | חומצות אמינו-תערובת II | 50 ממ ' | 3.8 ממ ' | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | ATP | 100 ממ ' | 1.8 ממ ' | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | GTP | 50 ממ ' | 1.5 ממ ' | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | UTP | 100 ממ ' | 1.2 ממ ' | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | מיכל ה, מרכזיה | 100 ממ ' | 1.5 ממ ' | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | גלוקוז | 2 מטרים בלבד | 200 ממ ' | 2.5 | מיכל 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O אופב | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| שולחן 4: פתרונות דרושים להכנה לתאים סינתטיים. | |
| חומרים & הדרושים | ערות |
| שומנים בשמן | החנות בטמפרטורת החדר עד השימוש. מוכן לפי סעיף 2 |
| תמיסה חיצונית | מוכן לפי סעיף 3.1 |
| פתרון פנימי | . מוכן לפי סעיף 3.2 |
| הכנת בדיקות + שולטת דגימות לפי סעיף 4.1. | |
| לשמור על קרח כתוש עד השימוש. | |
| תמיסת הזנה | . מוכן לפי סעיף 3.3 |
| לשמור על קרח כתוש עד השימוש. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ובמחיר נוח לייצור כמויות גדולות של תאים סינתטיים המייצרים חלבונים. התשואה של תאים פעילים תלויה בביצוע קפדני ומדויק של הפרוטוקול עם דגש על מספר שלבים קריטיים. בסעיף ההכנה ליפוסט של שיטה זו, חיוני להגיע לצפיפות החיידקים המתאימה לפני הפירוק התאים כדי להשיג כמות מספקת של חלבונים בתוך הליפוסט החיידקי. שנית, תהליך הפירוק יש לבצע ב 4 ° c ו ליפוסט קפוא במהירות עם חנקן נוזלי לשמור על פעילות החלבון. יתר על כן, בפרוטוקול זה השתמשנו E. coli BL21 (DE3) תאים שהפכו עם pAR1219 פלמיד המבטא T7 RNA פולימראז. במקרים בהם זן שונה של חיידקים משמש, שינויים בריכוז הליפוסט עשוי להידרש להגיע כמות מספקת של RNA פולימראז ו ריבוזומים. גם כאשר באותו זן חיידקי משמש, הפקות lysate שונים יכול להיות כמה ההבדלים אצווה-to-אצווה.
סעיף הייצור שלפוחית לפוחית כולל גם כמה צעדים משמעותיים. מסיסות של שומנים והסרת כלורופורם מן השמן המינרלים חשוב להקמת תחליב מים בשמן. צנטריפוגה של מים בשמן טיפות לתוך מאגר מימית החיצוני הוא גם צעד מפתח בפרוטוקול לייצר תאים סינתטיים עם bilayer השומנים. שינויים בפתרון הפנימי של השלפוחיות והרכב השומנים עשוי להוביל לשכבת טיפות בשלב המים השמן ללא כל כדור הנצפה. כדי להתגבר על זה, פתרון מהיר הוא להגדיל את מהירות צנטריפוגה כדי 1,000 x g בשלב העברת אמולסיה. במקרה זה לא לפתור את הבעיה, את הכבידה הספציפית של הפתרון החיצוני מימית יכול להיות שונה להבטיח כי הפתרון הפנימי יהיה כבידה ספציפית יותר מאשר הפתרון החיצוני. יתר על כן, האוסמאליות של הפתרון הפנימי עשוי להשתנות גם בין מקורות lysate הפקות שונות, החל בין 800-1100 mOsm/ק"ג. השונות באוסמאליות של הפתרון הפנימי היא בעיקר בשל ריכוזי שינוי הליפוסט במהלך תהליך הייצור. בדרך כלל זה לא מוביל לשינויים משמעותיים בייצור החלבון, אך דילול גדול עשוי לגרום לתשואה מופחתת עקב ריכוזים נמוכים של התמצית ואנזימים תרגום בבית הליפוסט עצמו. מדידת ריכוז החלבון הכולל בכל אצווה ליפוסט יכול לסייע בריכוזי כוונון ליפוסט בפתרון הפנימי כדי לשמור על ערכים קבועים (כ -22 מ"ג/mL נמדד על ידי שיטת ברדפורד).
עם זאת, לשיטה זו יש מספר מגבלות שיש לציין. לא כל התאים הסינתטיים שנוצר פעילים ומסוגלים לייצר חלבונים עקב כימוס שלם של כל הרכיבים הנדרשים. מדדנו כ 21-25% של תאים פעילים בעת הפקת sfGFP המבטא תאים סינתטיים באמצעות הזרימה cy, הבדלים (אין הבדלי גודל משמעותיים נצפו בין תאים פעילים ולא פעילים). שמן השומנים עודף שאריות לעתים להישאר הממברנה השומנים bilayer לאחר העברת התאים הסינתטיים לשלב מימית. אופטימיזציה של ריכוזי השומנים והכולסטרול בשלב הנפט יכול לשפר את הבעיה. חשוב גם לציין כי התפלגות הגודל של התאים הסינתטיים המתקבל הוא רחב למדי בהשוואה לשיטות מיקרופלואידיטיות חלופיות, עם שלפוחיות הנעות בין כ-1-50 μm.
התשואה הגבוהה של שיטת העברת אמולסיה הופכת אותו למתאים במיוחד לתאים סינתטיים encapsulating מערכות סינתזה של חלבונים בתאי החלבון לייצור חלבון תרפויטי. וריאציות שונות של שיטת העברת אמולסיה שימשו ללימודי תא סינתטי וכללה שינויים בהליך הכנת שמן, הרכב ממברנה, לדוגמה נפח, הפתרון הפנימי ליחס הנפט מהירויות צנטריפוגה5,24,28. מיקרופלואידיג ו-מבוססי פולימר מבוסס droplet שיטות ייצוב גם שימשו הכנה לתא סינתטי, עם זאת, כימוס של מערכת cfps כולה לא בוצעה עדיין עם שיטות אלה21,22,23.
התאים הסינתטיים המתקבלים על ידי שיטה זו הוצגו בvivo כדי לייצר חלבונים ולטפל בסרטן במודלים murine19. היכולות של תאים אלה ניתן להרחיב בעתיד מעבר לביטוי החלבון. שילוב של תהליכים סלולריים אחרים כגון תקשורת סלולרית, שינוי שלד ציטותא וחלוקת תאים בתאים סינתטיים תוארו לאחרונה33,34,35,36. החלפת ליפוסט חיידקי עם ליפוסט התאים איקריוטית יאפשר ביטוי של חלבונים עם מורכבות גבוהה ושינויים פוסט-טרנסליסטיים, ואולי יהיה פחות חיסוני גם ללא הליך ניקוי, ולכן פתיחת גבולות טיפולית יותר37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי ERC-STG-2015-680242.
המחברים גם מכירים בתמיכת מרכז הסרטן המשולב של הטכניון (TICC); מכון ראסל ברי לננוטכנולוגיה; המרכז הבינתחומי הראשי למדעי החיים & הנדסה; משרד הכלכלה הישראלי למענק כמאנה (52752); משרד המדע של הטכנולוגיה והחלל – משרד המדען הראשי (3-11878); הקרן הישראלית למדע (1778/13, 1421/17); האגודה הישראלית לסרטן (2015-0116); הקרן הגרמנית-ישראלית למחקר ופיתוח מדעי לגרנט הצעיר GIF (I-2328-1139.10/2012); האיחוד האירופי FP-7 IRG תוכנית עבור מענק אינטגרציה לקריירה (908049); מרכז המחקר פוספוליפיד מענק; קרן רוזנבלט לחקר הסרטן, מלגת קרן משפחת מאלון; וקרן משפחת אונגר. א. שרדר מכיר במלגות אלון וטאוב. א. אדיר מכיר במלגות שרמן וגוטוויה. ז. חן מכיר במלגת שרמן. נ. קרינסקי מכיר בתוכנית הדוקטורט לנשים ברונית אריאן דה רוטשילד מקרן רוטשילד בקיסריה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W.
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C.
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H.
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
